Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Resumen

Esta comunicación se presentan datos sobre la precisión y la reproducibilidad de los BioSpec nano-Espectrofotómetro UV-VIS de ADN de doble cadena y cuantificación de proteínas. Incluso con ultra-pequeños volúmenes (1 a 2 L), la reproducibilidad es excelente, mientras que la función de limpieza automática mejora el rendimiento y los resultados en un mínimo de arrastre para obtener resultados más precisos.

Resumen

Nucleicos procedimientos de cuantificación de ácido han avanzado significativamente en las últimas tres décadas. Cada vez más, los biólogos moleculares requieren constante de volumen pequeño análisis de las muestras de ácidos nucleicos para sus experimentos. El BioSpec-nano ofrece una posible solución a los problemas de la inexacta, no reproducibles, inherentes a los actuales métodos de cuantificación de ADN, a través de ópticas especializadas y un detector PDA sensibles. El BioSpec-nano también tiene funcionalidades automatizadas de tal manera que el montaje, la medición, y la limpieza son realizadas por el instrumento, eliminando así la colocación repetitiva, tediosa, e inconsistente de los elementos de fibra óptica y la limpieza manual.

En este estudio, los datos se presentan en la cuantificación de ADN y proteínas, así como sobre la reproducibilidad y precisión. Contacto automático de muestras y análisis rápido permite la medición en tres segundos, lo que resulta en un rendimiento excelente. El análisis de datos se realiza mediante las características integradas en el software. La fórmula utilizada para calcular la concentración de ADN es la siguiente:

Concentración de la muestra = DF · (DO260-OD320) · FNCA (1)

Donde DF = factor de dilución de la muestra y la FNCA = factor de concentración de ácidos nucleicos.

El factor de concentración de ácido nucleico se establece de conformidad con el analito seleccionado ^1.

Resultados de concentración de proteínas se puede expresar como mg / mL o como moles / L mediante la introducción de e280 y los valores de peso molecular, respectivamente. Cuando los valores de residuos de Tyr, Trp y cisteína (SS de bonos) son introducidos en la pestaña e280Calc, los valores de coeficiente de extinción se calculan como e280 = 5500 x (residuos de Trp) + 1490 x (residuos de Tyr) + 125 x (cisteína SS de bonos) . El valor e280 es utilizado por el software para el cálculo de la concentración.

Además de la determinación de la concentración de los ácidos nucleicos y proteínas, la BioSpec-nano puede ser utilizado como un ultra-micro volumen espectrofotómetro para muchos otros analitos, o como un espectrofotómetro estándar con 5 células de paso de luz mm.

Protocolo

1. Procedimiento para la cuantificación de ADN

1. Encienda el instrumento.
2. Abra el software BioSpec-nano desde el escritorio del PC.
3. Haga clic en el simple de ácido nucleico-DNA de doble cadena pestaña (Figura 1).
4. El software se establecerá comunicación con el instrumento y ejecutar una secuencia de inicialización. Esto verifica que el instrumento está funcionando de acuerdo a las especificaciones.
5. Seleccione 0,7 o 0,2 mm en el control deslizante de paso de luz. Esto selecciona el paso de luz y todos los cálculos se basan en el paso de luz seleccionado.
6. Siguiente en BioSpec-nano clic software de configuración-Autowiping configuración. Seleccione 1 ó 2.
7. Pipetear 2 l (de 0,7 mm) H ₂ O o tampón en el pedestal.
8. Haga clic en blanco o F6 para la medición en blanco. Cada vez que un nuevo paso de luz se ha seleccionado es necesaria la creación de un espacio en blanco.
9. Pipetear 2 l de la muestra en el pedestal.
10. Haga clic en Inicio en el software o presionar el botón de inicio en el instrumento. La ventana superior se mueve para hacer contacto con la gota de la muestra. Flashes de xenón pueden ser observadas.
11. Repita la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad.
12. Todos los datos registrados se guardan como archivos. Yema.
13. Para guardar en formato pdf. O. Csv, haga clic en Guardar PDF / csv o F9. Los resultados también se pueden guardar como un archivo. Csv con la selección apropiada en la ficha Guardar.

2. Protocolo para la cuantificación de proteínas

1. Seleccione la pestaña de proteínas cuantificación (Figura 2).
2. Introduzca el e280 coeficiente de extinción, si se conoce.
3. Si e280 no se sabe calcular utilizando e280Calc.
4. Seleccione 0,7 o 0,2 mm en el control deslizante de paso de luz.
5. Haga clic en Configuración-Autowiping configuración. Seleccione 2 o superior.
6. Pipetear 3 l (de 0,2 mm) H ₂ O o tampón en el pedestal.
7. Haga clic en blanco o F6 para la medición en blanco.
8. Pipetear 3 L de muestra de la proteína en el pedestal.
9. Haga clic en Inicio en el software o presionar el botón de inicio en el instrumento.
10. Repita la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad.
11. Todos los datos registrados se guardan como archivos. Bud
12. Para guardar en formato pdf. O. Csv, haga clic en Guardar PDF / csv o F9.

3. Los resultados representativos:

1. Resultados para la cuantificación de ADN

La Figura 3 muestra los datos de las mediciones en una muestra típica de ADN de doble cadena. La concentración y la OD 260/280 coeficiente calculado también se muestran. Figura 4 contiene los resultados de reproducibilidad de los ensayos para la cuantificación de ADN. Los datos de las Figuras 3 y 4 muestra los resultados son altamente reproducibles como se desprende de la baja desviación estándar relativa de 0,26%.

Nota 1:

Inexactitud en la cuantificación de ADN pueden derivarse de la presencia de componentes de amortiguación que puede absorber en la región UV. También es necesario utilizar una solución de muestra homogénea. Como la cantidad de muestra que se está pipeta sólo 1.2 l pipeteado, cuidado de los volúmenes exactos sin la introducción de burbujas es necesario.

2. Los resultados de cuantificación de proteínas

La Figura 5 representa el análisis de concentración de proteínas de BSA. La concentración de proteína mg / ml se basa en el valor e280. La Figura 6 muestra el análisis de la reproducibilidad. Es evidente a partir de la desviación estándar relativa del 0,51% que el BioSpec-nano mide la concentración de precisión - no sólo para el ADN, sino también para las proteínas.

Nota 2: Factores que afectan la concentración de proteínas

Determinación de la concentración exacta de la proteína es factible cuando hay efectos mínimos de la inestabilidad causada por el pH, tampones, la temperatura, ni aditivos. La mayoría de la proteína purificada pasa por varios pasos de procesamiento, por lo que es posible que la proteína puede contener tensioactivos u otros aditivos que pueden interferir con la formación de gotas. Para estas muestras, con el paso de luz de 5 mm celda de cuarzo es muy recomendable.

Figura 1. Analito ventana de selección para la cuantificación de ADN de doble cadena

Figura 2. Analito ventana de selección para la cuantificación de proteína marcada no

Figura 3. Datos representativos para la cuantificación de ADN

Figura 4. Datos de reproducibilidad para la cuantificación de ADN

Figura 5. Los datos representativos para la cuantificación de proteínas

Figura 6. Reproducibilidad de los datos de cuantificación de proteínas

Discusión

El BioSpec-nano ha sido diseñado para resolver los problemas actuales inherentes a los métodos de cuantificación de ADN, tales como inconsistencias en los resultados y el trabajo manual tedioso. Cada medida tiene tan sólo 3 segundos, lo que permite un biólogo molecular con experiencia para analizar varias muestras de 3-6 en un minuto. La función del limpiador único no sólo mejora el rendimiento de la medición, sino que también elimina la necesidad de limpieza manual de los soportes, lo que resulta insignificante en el remanente entre las mediciones. Además, las pruebas con tan solo 2 toallitas para muestras de ADN que contiene 1000 ng / mL, indicó arrastre a menos de 2 ng / mL.

La disponibilidad de una celda de 5 mm de paso de luz proporciona una opción para analizar los ácidos nucleicos y diluir las muestras de proteínas y se extiende el uso de este instrumento para otras aplicaciones.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpec-nano	Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich