Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Resumen

Resolución óptica de microscopía fotoacústica (O-PAM) es una tecnología emergente capaz de absorción de imágenes ópticas contrastes In vivo Con resolución celular y la sensibilidad. Aquí, le ofrecemos una instrucción visualiza en los protocolos experimentales de O-PAM, incluyendo la alineación del sistema de configuración del sistema, típico In vivo Procedimientos experimentales y los sistemas de neuroimagen funcional.

Resumen

Microscopía óptica, proporcionando valiosa información a nivel celular y orgánulos, ha sido ampliamente reconocida como una tecnología biomédica. Como los pilares de la in vivo de tres dimensiones (3-D) microscopía óptica, microscopía de fluorescencia single-/multi-photon y tomografía de coherencia óptica (OCT) han demostrado su sensibilidad a los contrastes extraordinaria dispersión de la fluorescencia y la óptica, respectivamente. Sin embargo, el contraste de absorción óptica de tejidos biológicos, que codifica la información esencial fisiológico / patológico, aún no ha sido evaluables.

La aparición de photoacoustics biomédica ha conducido a una nueva rama de la microscopía óptica óptico resolución microscopía fotoacústica (O-PAM) ^1, donde se concentra la radiación óptica hasta el límite de difracción para lograr ^un celular o subcelular resolución de ² nivel lateral. Como un valioso complemento de las actuales tecnologías de microscopía óptica, O-PAM lleva en al menos dos novedades. Lo primero y más importante aún, O-PAM detecta contrastes ópticos de absorción con una extraordinaria sensibilidad (es decir, 100%). La combinación de O-PAM con microscopía de fluorescencia ³ o con óptica de dispersión basada en ⁰⁴ de octubre (o ambos), provee información integral propiedades ópticas de los tejidos biológicos. En segundo lugar, O-PAM codifica la absorción óptica en ondas acústicas, a diferencia de los procesos de pura óptica en microscopía de fluorescencia y octubre, y justifica sin detección. La detección acústica de O-PAM mitiga los efectos de la dispersión óptica en la degradación de la señal y elimina de manera natural las posibles interferencias (por ejemplo, crosstalks) entre la excitación y la detección, que es un problema común en la microscopía de fluorescencia debido a la coincidencia entre la excitación y el espectro de fluorescencia.

Única para obtener imágenes de absorción óptica, O-PAM ha demostrado amplia gama de aplicaciones biomédicas, desde su invención, incluyendo, pero no limitado a, neurología ^{5, 6,} oftalmología ^{7, 8, 9} biología vascular, dermatología y ^10. En este video, les enseñamos a la configuración del sistema y la alineación de la O-PAM, así como los procedimientos experimentales para imágenes in vivo microvascular funcional.

Protocolo

1. La configuración del sistema

1. Radiación óptica
   1. Fuente de radiación óptica: un bombeado por diodos de estado sólido, láser pulsado (INNOSLAB, Edgewave) y un láser de colorante (CBR-D, Sirah).
   2. El rayo láser de salida (ancho de pulso: 7 ns) se centra por una lente condensadora (LA1131, Thorlabs) para pasar a través de un orificio de 50 micras (P50C, Thorlabs).
   3. El orificio se coloca un poco lejos del foco de la lente condensadora para que coincida con el diámetro del agujero con el diámetro del haz de modo fundamental para la eficacia de filtrado espacial.
   4. El haz de filtrado se ve atenuado por un filtro de densidad neutra (NDC-50C-2M, Thorlabs) y luego, junto a una fibra óptica monomodo (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. La salida de la fibra llena la abertura posterior de un objetivo de microscopio (RMS4X, Thorlabs) para lograr un enfoque óptico de difracción limitada de ~ 2.6 micras, con la longitud de onda de 570 nm.
2. La detección ultrasónica
   1. Transductor de ultrasonidos: 50-MHz frecuencia central (V214-BB-RM, de Olympus NDT).
   2. El transductor ultrasónico está conectado a un combinador de fabricación casera acústico-ópticos del haz de ultrasonidos para la detección de ^11, que está alineado coaxialmente con la difracción limitada irradiación óptica.
   3. Una cavidad esférica es tierra de la parte inferior del combinador para producir una lente acústica. Esta lente acústica tiene una apertura numérica de 0,5 en agua y da un diámetro acústica focal de 43 micras, con la frecuencia de 50 MHz central.
   4. Los focos ópticos y acústicos están alineados confocally para maximizar la sensibilidad de detección.
3. Acoplamiento acústico
   1. Acoplamiento ultrasónico seco se utiliza para evitar sumergirse en el agua los animales de experimentación, que fue utilizado a principios de los sistemas de imagen fotoacústica ^12.
   2. Una ventana de imagen se abre en la parte inferior de una placa de Petri (9 cm de diámetro) y está sellado con una membrana de polietileno de ultrasonidos y ópticamente transparente.
   3. Gel de ultrasonidos (imagen clara y SonoTech) entre la membrana de polietileno y el objeto a ser fotografiado parejas de la onda generada fotoacústica del objeto a la placa de Petri, y el agua desionizada en la placa de Petri parejas más la onda a la sumergida O-PAM cabezal de exposición .
4. Electrónica
   1. La señal fotoacústica detectado por el transductor ultrasónico es amplificada por dos amplificadores en cascada (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. La señal amplificada es digitalizada por una adquisición de 14-bit de datos (DAQ) (CompuScope 14200, Gage Ciencias Aplicadas) a una velocidad de muestreo de 200 MS / s.
5. Escaneo esquema
   1. De dos dimensiones (2-D) de trama de exploración de la cabeza o-PAM imágenes a lo largo de la horizontal (xy) avión es controlado por un ordenador personal, lo que provoca tanto la tarjeta DAQ y el láser de bombeo. La señal de disparo está sincronizado con la señal de reloj de salida de la tarjeta DAQ.
   2. El eje rápido del escáner 2-D se define como la dirección de la exploración de la sección transversal (B-scan).
   3. Una secuencia de imágenes B-scan puede ser adquirido mediante la traducción de la cabeza de imágenes a lo largo del eje lento para formar una imagen volumétrica, que puede ser visto ya sea en forma directa en 3-D de representación o en una proyección máxima de 2-D amplitud (PAM) de la imagen .

2. Sistema de alineación

1. El uso de pulso-eco de ultrasonido y un reflector de ultrasonidos para determinar la posición del plano focal acústico (es decir, el tiempo de retardo de la señal de disparo al máximo pulso-eco de la señal ultrasónica). Este paso es necesario para llevar a cabo una sola vez cuando se crea el sistema de O-PAM.
2. Maximizar la eficiencia de acoplamiento de la fibra de modo único.
3. Aplique el gel de ultrasonido en la parte superior de un objeto ópticamente absorbente (por ejemplo, un trozo de cinta negro) y con cuidado colocar debajo de la ventana de imagen en la placa de Petri con agua destilada.
4. Baje la cabeza de imágenes en el agua, y eliminar las burbujas de aire atrapadas bajo la lente acústica.
5. Ajuste el cabezal de exposición hasta que la señal fotoacústica del objeto absorbente es desde el plano focal acústico, que puede ser juzgado por la demora acústica.
6. Ajustar la posición vertical (es decir, la posición z) del objetivo de microscopio para maximizar la amplitud de la señal fotoacústica generada a partir del objeto plano. La amplitud de la señal al máximo sugiere que el enfoque óptico está alineado con el enfoque acústico en la dirección vertical.
7. Ajustar la posición horizontal (es decir, posiciones, X e Y) del objetivo del microscopio hasta que la señal fotoacústica generada a partir de la meta muestra un patrón simétrico. La simetría sugiere que el enfoque óptico está alineado con el enfoque acústico en la dirección horizontal.
8. Repita los pasos 2.6 y 2.7 hasta que la señal fotoacústica se ha optimizado tanto en la simetría y la amplitud.

3. Un SA procedimiento en MPLE experimental in vivo O-PAM de oreja de ratón vasculatura

1. Este paso no es necesario para ratones desnudos. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de un cóctel [receta: 1 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,1 ml de xilazina (100 mg / ml), y 8,9 ml de solución salina, la dosis: 0,1 ml/10 g]. Afeitarse el cabello en el oído y, además, depilarse el vello residual con crema Surgi (Categoría #: 82565, American International Industries) antes de la limpieza con agua destilada. Tenga en cuenta que la depilación tan poco podría irritar la piel y el sistema vascular por lo tanto es mejor realizar 24 horas antes del experimento planeado.
2. Encienda el sistema láser fotoacústica, y compruebe la alineación del sistema.
3. Anestesiar el ratón con el 3% isoflurano vaporizado por la inhalación de gas (la tasa de flujo típica es 1,0 a 1,5 l / min, dependiendo del peso corporal del animal), y mantener la anestesia con isoflurano al 1% durante todo el experimento. Grado médico de aire se recomienda como la inhalación de gas para mantener el ratón en el estado fisiológico normal.
4. Transferir el ratón a una etapa estereotáctica, y controlar su temperatura corporal a 37 º C con una almohadilla térmica.
5. Aplanar la oreja de ratón en un plato de plástico y aplicar una capa de gel de ultrasonido en la parte superior de la oreja. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire en el interior del gel. Luego, coloque el oído en la ventana de imagen y levante lentamente la etapa de los animales hasta que los contactos gel para ultrasonidos de la parte inferior de la membrana de polietileno. De contacto blandas es necesario porque presionar la oreja contra la membrana puede afectar el flujo de sangre en el oído.
6. Abrazadera de un oxímetro de pulso en la pierna o la cola del ratón para controlar su estado fisiológico, y aplique una pomada para los ojos para evitar la sequedad y los daños accidentales de láser en los ojos del ratón.
7. Baje el cabezal de exposición hasta que la lente acústica se sumerge en agua desionizada, y eliminar las burbujas de aire atrapadas bajo la lente acústica.
8. Compruebe la fluencia del láser para asegurarse de que está dentro de los estándares de seguridad del láser de la American National Standards Institute ^13. La fluencia del láser no debe superar los 20 mJ / cm ^2, que se traduce en 80 nJ de la energía láser de pulso cuando el rayo láser se enfoca a 150 m por debajo de la superficie de la piel.
9. Ajuste el láser para el modo de disparo externo y comenzar a escanear el juicio. Ajustar la posición z de la cabeza la imagen hasta la señal más fuerte fotoacústica es desde el plano focal acústico.
10. Establecer los parámetros correctos de escaneo e iniciar la adquisición de la imagen formal.
11. Después del experimento, apague el láser, levantar la cabeza imágenes de la agua desionizada, baje la etapa animal a soltar el ratón, limpiar la oreja de ratón con agua destilada, a su vez del sistema de anestesia y el control de temperatura, y descargar el ratón desde la etapa de estereotáctica.
12. Si las imágenes repetitivas es necesario, poner el ratón en una incubadora con la temperatura ambiente a 37 ° C. Devolver el ratón para la instalación de animales después de que se despierta de forma natural. De lo contrario, siga los protocolos para la eutanasia de los animales y disponer de ella.

4. Funcionales o-PAM de total concentración y saturación de oxígeno de la hemoglobina

1. Oxihemoglobina (HbO ₂₎ y desoxihemoglobina (HBR) son las dos formas principales de la hemoglobina, la fuente endógena fotoacústica predominante en el rango espectral visible. HbO ₂ y HBr tienen un espectro de absorción óptica distinta y por lo tanto puede ser espectralmente diferenciados para cuantificar tanto la concentración total (HBT) y la saturación de oxígeno (SO ₂₎ de la hemoglobina ^5. Aquí hay dos guías para ayudar a seleccionar longitudes de onda ópticas adecuadas para el SO ₂ medidas:
2. Longitudes de onda se debe seleccionar en el Q-banda del espectro de absorción de la hemoglobina (es decir, 550-600 nm) para garantizar una suficiente relación señal-ruido y una penetración adecuada.
3. Longitudes de onda donde los coeficientes de absorción de HbO ₂ y HBr tiene una marcada diferencia (por ejemplo, HBR-561 nm dominante y HBO _2-dominante, 578 nm) se recomiendan.

Además de SO _2, HBT se puede calcular mediante la adición de [HBR] y [HbO _2] juntos, o que se puede medir directamente en longitudes de onda isosbestic de los espectros del coeficiente de extinción molar de la hemoglobina (por ejemplo, 530 nm, 545 nm, 570 nm, y 584 nm) ^14, en Harvard Business Review y HBO ₂ tienen los mismos coeficientes de extinción molar.

5. Los resultados representativos:

Muestra en la Figura 1 es la anatomía vascular y SO ₂ en una oreja de ratón vivo desnudo fotografiado por doble longitud de onda (561 y 570 nm) o PAM. La imagen típica de tiempo de adquisición de doble longitud de onda por lo que ₂ mediciones de una región de interés (tamaño de la imagen: 10 mm x 10 mm, tamaño de paso: 2,5 m x 5 m) es de ~ 80 min.

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Figura 1. En vivo óptico resolución de la microscopía fotoacústica. Imágenes de mapas de (A) la concentración de hemoglobina total que muestra la anatomía vascular (adquirida a 570 nm) y (B) la saturación de oxígeno de la hemoglobina (adquirida en 561 nm y 570 nm) en una oreja de ratón desnudo. (C) Detalle de la región en caja en el panel (A). La barra de escala en el panel (A) se aplica a ambos (A) y (B).

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Discusión

En este vídeo, que proporciona una instrucción detallada sobre los protocolos experimentales de O-PAM, incluyendo la configuración del sistema, la alineación del sistema y los procedimientos típicos experimental. Sin etiquetas, no invasivo O-PAM ha permitido a los estudios de funcionamiento microvascular y el metabolismo de forma capilar única y por lo tanto tiene el potencial para ampliar nuestra comprensión de la microcirculación relacionados con la fisiología y la patología. Microphotoacoustics es actualmen...

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