Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Resumen

Se demuestra en el video de un método para producir una oclusión de arteria cerebral media en ratones adultos con un monofilamento intraluminal. También mostrará cómo evaluar la extensión del infarto cerebral por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) tinción.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la más común enfermedad neurológica mortal en los Estados Unidos ^1. La mayoría de los accidentes cerebrovasculares (88%) son el resultado de la obstrucción de los vasos sanguíneos en el cerebro (apoplejía isquémica) ^2. Como la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos (80%) se producen en el territorio de la arteria cerebral media (ACM) ^3, muchos modelos animales tiempos que se han desarrollado se han centrado en esta arteria. El modelo de monofilamento intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) consiste en la inserción de un filamento de cirugía en la arteria carótida externa y los hilos que a la arteria carótida interna (ACI) hasta que la punta ocluye el origen de la MCA, dando lugar a un cese del flujo sanguíneo e infarto cerebral posterior en el territorio de la ACM ^4. La técnica puede ser utilizada para modelar la oclusión permanente o transitoria ^5. Si la sutura se retira después de un intervalo determinado (30 min, 1 h, o h 2), se logra la reperfusión (transitoria MCAO), si el filamento se deja en su lugar (24 h) el procedimiento es adecuado como un modelo de permanente MCAO . Esta técnica no requiere la craniectomía, un procedimiento neuroquirúrgico para eliminar una parte del cráneo, que puede afectar la presión intracraneal y la temperatura ^6. Se ha convertido en el método más frecuentemente utilizado para imitar permanentes y transitorios de isquemia cerebral focal en ratas y ratones ^7,8. Para evaluar la extensión del infarto cerebral, que mancha las secciones de cerebro con cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) para identificar el tejido cerebral isquémico ^9. En este vídeo, se demuestra el método MCAO y la determinación del tamaño del infarto por tinción con TTC.

Protocolo

1. Método MCAO

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional y los Comités de Uso de la UCSF y la Universidad Estatal de Kent, y se rige por los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de experimentación.

1. Cortar una sutura monofilamento 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) en 20 segmentos mm. Alrededor de la punta de cada segmento por calentamiento cerca de un cauterizador (Braintree Scientific, Inc., Boston, MA). Mida el diámetro de la punta con un micrómetro (Applied Image Inc., Rochester, NY). Nosotros utilizamos una sutura con un diámetro de la punta final de 0,21-0,22 mm para un ratón con el peso corporal de 25 a 30 g.
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, durante 15 minutos). Desinfectar la mesa de cirugía y el equipo asociado con etanol al 70%.
3. Anestesiar a un 8-12 semanas de edad del ratón (25-30 g) con 5% de isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) en el 30% O ₂ / 70% N ₂ O con el sistema V-10 Anestesia (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Después de la inducción de la anestesia, reducir el nivel de isoflurano y mantenerlo en el 1,5%.
4. Coloque el ratón en la posición en decúbito supino sobre una almohadilla térmica. Insertar una sonda rectal, y vigilar y mantener la temperatura corporal entre 36,5 a 37,5 ° C con el TR-200 sistema de temperatura homeotermos (Fine Ciencia Tools Inc., Foster City, CA).
5. Afeitarse la piel en la región del cuello ventral con una maquinilla eléctrica (Braintree Científica) para exponer la piel. La desinfección de la zona quirúrgica con tres aplicaciones de etanol al 70%.
6. Bajo un microscopio estéreo de disección (Nikon, Japón), haga una incisión de 1 cm de largo la línea media del cuello. Utilice separadores (Braintree Scientific) para exponer el campo quirúrgico e identificar la arteria carótida común (CCA), arteria carótida externa (ACE), y la arteria carótida interna (ICA). Diseccionar cuidadosamente las arterias libres de alrededor de los nervios y la fascia.
7. Diseccionar la ECA más distal y la coagulación de la ECA y su arteria tiroidea superior (STA) rama con un coagulador bipolar (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Cortar la CEPA y la STA en el segmento de coagulación.
8. Vagamente eliminatoria a doble 8-0 suturas de seda alrededor del muñón ECA. Aplique una pinza vascular (Herramientas de Bellas Ciencia) en la bifurcación de la CCA en el Tribunal de Cuentas y de la ACI.
9. Haga una pequeña incisión en el extremo de la CEPA muñón con unas tijeras de primavera Vannas estilo (Herramientas de Bellas Ciencia). Medir y registrar la duración de una sutura monofilamento 5-0 redondeadas en la punta. Inserte la sutura en la incisión y avanzar a la abrazadera. Apriete los dos puntos de seda alrededor de la luz lo suficiente como para asegurar al mismo tiempo preservar la movilidad de la sutura monofilamento en vivienda.
10. Retire la abrazadera de la bifurcación. Suavemente avanzar en la sutura de monofilamento de la luz de la ECA en el ICA para una distancia de 9.10 mm más allá de la bifurcación de la CCA para ocluir el origen de la MCA. La duración de la cirugía es de aproximadamente 30-45 min.
11. Sutura de la incisión en el cuello y coloque el ratón en una caja de 35 ° C de enfermería para recuperarse de la anestesia, y devolverlo a la jaula. Generalmente se tarda 5-10 minutos para los ratones a recuperarse de la anestesia. Para llevar a cabo MCAO transitorios, el investigador puede volver a anestesiar el ratón y retirar la sutura de nuevo en el tronco de la CEPA después de un período de tiempo, generalmente entre 0,5 a 2 h.
12. Veinticuatro horas después de la inducción de MCAO, anestesiar el ratón con isoflurano 5% y la eutanasia por dislocación cervical. Decapitar el ratón y recoger el cerebro. Cortar el cerebro coronal en cuatro rodajas de 2 mm con una matriz de cerebro (Braintree Scientific) en el hielo. Se incuban las rodajas de cerebro en el 2% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) (Sigma-Aldrich) en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente para determinar el tamaño y la extensión del infarto. Fijar las rodajas de cerebro en el 10% neutral solución de formalina tamponada (Sigma-Aldrich) a 4 ° C hasta que la imagen. La extensión del infarto se puede cuantificar como se describe en el protocolo JoVe 955 ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) ^9.

2. Resultados representante

Los infartos generados por MCAO se ven en el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral. El estriado es más sensible a la isquemia de la corteza cerebral. Treinta minutos de MCAO producirá un infarto sólo en el cuerpo estriado, mientras que más de una hora de MCAO dañar tanto el cuerpo estriado y la corteza. Después de 24 h MCAO permanente, el porcentaje total de infarto es de ~ 40 ± 5% del hemisferio y la tasa de mortalidad después de la cirugía es de alrededor del 10%. Se excluye a los ratones de más estudios, si se produce un sangrado excesivo durante la cirugía, el tiempo de funcionamiento supera los 90 minutos, los ratones no recuperarse de la anestesia en los 15 minutos, o la hemorragia se encuentra en las secciones de cerebro o en la base del círculo de Willis durante el examen post-mortem .

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Figura 1. Imágenes representativas de las secciones de cerebro TTC-manchada (nivel coronal 1-4) después de 24 h de MCAO permanente. En el tejido vivo TTC es enzimáticamente reducido por deshidrogenasas de 1,3,5-triphenylformazan (TPF), que es de color rojo, mientras que en las áreas necróticas sigue siendo blanco debido a la ausencia de actividad enzimática tales. Por lo tanto, el área de infarto se puede identificar por su color blanco debido a la falta de conversión de TTC para TPF. Nota: TTC es un tanto calor y la luz inestable para proteger a las secciones teñidas de luz y calor tanto como sea posible.

Discusión

MCAO en ratones se utiliza comúnmente para modelo de isquemia cerebral focal en los seres humanos. El uso de ratones para los estudios de tiempos cada vez más frecuente debido a la disponibilidad de las cepas de transgénicos y knock-out. Hay algunos detalles fundamental tener en cuenta en el protocolo:

1. Es esencial para mantener la temperatura del cuerpo del ratón durante la cirugía y antes de que se recupere completamente de la anestesia. La temperatura corporal tiene efectos sobre la extensión del infarto, disminuye la hipotermia y la hipertermia aumenta el tamaño del infarto.
2. Mientras que la exposición y el aislamiento de la CCA y la CEPA, evitar daños en el nervio vago cerca y la tráquea, lo que podría aumentar el tamaño del infarto y la viabilidad de disminuir.
3. Nunca introduzca la sutura monofilamento de más de 10 mm de paso de la bifurcación. Una sutura insertado demasiado lejos puede perforar la arteria cerebral anterior y el resultado de una hemorragia cerebral. A la resistencia se puede sentir cuando la sutura se avanza unos 9-10 mm más allá del punto de bifurcación. Si esto ocurre, el investigador debe detener el avance de la sutura y confirmar la distancia.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Chemical	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 Anesthesia system	Equipment	VetEquip	901807
TR-200 Temp Controller	Equipment	Fine Science Tools	21060
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
Dissecting microscope	Equipment	Nikon Instruments	SMZ745T
Retractor system	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
Bipolar coagulator	Equipment	Howard Instrument	64000
Silk suture	Material	Harvard Apparatus	510479
Monofilament suture	Material	Harvard Apparatus	723351
Vascular clamp	Equipment	Fine Science Tools	00396-01
Vannas scissor	Equipment	Fine Science Tools	15000-08
Brain matrix	Equipment	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma-Aldrich	T8877
10% neutral buffer formalin	Chemical	Sigma-Aldrich	HT5011