La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

Resumen

Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido en Saccharomyces cerevisiae, Con una biblioteca dispuestos plásmido y un protocolo de transformación de alto rendimiento de la levadura con un robot de manejo de líquidos.

Resumen

La incipiente levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un modelo de sistema de gran alcance para la definición de los mecanismos fundamentales de muchos procesos celulares importantes, incluidos los que tienen relación directa con la enfermedad humana. Debido a su corto tiempo de generación y bien caracterizado del genoma, una gran ventaja experimental del sistema de modelo de la levadura es la capacidad de realizar exámenes genéticos para identificar los genes y las vías que están involucrados en un proceso determinado. En los últimos treinta años, tales exámenes genéticos se han utilizado para dilucidar el ciclo celular, la vía secretora, y muchos aspectos más altamente conservadas de la biología de las células eucariotas ^1-5. En los últimos años, varias bibliotecas genoma de cepas de levadura y plásmidos se han generado ^6.10. Estas colecciones permiten ahora a la interrogación sistemática de la función genética utilizando la ganancia y la pérdida de la función de los enfoques ^11-16. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado para el uso de un protocolo de levadura de alto rendimiento de transformación con un robot de manejo de líquidos para llevar a cabo una pantalla sobreexpresión plásmido, vestida con una biblioteca de 5.500 plásmidos de levadura. Hemos estado utilizando estas pantallas para identificar modificadores genéticos de toxicidad asociados con la acumulación de la agregación de las proteínas humanas expuestas a la enfermedad neurodegenerativa. Los métodos que aquí se adaptan fácilmente al estudio de otros fenotipos celulares de interés.

Protocolo

1. Los preparativos para la transformación de la levadura

Este protocolo está diseñado para diez placas de 96 pozos, pero se puede escalar hacia arriba o hacia abajo según corresponda. Hemos encontrado que este protocolo no funciona bien desde hace más de veinte placas de 96 pozos por cada ronda de la transformación. El procedimiento de transformación completa (desde el paso I.3) tendrá una duración aproximada de ocho horas.

1. Alícuota de 5 10μL de ADN plásmido (100 ng / l) de la biblioteca de la levadura FLEXGene ORF en cada pocillo de un fondo redondo de 96 pocillos con el manejador de RapidPlate Biorobot líquido. Lugar descubierto placas de 96 pozos en la campana de humos durante la noche banco limpio para secar. Hemos encontrado eficacia similar de transformación con el CEN y plásmidos 2μ levadura.
2. Inocular 200 ml de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación (10 g / L de extracto de levadura, peptona 20 g / L, 20 g / l de glucosa) con la cepa de la consulta en un matraz Erlenmeyer de 500 ml desconcertado. Incubar toda la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar para estos cultivos iniciadores.
3. A la mañana siguiente, se diluye el esfuerzo de consulta a OD ₆₀₀ = 0,1 en 2 litros de YPD. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) hasta que el cultivo llegue a OD ₆₀₀ = 0,8 hasta 1,0. Para un óptimo crecimiento, crecen dos culturas separadas 1L en un recipiente de 2,8 L desconcertado. Si es necesario, los medios de comunicación selectiva también se puede utilizar en lugar de YPD.

2. La levadura de transformación

1. Las células por centrifugación de la cosecha. Llenar cuatro tubos cónicos desechables 225ml con levadura de cerveza y giran a 3.000 rpm (~ 1800 xg) durante 5 minutos en centrífuga de mesa (Eppendorf 5810R). Elimínese el líquido sobrenadante y repetir hasta que todas las células se cosechan.
2. Lavar las células en 200 ml de autoclave destilada H ₂ O. Resuspender el sedimento celular por agitación o agitación. Combine las células en un tubo cónico de 225 ml. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
3. Preparar la solución 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 en agua destilada en autoclave). Lavar las células en 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE. Giran a 3.000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
4. Resuspender el sedimento celular en 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Agitar y / o vórtice de asegurar pellet es completamente resuspendido.
5. Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm).
6. Añadir β-mercaptoetanol 0,1 M a. Incubar con agitación a 30 ° C durante 30 minutos (200 rpm). Nota: Este paso puede omitirse si la utilización de cepas de levadura que son sensibles a los β-mercaptoetanol. Hemos encontrado que este paso no es esencial para la transformación exitosa, sin embargo, no mejora la eficiencia de transformación.
7. Hervir 2 ml de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml) durante 15 minutos, y luego se enfría en hielo.
8. Añadir 2 ml de ADN de esperma de salmón cocido a la mezcla de la célula. Precaución: puede formarse un precipitado con la adición de ADN de esperma de salmón a la mezcla de células. El uso de un Pipetman y 200 l punta, retire con cuidado cualquier precipitado que se forma debido a que esto puede interferir con la pipeta abajo.
9. 50μL alícuota de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con el Rapidplate BioRobot (también puede utilizar una pipeta multicanal). No se mezclan.
10. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.
11. Preparar 200 ml de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% de PEG-3350, DMSO 20 ml, 20 ml LiOAc 1M). Preparar la solución inmediatamente antes de su uso.
12. Añadir 125μL de PEG / LioAc / DMSO a cada pocillo. Mezclar por aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con RapidPlate.
13. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.
14. Choque térmico de las células a 42 ° C durante 15 minutos en un incubador seco. No apile los platos. Nota: Hemos encontrado que este paso de choque térmico no es esencial para la transformación exitosa. Para ciertas cepas de levaduras (por ejemplo, los mutantes sensibles a la temperatura), golpe de calor es perjudicial. Previamente hemos reducido el tiempo de golpe de calor a un minuto y han sido capaces de transformar con éxito una cepa de levadura albergar una mutación temperatura ypt1 sensibles que utilizan este protocolo.
15. Giro placas a 2500rpm (~ 1100 xg) durante 5 minutos, el uso de adaptadores de centrífuga para dar cabida a placas de 96 pozos. Eliminar la solución de PEG por las placas de inversión de más de cubo de residuos. Blot placa invertida sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual (las células que permanecen en el fondo de los pozos).
16. Enjuague las células mediante la adición de 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate.
17. Giro placas a 2500rpm durante 5 minutos y retirar el sobrenadante por el cubo de residuos invertir más y en toallas de papel secante.
18. Añadir 200μL de medio mínimo (por ejemplo, SD /-Ura) a cada pocillo con RapidPlate.
19. Se incuba a 30 ° C durante 2 días sin agitación. Después de 2 días, pequeñas colonias de células se empiezan a formar en la parte inferior de cada transformado con éxito así.

3. Manchado ensayo

1. Dispensar 200μL de rafinosa medios basados ​​en mínimos (por ejemplo, sraf /-Ura) en cada pocillo deun nuevo fondo plano placa de 96 pocillos.
2. Mezcle cada pocillo de la placa de transformación mediante la aspiración y dispensación de suspensión de células en ocho ocasiones con Rapidplate.
3. Inocular las placas con sraf 5μL de mezcla de células de la placa de la transformación.
4. Se incuba a 30 ° C durante un día. Pequeñas colonias deben estar presentes en la parte inferior de cada bien después de un día.
5. Colonias lugar en tarjetas SD /-Ura y SGal / Ura-placas en campana. Esterilizar de 96 perno replicador (Frogger) por fuego. Mezcla de colonias con Frogger antes de manchas en las placas de medios selectivos. Después de ver, permite secar las placas en campana durante 5-10 minutos.
6. Se incuba a 30 ° C durante 2-3 días.

Placas de fotografía con cámara digital, y comparar visualmente el crecimiento de colonias en SGal / Ura-placas para encontrar colonias en las que la toxicidad se incrementa la tensión de consulta (un crecimiento más lento / colonias menos densas) o suprimida (un crecimiento más rápido / más densas colonias).

4. Los resultados representativos:

Figura 1. Levadura pantalla sobreexpresión plásmido para identificar supresores y potenciadores de la toxicidad TDP-43. TDP-43 es una proteína humana que ha sido implicada en la patogenia de la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig). Agregados citoplasmáticos de TDP-43 acumulan en el cerebro y las neuronas de médula espinal de pacientes con ELA ^17. Expresando TDP-43 en células de levadura resultados de la agregación y la citotoxicidad ^{de 18 años.} Hemos utilizado este modelo de sistema para definir los mecanismos de toxicidad de la TDP-43 ^19,20. Se muestran ejemplos representativo de platos de nuestra levadura TDP-43 pantalla modificador de toxicidad. Estas placas colonias con una pantalla integrada de galactosa-inducible TDP-43 plásmido y se transforman también con plásmidos de la biblioteca de expresión FLEXGene ORF. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de TDP-43 o los plásmidos FLEXGene. La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP-43 y el ORF en los plásmidos FLEXGene. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de la TDP-43. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de la TDP-43.

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Discusión

Aquí se presenta un protocolo para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento de la sobreexpresión plásmido en la levadura. Este método permite la detección rápida e imparcial de modificadores genéticos de muchos fenotipos celulares distintos. Con este enfoque, un investigador puede filtrar una parte importante del genoma de la levadura en cuestión de semanas. Este enfoque no sesgado también permite la identificación de los modificadores, que pueden no haber sido predicho sobre la base de los resultados an...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
BioRobot RapidPlate	Qiagen	9000490
96 perno replicador (Frogger)	V & P Científico	VP404
FLEXGene ORF biblioteca	Instituto de Proteómica de Harvard Medical School
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5810R
Frasco de 500 ml desconcertado	Bellco	2543-00500
2,8 litros de tres desconcertado Fernbach frasco	Bellco	2551-02800
100μL Rapidplate puntas de pipeta	Axygen	ZT-100-RS
200μL Rapidplate puntas de pipeta	Axygen	ZT-200-RS