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Method Article
El biarsenical FlAsH tintes y ReAsH se unen específicamente a los motivos tetracysteine en proteínas y selectiva puede etiquetar las proteínas en células vivas. Recientemente, esta estrategia de etiquetado se ha utilizado para desarrollar sensores para diferentes conformaciones de las proteínas o los estados oligoméricos. Se describe el mecanismo de etiquetado y métodos para analizar cuantitativamente vinculante.
Las proteínas fluorescentes y tintes son herramientas esenciales para el estudio de proteínas tráfico, localización y función en las células. Mientras que las proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) han sido ampliamente utilizados como socios de la fusión de las proteínas para hacer un seguimiento de las propiedades de una proteína de interés 1, los acontecimientos recientes más pequeñas etiquetas permiten nuevas funcionalidades de las proteínas que se examinarán en las células, como el cambio conformacional y proteínas de asociación 2, 3. Un sistema de etiqueta pequeña implica un motivo tetracysteine (CCXXCC) genéticamente insertado en una proteína diana, que se une a colorantes biarsenical, ReAsH (fluorescente de color rojo) y Flash (de color verde fluorescente), con una alta especificidad, incluso en las células vivas 2. El sistema de TC / biarsenical tinte ofrece mucho menos restricciones estéricas de la proteína de acogida de proteínas fluorescentes que ha permitido a varios nuevos métodos para medir el cambio en la conformación y las interacciones proteína-7.4. Recientemente hemos desarrollado una nueva aplicación de etiquetas de TC como sensores de oligomerización en células que expresan huntingtina mutante, que cuando mutan agregados en las neuronas en la enfermedad de Huntington 7. Huntingtina fue etiquetado con dos tintes fluorescentes, una una proteína fluorescente para seguir la localización de proteínas, y la segunda, una etiqueta de TC, que sólo vincula a los tintes biarsenical en monómeros. Por lo tanto, los cambios en la colocalización entre la proteína y la reactividad tinte biarsenical contenido habilitado oligómero submicroscópicas que se asigna espacio dentro de las células. Aquí se describe cómo etiquetar TC-etiquetados proteínas fusionadas a una proteína fluorescente (Cherry, las buenas prácticas agrarias o PPC) con flash o ReAsH en vivo las células de mamíferos y la forma de cuantificar la fluorescencia de dos colores (cereza / Flash, PPC / Flash o GFP / ReAsH combinaciones).
1. Preparación de las células para el etiquetado con ReAsH / Flash
Tenga en cuenta que es importante la utilización de controles positivos y negativos para evaluar el grado de unión específica a las etiquetas de TC y evaluar de forma bleedthrough de fluorescencia entre los canales en la recogida de micrografías confocal. Por lo tanto, de dos colores (por ejemplo, Flash / cereza o ReAsH / PPC o combinaciones ReAsH / GFP), asegúrese de muestras se preparan para un solo color (por ejemplo, proteínas fluorescentes solo o si es posible una proteína TC-etiquetado vinculados a Flash / ReAsH pero sin fluorescentes proteína)
Es importante agregar EDT primero antes de añadir Flash / ReAsH y hacer que el buffer justo antes de añadir a las células. Incubar durante exactamente 30 minutos a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos. En nuestra experiencia los tiempos de incubación más largo aumenta significativamente la fluorescencia de fondo. Nuevas construcciones también deben ser optimizados para el etiquetado de tiempo y Flash / ReAsH concentración (0.5-2 M).
Después de este lavado, las células se pueden fijar con paraformaldehído (15 min con 3,2% de solución), aunque hemos encontrado que este aumento no específico de fluorescencia tinte biarsenical. De ahí que por lo general la imagen de la células vivas a temperatura ambiente. (Tenga en cuenta que la fijación de las células antes de su etiquetado impide la unión colorante biarsenical.)
2. Imágenes de las células en un microscopio confocal
3. Análisis de los datos
4. Los resultados representativos:
El éxito de las células de etiquetado con los tintes biarsenical depende de los parámetros clave. En primer lugar, el momento en el etiquetado con los tintes es crucial. Hemos encontrado que durante largos períodos de etiquetado (más de 30 minutos) se traduce en un alto grado de tinción de fondo inespecífica. La figura 1 muestra un resultado típico de una forma de tipo salvaje de un fragmento de la huntingtina (25Q) fusionado con el Cerulean PPC derivado que contenga una etiqueta de TC como se describió anteriormente 7. Esta muestra se tiñó durante 30 minutos con ReAsH y no hay experiencia mínima en la muestra que carecen de la etiqueta de TC. Hemos encontrado que la fijación de las células con paraformaldehído plano aumenta mientras que la fijación con metanol abroga la fluorescencia de la etiqueta de la proteína fluorescente. De ahí que sea posible que la imagen de la células vivas. Es importante señalar también que la fijación previaal etiquetado con los tintes biarsenical impide su unión, presumiblemente debido a las modificaciones del motivo de TC.
Otro factor fundamental para obtener resultados consistentes es la densidad de las células. Hemos encontrado que es esencial para las células de la imagen que están más o menos distribuidos y también que agrupar extensa puede dar lugar a manchas irregulares de los tintes biarsenical en diferentes células.
Figura 1. Tetracysteine etiquetas y tinción ReAsH en células vivas transfectadas con la huntingtina (exon1-25Q)-Cerulean fusiones. La etiqueta de TC se encuentra en el cruce de la fusión de la huntingtina, Celeste (como se describe en 7). La trama de intensidad de correlación de píxeles permite una evaluación a las diferencias en ReAsH vinculante en toda la célula y puede ser utilizado para trazar los cambios en ReAsH vinculante debido al cambio conformacional o ligando.
El enfoque de la localización de la etiqueta de proteínas con una proteína fluorescente y propiedades conformacionales con un tinte segunda ofrece un gran potencial para el mapeo en diferentes conformaciones de las proteínas se acumulan en las células y los eventos que cambian la dinámica de la conformación de la proteína. ReAsH / Flash se utilizó por primera vez como un sensor en el celular de plegamiento de las proteínas celulares de los mamíferos del ácido retinoico-proteína de unión I 4. En ...
No hay conflictos de interés declarado.
Este trabajo fue financiado por becas de DMH y TDM (NHMRC subvenciones para proyectos). DMH es un compañero Grimwade, financiado por la Fundación Miegunyah.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
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8 y μ-diapositivas | Ibidi | 80826 | Consideramos que estos cámara de diapositivas para ser especialmente útil para el cultivo de células para la imagen. |
TC-Flash II en las células de detección de etiqueta Tetracysteine Kit * * * fluorescencia verde de células vivas imágenes | Invitrogen | T34561 (flash) o T34562 (ReAsH) | |
Solución salina equilibrada de Hanks | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
1,2-etanoditiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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