Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

Resumen

El factor limitante en el uso de los adultos Drosophila para estudiar la neurodegeneración y la biología celular es la imagen difícil de procesos intracelulares. Se describe la disección de omatidios solo para generar una bona-fide cultivo primario de células neuronales, que pueden ser sometidos a un tratamiento de drogas y de imagen avanzada.

Resumen

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha hecho valiosas contribuciones a la investigación en neurociencias y ha sido utilizado ampliamente como un modelo para las enfermedades neurodegenerativas por su poderosa genética ^1. El ojo de la mosca, en particular, ha sido el órgano de elección para la investigación neurodegeneración, siendo la parte más accesible y la vida puede prescindir de la Drosophila sistema nervioso. Sin embargo, la principal advertencia de los ojos intactos, es la dificultad, debido a la intensa autofluorescencia de los pigmentos, en los eventos de formación de imágenes intracelulares, como la dinámica de la autofagia ^2, que son fundamentales para la comprensión de la neurodegeneración.

Recientemente, hemos utilizado la disección y la cultura de un solo omatidios ³ que ha sido esencial para nuestra comprensión de las disfunciones autofagia en un modelo de vuelo de Dentatorubro-Pallidoluysian atrofia (DRPLA) ^{3, 4.}

Ahora el informe una descripción completa de esta técnica (Fig. 1), una adaptación de los estudios electrofisiológicos ^5, que es probable que se expanda enormemente la posibilidad de volar por los modelos de neurodegeneración. Este método puede ser adaptado a la imagen en vivo eventos subcelulares y para supervisar la administración de fármacos eficaces en las células fotorreceptoras (Fig. 2). Si se utiliza en combinación con las técnicas del mosaico de ^6-8, las respuestas de las células genéticamente diferentes se analizaron en paralelo (Fig. 2).

Protocolo

1. La disección de la retina Drosophila

1. Llenar una y de un portaobjetos de vidrio de 3 Bueno con tampón fosfato salino (PBS 1X), y luego vuela por anestesiar a CO _2. Tanto hombres como mujeres pueden ser utilizados para este experimento.
2. Una vez que las moscas son anestesiados, recoger una mosca con unas pinzas y colocarlo en el plato pequeño de PBS.
3. Bajo un microscopio de disección, una pizca de la trompa con pinzas, y luego separar la cabeza del cuerpo si se rompe el cuello con un segundo conjunto de pinzas.
4. Sosteniendo la cabeza de mosca de la trompa, cortado por la mitad a lo largo de la línea media hacia la izquierda / derecha de la cabeza de mosca con micro tijeras para revelar el cerebro.
5. Use una pipeta de punta de corte para recoger a la retina, y la transferencia de un segundo pozo de la lámina de vidrio de 3 llenarse bien con medio Schneider.
6. En primer lugar, pelar lejos la mayor parte de la cutícula de cabeza y luego retire el cerebro con una pinza. Mantener la retina situado entre la lámina y la córnea.
7. A continuación, la transferencia de la retina en una gota (50 l) del medio de Schnieder frescas se colocan directamente de la lámina de vidrio.

2. La disección de la omatidios

1. Dependiendo del propósito final de la disección (ya sea de imágenes inmediata o la cultura) y en la óptica del microscopio de fluorescencia (directa o inversa), este paso puede tener lugar en un portaobjetos o en una placa de 24 pocillos. Con el propósito final de esta disección, el omatidios se diseca directamente en el portaobjetos de vidrio.
2. Sujete bien el extremo más dorsal o ventral de la retina con una pinza. Utilizando micro tijeras, corte la retina en la mitad a lo largo de la línea media dorsal / ventral para exponer los omatidios en el centro del ojo.
3. Seguir para captar la retina de tal manera que la córnea está orientada hacia abajo y la lámina hacia arriba. Utilizando una aguja de tungsteno muy bien, separar el omatidios de la lámina y la córnea.
4. Solo omatidios y grupos de omatidios recogerá en el fondo del pozo o la diapositiva. Elimine todos los residuos más grandes que se haya quedado antes de proceder.

3. Tratamiento, las manchas y de imagen

1. Para el análisis de la autofagia, diluir 1:1000 LysoTracker en la caída de Schneider (primero diluir 1:10 en Schneider y luego añadir 0,5 l de la caída en la diapositiva), mezclar y esperar 10 segundos.
2. Retire el exceso de líquido de la diapositiva, teniendo cuidado de dejar atrás el omatidios. Esto se hace mejor con una punta fina de gel de carga.
3. Añadir una gota de Vectashield para cubrir los omatidios, un cubreobjetos y sellar con nailpolish.

4. Los resultados representativos:

La buena ejecución del protocolo deben dejar un número de omatidios individuales y de pequeños grupos de omatidios mantienen unidas por fragmentos de lámina, pero bien separados en el lado de la córnea. Estas se pueden visualizar como en este ejemplo para visualizar Atg8: GFP y LysoTracker, mostrando autofagosomas, lisosomas y autophagolysosomes (Fig. 3). El método puede ser utilizado para obtener imágenes en vivo, sin embargo, en este caso es de señalar que la autofluorescencia de la media de Schneider se hace difícil distinguir las señales de baja intensidad de fluorescencia. Un problema adicional es que los gránulos de pigmento que permanecer unidos a los fotorreceptores son intensamente fluorescentes, especialmente en el canal rojo. Un cuadro campo claro puede ser necesario para distinguirlos de los orgánulos genuino.

Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de disección para obtener omatidios individuales o pequeños grupos de omatidios de la retina de la mosca.

Figura 2. Las posibles variaciones del protocolo simple de describir aquí que involucran a la genética y el envejecimiento marcha ascendente de la disección y la tinción o cultivo para un máximo de 24 horas y posterior administración de fármacos de la disección.

Figura 3 escaneo confocal de autofagosomas y los lisosomas en una sola omatidio disecados de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / + volar, que expresa un mutante de poliglutamina Atrophin y de 12 días a 29 ° C. El panel de campo claro (derecha) muestra la estructura casi intacta de la omatidio y el marco indica la zona analizada. Los lisosomas marcas rojas, verdes los autofagosomas, lisosomas auto-, lo que resulta de la fusión de los dos orgánulos, aparecen de color amarillo. Las puntas de flecha indican dos eventos de fusión en curso entre los autofagosomas y los lisosomas.

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Discusión

La disección omatidio único que aquí se presenta permite la recolección de información de celda más profunda sobre los procesos biológicos como la neurodegeneración, cuando el modelo en el ojo de Drosophila. Las neuronas fotorreceptoras son más accesibles que otras neuronas y el citoplasma es muy grande, y por lo tanto adecuado para estudiar la dinámica de la vesícula, en las células del mismo utilizado eficientemente en muchos modelos para cuantificar la neurodegeneración en vivo. El aspe...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Dispensador de CO2 portátil	Flystuff	59-150	Recambios disponibles
Pinzas DUMONT n º 5	AGAR Científico	T5034
3-Bueno portaobjetos de vidrio	EMS	71561-01
Micro tijeras	VWR	HAMMHSB516-09
Medio de Schneider	VWR	733-1663
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
Superfrost Diapositivas	VWR	631-0108
Vectashield con DAPI	Vector de Laboratorios	H-1200
Cubreobjetos	VWR	631-1336