Method Article
Este estudio describe un método que permite el diagnóstico rápido y libre de enfermedades virales en las plantas cerca de la mitad de un día mediante el uso de una combinación de preparación de muestras asistida por microondas para la planta de microscopía electrónica de transmisión y los métodos de tinción negativa.
Las investigaciones de los cambios ultraestructurales inducidas por virus son a menudo necesarios para identificar claramente las enfermedades virales en las plantas. Con la preparación de muestras convencionales de microscopía electrónica de transmisión (TEM) estas investigaciones pueden durar varios días 1,2 y por tanto no adecuada para un diagnóstico rápido de enfermedades virales de las plantas. La fijación de microondas se pueden utilizar para reducir drásticamente el tiempo de preparación de muestras para las investigaciones de TEM con similares resultados ultraestructurales observados después de la preparación de muestras convencional 3-5. Diferentes dispositivos de microondas por encargo están disponibles que pueden ser utilizados para la fijación de éxito y la inclusión de muestras biológicas para investigación TEM 5-8. En este estudio hemos demostrado sobre el virus del mosaico del tabaco (TMV) las plantas infectadas con Nicotiana tabacum que es posible diagnosticar alteraciones ultraestructurales en las hojas en la mitad de una semana a través de la preparación de muestras asistida por microondas TEM. Hemos elegido para llevar a cabo este estudio con un dispositivo de microondas disponibles en el mercado, ya que lleva a cabo la preparación de muestras casi en su totalidad de forma automática 5 a diferencia de los otros dispositivos disponibles en muchos pasos todavía tiene que realizarse de forma manual 6.8 y por lo tanto más tiempo y mucho trabajo. Como preparación de la muestra se realiza de forma totalmente automática tinción negativa de las partículas virales en la savia de los restantes TMV hojas infectadas y el siguiente examen de la ultraestructura y el tamaño se puede realizar durante la fijación e inclusión.
Microondas preparación de muestras asistida
2. Corte y seccionamiento
3. Tinción negativa
4. De análisis de imagen
5. Los resultados representativos:
Después de la preparación de muestras asistida por microondas típico TMV inducida por alteraciones ultraestructurales, tales como grandes áreas que contienen viriones alineados en forma paralela se puede observar con el microscopio electrónico de transmisión en el citosol de las células infectadas por Nicotiana tabacum (Fig. 1A). Además, en la savia bruta de TMV hojas infectadas partículas de TMV se pudo observar como flexuoso, en forma de barra estructuras después de la tinción negativa (Fig. 1B). Análisis de imágenes de 100 partículas de virus reveló un tamaño promedio de TMV de 280 nm de longitud y 17nm de ancho (Fig. 2). La ultraestructura de las células infectadas con TMV y el tamaño de los viriones observada en este estudio se encontró que de acuerdo con TMV inducida por las propiedades ultraestructurales en el tabaco y el rango de tamaño de partículas de TMV previamente reportados en la literatura 9-15.
Figura 1. Micrografías electrónicas de transmisión de las células de la hoja de TMV-infectados y los viriones. A) La imagen muestra la ultraestructura de las células infectadas con TMV mesófilo de la hoja de Nicotiana tabacum después de la preparación de muestras asistida por microondas de la planta. Tenga en cuenta la gran superficie de los viriones paralelos alineados que se acumuló en el citosol.C = cloroplastos con almidón (St), M = mitocondria, N = núcleo, V = vacuola, Bar = 2μm. B) La imagen muestra los viriones que fueron detectados por tinción negativa en la savia de las hojas infectadas.
Figura 2. Tamaño relativo de los viriones. Distribución relativa de la longitud y la anchura de TMV-partículas después de la tinción negativa de la savia de las hojas infectadas, ya que apareció en el microscopio electrónico. Los valores medios (media longitud / anchura media ± desviación estándar) se calcula a partir de 100 viriones.
Asistida por microondas de preparación de muestras de plantas para TEM se ha demostrado que la oferta de datos ultraestructurales rápido y fiable a las pocas horas 3,4,16. La preservación fina estructural de las membranas de los organelos y logra con el método utilizado en este estudio fue similar a las muestras convencionales y cryofixed 5,15 con la ventaja de una reducción masiva en la fijación de la muestra y la incrustación de tiempo de 3 días o más a cerca de 2 horas. Esto representa el protocolo de muestreo más rápido de preparación para TEM actualmente disponibles en la literatura. El método descrito en este estudio combinado asistida por microondas de preparación de muestras de plantas para TEM con los métodos de tinción negativa, que permite una identificación clara y rápida de la TMV inducida por alteraciones ultraestructurales y el agente viral en sí. TMV alteraciones inducidas ultraestructurales podría ser investigado después de la poda, corte y post-tinción en aproximadamente 4 horas después del inicio de la fijación en el microscopio electrónico de transmisión. Usando el modo totalmente automático la preparación de muestras liberó a los investigadores para llevar a cabo la tinción negativa en el ínterin con el fin de determinar el tamaño y el ancho del agente viral. Por lo tanto, podemos concluir que este método permite un diagnóstico claro y rápido de las enfermedades de virus de la planta en alrededor de medio día, que es de gran importancia para su futuro uso en experimentos científicos en la agricultura y la planta de fitopatología. Como este método también podría utilizarse para el diagnóstico rápido de enfermedades de los animales y humanos que tiene un gran potencial para su futura aplicación en medicina y patología veterinaria.
No hay conflictos de interés declarado.
Este trabajo fue apoyado por el Fondo Científico de Austria (FMF, P20619 y P22988 para BZ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
Cell D | Olympus Corporation | ||
Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
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