Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Resumen

Resumen

Inmunohistoquímica (IHC) es una técnica valiosa utilizada para localizar / visualizar la expresión de proteínas en una sección de tejido montado utilizando anticuerpos específicos. Hay dos métodos: el método directo e indirecto. En este experimento, sólo se describe el uso de la tinción inmunohistoquímica indirecta. Indirectos tinción IHC utiliza muy anticuerpos específicos de primaria y secundaria conjugado con biotina. Anticuerpos primarios se utilizan para identificar discretamente proteínas de interés mediante la unión a un epítopo específico, mientras que los anticuerpos secundarios reste para la tinción de fondo inespecífica y amplificar la señal mediante la formación de complejos con el anticuerpo primario. Las diapositivas pueden ser generados a partir de secciones congeladas, o secciones de parafina montados en portaobjetos de vidrio. En este protocolo, se discute la preparación de las secciones incluidas en parafina por desparafinación, hidratación usando un gradiente de alcohol, la recuperación de antígeno inductor de calor, y el bloqueo de la actividad peroxidasa endógena y no específicos de los sitios de unión. Algunas secciones se tiñen con anticuerpos específicos para el marcador de las células T CD8 y mientras que otras se tiñen de la tirosina hidroxilasa. Las diapositivas son posteriormente tratados con anticuerpos adecuados secundario conjugado con biotina, y luego desarrollado utilizando avidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) con Diaminiobenzidine (DAB) como sustrato. Tras el desarrollo, las diapositivas se counterstained para el contraste, y se montaron en cubreobjetos con Permount. Después de un secado adecuado, estas diapositivas están listas para la imagen.

Protocolo

Tinción de secciones de parafina

1. Dewax diapositivas con xileno (Fisher X3 ^S -4) 3 veces durante 5 minutos cada uno (xileno cambian cada mes dependiendo del uso, xileno es tóxico). Use platos y tapas de 20 diapositivas de Fisher ref 08-812-1A y bastidores de hecho a la medida de estos platos. 200 ml de líquido por cada plato.
2. Hidratar a través del gradiente de alcohol de la siguiente manera (el cambio de gradiente cada 2 semanas):
   • 2x en el 100% de etanol (Fisher # A406-20) durante 2 minutos cada uno
   • 2x en el 95% de etanol durante 2 minutos cada uno
   • 1x en el 70% de etanol durante 2 min
   • 1x en el 50% de etanol durante 2 min
   • 1x en el 30% de etanol durante 2 min
   • 1x _ddH2O durante 2 minutos
3. Remoje en DPBS durante 5 minutos (DPBS = fosfato Dulbecco modificado solución salina tamponada con Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +).}

Antígeno de recuperación:

1. Pre-caliente el Na-citrato buffer (10 mM, pH 6,5) en el microondas.
2. Cocine las diapositivas durante 15 minutos en el microondas. Las diapositivas no debe dejarse secar a fin de comprobar cada minuto y añadir Na-citrato cuando sea necesario.
3. Deje que se enfríe a temperatura ambiente.
4. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena con 1% de H ₂ O ₂ en DPBS durante 20 minutos (1,5 ml de 30% de acciones Sigma H-1009 en 50 DPBS ml).
5. Remoje en DPBS 3 x 5 min.
6. Bloque no específicas sitios mediante la incubación de la noche a 4 ° C en DPBS + 5% de albúmina sérica bovina (BSA) + 0,1% de azida Na + 5% de suero.
   
   Nota: La elección de suero dependerá de las especies en que los anticuerpos utilizados para la tinción se realizaron. Bloque con el suero de la especie en la que el Ab secundario (conjugado con biotina) se hizo. Si esto no está disponible, el uso de suero de una especie diferente de aquel en el que se realizó el Ab primaria.
   
   
7. Bloquear los sitios de la biotina con el kit de avidina / biotina bloqueo (Vector laboratorios Catálogo # SP-2001):
   • Incubar con avidina D durante 15 minutos. Aclarar brevemente con DPBS.
   • Incubar con la solución de biotina durante 15 minutos.
8. Incubar en primaria Ab durante 2 horas a temperatura ambiente, en DPBS + 2% de BSA NaAzide + 0,1% + 2% de suero (igual que para bloquear el paso).
9. Remoje en PBS 3 x 5 min.
10. Incubar con el Ab secundario conjugado con biotina durante 1 hora a temperatura ambiente en DPBS + 2% de BSA + 0,1% de azida Na + 2% de suero (la misma que utiliza para el paso de bloqueo).
11. Prepare el reactivo ABC, al mismo tiempo, ya que tiene que desarrollar por lo menos 30 minutos antes de su uso! (Ver Materiales)
12. Preparar en un tubo cónico de 50 ml. En 15 ml de DPBS (sin suero, sin azida) añadir 3 gotas de reactivo A, mezclar y agregar 3 gotas de reactivo B y mezclar. Evite apretar las botellas, y no esperar a que las gotas para formar por su cuenta. ABC kit Vectastain PK-6100 de los laboratorios de Vector.
13. Remoje en DPBS 3 x 5 min.
14. Incubar con reactivo ABC durante 30-45 minutos a temperatura ambiente.
15. Remoje en DPBS 3 x 5 min.
16. Prepare el sustrato DAB peroxidasa (Vector Labs. # SK-4100) en 5 ml _ddH2O en un frasco de vidrio inmediatamente antes de su uso (ver Materiales)
    • 2 gotas de la solución de reserva de estabilización, la mezcla
    • 4 gotas de DAB, la mezcla (debe ser ligeramente marrón)
    • 2 gotas de H ₂ O _2, la mezcla
17. Caída del sustrato DAB en la parte superior de las diapositivas y ver para la tinción de color marrón.
18. Dip se desliza en el hielo + agua del grifo para detener la reacción.
19. Enjuague con agua fría del grifo durante 5 minutos.
20. De contraste con hematoxilina (20 seg; Fisher CS401-D) y enjuague con agua del grifo hasta que el agua salga clara.
21. Deshidratar el alcohol a través de gradiente a partir de etanol al 30% hasta el 100% de etanol (2 minutos cada uno).
22. Sumerja en xileno 3 x 5 min.
23. Montar con Permount (Fisher # SP15-100): poner un poco encima de la sección en la diapositiva y presione lentamente a la sección con un cubreobjetos sin burbujas de aire. No mueva el cubreobjetos hasta que esté completamente seco, lo cual lleva alrededor de 24 horas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass