El colágeno organotípicos I del ensayo: Una plataforma maleable para evaluar el comportamiento celular en un contexto de 3 dimensiones

Resumen

Se describe un método para la preparación de una matriz de tres dimensiones que consiste en colágeno tipo I y fibroblastos primarios humanos. Este gel organotípicos sirve como un sustrato útil para evaluar la migración de células invasivas debido a que imita las características básicas del estroma y se presta a muchas formas de microscopía.

Resumen

Migración de las células es fundamental para muchos aspectos de la biología, incluyendo el desarrollo de la cicatrización de heridas, las respuestas celulares del sistema inmunológico, y la metástasis de las células tumorales. La migración se ha estudiado en cubreobjetos de vidrio a fin de que las dinámicas celulares susceptibles de investigación por microscopía de luz. Sin embargo, ha quedado claro que muchos aspectos de la migración de las células dependen de las características del entorno local, incluyendo su elasticidad, la composición de proteínas, y el tamaño de los poros, que no están fielmente representados por dos sustratos rígidos dimensiones como el vidrio y de plástico de ^1. Además, la interacción con otros tipos celulares, incluyendo fibroblastos del estroma ² y ³ células del sistema inmune, se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en la promoción de la invasión de las células cancerosas. Investigación a nivel molecular ha demostrado que cada vez más dinámica molecular, incluyendo la respuesta al tratamiento farmacológico, de células idénticas son significativamente diferentes en comparación in vitro e in vivo ^4.

Idealmente, sería mejor para estudiar la migración de células en su contexto natural en los organismos vivos, sin embargo, esto no siempre es posible. Intermedio sistemas de cultivo de tejidos, tales como la matriz de células derivadas, matrigel, la cultura organotípicos (descrito aquí) explantes de tejidos, organoides, y xenoinjertos, son importantes intermedios experimental. Estos sistemas aproximada ciertos aspectos de un entorno en vivo, pero son más susceptibles a la manipulación experimental, como el uso de líneas celulares transfectadas de forma estable, los regímenes de tratamiento de drogas, a largo plazo y de imágenes de alta resolución. Tales sistemas intermedios son especialmente útiles como demostrando los motivos para validar las sondas y establecer los parámetros necesarios para la imagen de la respuesta dinámica de las células y los reporteros fluorescentes antes de realizar imágenes en vivo ^5. Como tales, pueden desempeñar un papel importante en la reducción de la necesidad de que los experimentos en animales vivos.

Protocolo

1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos de explantes de piel

1. 4 mm biopsias adquiridas de antebrazo humano se colocan en MEM suplementado 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml y 0,25 mg / ml Fungizone.
2. Recortar la grasa subcutánea y picar finamente la biopsia en trozos pequeños, colocándola un número de 24 hoja de bisturí en contra de la parte inferior de la placa de Petri.
3. Mezcla de tejidos en lugar de 25 cm ² frasco de cultivo de tejidos con los medios de comunicación primario de crecimiento de fibroblastos (MEM suplementado con 10% FCS, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml y 25 mg / Fungizone ml) hasta que la superficie del recipiente es cubierta, pero la profundidad del líquido es insuficiente para el tejido a flotar.
4. Después de tres días de incubación a 37 ° C en una atmósfera húmeda de CO2 al _5%, añadir 3 ml de medio de crecimiento de fibroblastos primarios.
5. Después de otros 3 días los medios de comunicación el cambio de la incubación con los medios de comunicación primaria fresca de crecimiento de fibroblastos, o si las células son casi confluentes que se puede dividir en 1:04 medio fresco. (Fungizone se puede omitir a partir de este punto).

2. Etapa I - Preparación de colágeno I de la cola de rata

Nota: El Protocolo de aproximadamente 12 a 14 colas de rata adolescente (frescas o congeladas)

1. Preparar la cola de rata por el lavado en etanol al 70% y eliminar los tendones de la siguiente manera:
2. Quite la piel de la cola de rata por corte en el centro de la cola de arriba a abajo con una. Bisturí y repique a lo largo de la longitud de la cola
3. Separar el tendón del núcleo de la región proximal de la cola.
4. Quitar el tendón hacia la región distal de la cola para evitar la vaina con pinzas dentadas.
5. Extracto de 1 g de tendón / 250 ml de 0,5 M de ácido acético por agitación a 4 º C durante 48 h.
6. Centrifugar (7.500 xg) durante 30 minutos y desechar el sedimento.
7. Añadir un volumen igual de 10% (w / v) NaCl al sobrenadante, y se agita durante 30-60 min.
8. Centrífuga (10.000 xg) durante 30 minutos, descartar el sobrenadante y volver a disolver el precipitado en 0,25 M de ácido acético en una proporción de 1:1 ~ por agitación durante 24 horas a 4 ° C.
9. Dializar la solución de colágeno en contra de 6-8 cambios de 6L ~ 17,5 mM de ácido acético (1 ml de ácido acético glacial por litro de agua fría, el cambio de 2 veces al día).
10. Centrífuga dializados colágeno a 30.000 xg durante 1,5 horas.
11. Aspirar el sobrenadante y el lugar en el frasco estéril.
12. Ajustar el colágeno I concentración de ~ 2 mg / ml con 0,5 mM de ácido acético a 4 ° C.

3. Etapa II - Creación de la matriz 3D con fibroblastos embebidos (permite contratar durante 8 días).

1. Montar la mezcla con los reactivos en frío a 4 ° C en una botella de pre-enfriado. Mantenga a que el colágeno en el hielo.
2. Para un frasco de T75 confluente fibroblastos primarios (~ el número de células 1 x 10 ⁶⁾ se utiliza:
   • 25 ml de cola de rata colágeno (aprox. conc 2mg/ml)
   • 3 ml 10xMEM
   • 0,22 M NaOH: en primer lugar, añadir 2 ml, y luego, gota a gota mientras se agita, hasta que el colágeno se torna naranja,
   • pero no de color rosa (generalmente hasta 3 ml). P aproximado ^H = 7,2.
   • Nota: Es importante asegurarse de que el medio / gel permanece neutro o ligeramente ácido, como los fibroblastos no se contrae el gel si se expone a ligeramente alcalino.
3. Trypsinise los fibroblastos, giran a 400 xg durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
4. Durante 5 minutos por encima de giro: Prepare 12 x 35 mm platos de plástico - normalmente alcanzar 12 platos de un frasco de fibroblastos / mezcla de colágeno.
5. Vuelva a suspender los fibroblastos en 3 ml de FCS, e inmediatamente después a la mezcla de colágeno y revuelva.
6. Placa de aproximadamente 2,5 ml de colágeno / fibroblasto por plato tan pronto como sea posible. Trate de evitar las burbujas y la creación de colágeno.
7. Deje que el colágeno a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ en el aire durante 10 minutos.
8. Añadir 1 ml de medio de crecimiento de fibroblastos (DMEM + 10% FCS).
9. Separe la matriz de colágeno / fibroblasto de los lados de la cápsula, utilizando una pipeta.
10. Al día siguiente: Añadir 1 ml de medio de crecimiento de fibroblastos (DMEM + 10% FCS).
11. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Permitir colágeno / fibroblasto de la matriz se contraiga durante aproximadamente 8 días, hasta que encajen en una placa de 24 pocillos (contracción de ~ 3,5 cm a 1,5 cm de diámetro, ver Figura 1).

Nota: La concentración de colágeno se debe ajustar para adaptarse a la aplicación. Cuanto más se diluye la solución de colágeno, más rápido será contratado por los fibroblastos. Pequeñas diferencias en el ritmo de contracción se experimentará con diferentes lotes de colágeno en la misma concentración. Del mismo modo, las diferentes culturas de fibroblastos se contraerá los geles de colágeno a un ritmo diferente, y presentar los fibroblastos, más rápido el ritmo de contracción. Concentración de colágeno y la densidad de los fibroblastos, por consiguiente, ajustado a modificar el ritmo de contracción,y la densidad final del gel de colágeno.

4. Etapa II - Revestimiento de las células de interés en la parte superior de la matriz

Nota: Esterilice todas las pinzas y el equipo con etanol antes de su uso.

1. El uso de pinzas romas, mueva suavemente la matriz contratado para 24 y plato. Asegúrese de que no se pliega.
2. Prepare una suspensión de células de interés de aproximadamente 4 x 10 1 ml ⁴ / ml y una placa (después de trypsinising, girar las células para deshacerse de la tripsina) en la parte superior de la matriz. El número real de células necesarias pueden variar dependiendo del tipo de célula utilizada. Medio celular debe ser un medio de crecimiento normal de las células de interés.
3. Permiten a las células a crecer hasta la confluencia en la parte superior de la matriz, de aproximadamente 3-5 días.

5. Etapa III - La transferencia de la matriz a una red para la invasión (aproximadamente 0-21 días)

1. Cortar las rejillas de acero inoxidable para crear un trípode y un autoclave antes de su uso (ver Figura 2).
2. Colocar malla estéril en una fuente de 6 cm, añadir medio de crecimiento a un nivel por encima de la rejilla (aprox. 10.5ml). Lugar de la matriz en la parrilla y con cuidado aspirar los medios de comunicación por lo que la parte inferior de la matriz está en contacto con los medios de comunicación, pero no sumergida. Esto se conoce como la interfase aire / líquido, lo que crea un gradiente que promueve la invasión. Vuelva a colocar medio cada dos días (ver Figura 2).
3. De células vivas, imágenes contextuales usando células fluorescentes se pueden visualizar en esta etapa o antes. El colágeno fibrilar contratados o que se pueden visualizar utilizando la generación de segundo armónico (SHG, ver figura 3). El uso de múltiples fotones de excitación combinada con un amplio campo de detección, encontramos que los grupos de autoayuda pueden ser reflejados por lo menos 100 m en la matriz, mientras que las células que expresan GFP citoplasma se pueden visualizar por lo menos 200 m de profundidad.

Nota: Con respecto a la cuantificación de la invasión, el día en que matricies se colocan en las redes define el día 0. Colocación en redes genera un gradiente de medios de cultivo celular que promueve la invasión de la matriz. Las muestras se pueden visualizar en los próximos 1 a 21 días (o más) para evaluar los procesos biológicos, como la invasión, la proliferación, la supervivencia o diferenciación (Ver la lista de referencia).

6. Etapa IV - Fijación

1. Añadir 5 ml de PFA al 4% en un tubo Falcon.
2. Transferencia de la matriz sobre una superficie plana. Corte la matriz por la mitad con un nuevo bisturí limpio (como se le mancha la sección transversal), levante la matriz con el bisturí y la transferencia de PFA al 4%, solución durante la noche.
3. Matrices organotípicos Ahora está listo para teñir con anticuerpos / mancha de la elección (ver Figura 3).

7. Los resultados representativos:

Figura 1 Ejemplo de fibroblastos-colágeno contraído I. Mezcla de fibroblastos y el colágeno cola de rata separado de la placa de Petri y se deja más de contrato 6-8 días.

Figura 2 progresión ensayo organotípicos. Un esquema de conjunto organotípicos y progresión. B, Ejemplo de matriz de colágeno / fibroblasto en la parte superior de acero inoxidable, malla estéril para crear interfase aire / líquido.

Figura 3 Las solicitudes de ensayo organotípicos. A, B adenocarcinoma de páncreas no es invasivo y ductal invasivo (PDAC), las células invasoras a través del tiempo con la matriz organotípicos. C, equivalente a piel viva que muestra una epidermis estratificada en un fibroblasto contratados componente dérmico de colágeno. D, C8161 células del melanoma invasor en un fibroblasto contratada equivalente de colágeno dérmico. E, que invada las células PDAC (verde), que interactúan con los fibroblastos y la invasión (en rojo) dentro de la matriz organotípicos. F, que invada las células PDAC (verde), que interactúan con una degradación de la matriz extracelular circundante (púrpura) visualizan mediante multifotónica basado en la generación del segundo armónico.

Discusión

Aquí presentamos un método para la producción de una matriz de tres dimensiones adecuadas para el estudio de la migración de células invasivas ^6-8. La matriz está formada por colágeno tipo 1 fibrillas, que son contratados por un período de varios días por fibroblastos primarios epidérmico humano. El colágeno es extraído el ácido, la digestión no enzimática, que conserva la reactividad en los extremos de poli-péptido y promueve el entrecruzamiento de las fibrillas de colágeno en grandes agregados en la neutralización de ⁹ de las condiciones de amortiguación. Esto se traduce en un gel reconstituido que más se asemeja mucho a las características de colágeno en vivo y tiene importantes consecuencias para la capacidad invasora de las células cultivadas en los geles. No importa si el material de partida fresca o congelada se utiliza, pero el uso de colas de ratas adolescentes es importante porque la reticulación del colágeno es más lábil en animales más jóvenes. Colágeno I de los animales más jóvenes por lo tanto, es más fácil de extraer y re-constituye con mayor fidelidad.

La matriz de colágeno pueden ser fijadas y teñidas con anticuerpos dirigidos contra cualquiera de las células tumorales invasoras o los fibroblastos del estroma ^2,10 y son muy útiles para probar la eficacia de los fármacos que pueden inhibir la invasión ^5,6.

Aunque este protocolo sugiere el uso de primaria fibroblastos de piel humana, es factible el uso de fibroblastos primarios de otros tipos de tejidos, de acuerdo con el tipo de tejido bajo investigación. También es posible establecer cultivos con fibroblastos inmortalizados, incluyendo las células que han sido transfectadas establemente con los conjugados proteína fluorescente. De esta manera, las células del estroma y los tumores pueden ser etiquetados para visualizar interacciones célula-célula durante la invasión ^11.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
MEM 10 veces	Gibco	21430	-
NaOH	Sigma	367176-500G	Prepare 0,22 M de valores en el agua
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
Placas de 35 mm	Halcón	353001	Para el paso 3.4
Placas de 60 mm	Halcón	353004	Para el paso 5.2
Primavera pinza roma	Samco	E003/02	Dientes, no sin problemas
16% de paraformaldehído	Electron Microscopy Servicios	15710	Diluir al 4% en PBS antes de su uso
Pantallas de cd-1, el tamaño de malla de 40	Sigma	S07707-5EA	Rejillas de acero inoxidable, 5 por paquete
Tubos de diálisis	Medicell Internacional	7607 2295	12 a 14 kD
PBS	Oxoid	BR0014G	-
Ácido Acético	Sigma	242853	-
24 platos y	Halcón	353047	Para el paso 4.1
Fungizone	En Vitrogen	15290018	-