La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Resumen

Una técnica de la litografía plasma versátil se ha desarrollado para generar patrones estables de superficie para guiar la unión celular. Esta técnica puede ser aplicada para crear redes de células, incluyendo las que imitan los tejidos naturales y se ha utilizado para el estudio de varios tipos, distintos de células.

Resumen

Manipulación sistemática de un microambiente celular con una resolución de la micro y nanoescala es a menudo necesaria para descifrar varios fenómenos celulares y moleculares. Para cumplir con este requisito, hemos desarrollado una técnica de la litografía de plasma para manipular el microambiente celular mediante la creación de una superficie modelada con tamaños que van desde 100 nm a milímetros. El objetivo de esta técnica es ser capaz de estudiar, de forma controlada, el comportamiento de las células individuales, así como grupos de células y sus interacciones.

Este método de litografía de plasma se basa en la modificación selectiva de la química de la superficie de un sustrato por medio de proteger el contacto del plasma de baja temperatura con un molde físico. Esta protección selectiva deja un patrón químico que puede guiar a la adhesión celular y el movimiento. Este patrón o plantilla de la superficie, se puede utilizar para crear redes de células, cuya estructura puede imitar a la que se encuentra en la naturaleza y produce un ambiente controlable para las investigaciones experimentales. La técnica es muy adecuada para el estudio de fenómeno biológico que produce patrones estables en la superficie transparente de sustratos poliméricos en forma biocompatible. Los patrones superficiales durar semanas o meses y puede guiar la interacción con las células de largos periodos de tiempo que facilita el estudio a largo plazo de los procesos celulares, tales como la diferenciación y la adaptación. La modificación a la superficie es principalmente de naturaleza química y por lo tanto no introduce interferencia topográficos o física para la interpretación de los resultados. Asimismo, no se recurra a ninguno de sustancias duras o tóxicas para alcanzar los patrones y es compatible para el cultivo de tejidos. Además, puede aplicarse para modificar los diferentes tipos de sustratos poliméricos, que debido a la capacidad de sintonizar sus propiedades son ideales para y se utilizan ampliamente en aplicaciones biológicas. La resolución a alcanzar también es beneficioso, como el aislamiento de procesos específicos como la migración, adhesión o unión permite observaciones discretas, claro en la única a nivel multicelular.

Este método ha sido empleado para formar redes de tipos de células diferentes para las investigaciones relacionadas con la migración, la señalización, la formación de tejido, y el comportamiento y las interacciones de las neuronas instruido de cargos en una red.

Protocolo

1. La creación de moldes para modelar

1. Diseño conceptual de los patrones. Patrones se crean que sirven para formar redes de telefonía, póngase en contacto con el control de células, aislar las células, imitar las estructuras naturales, o de lo contrario guía de adhesión celular y la colocación.
2. Asistido por ordenador o de creación de diseños CAD basada del patrón y la creación de fotomáscaras. El patrón deseado se ha diseñado en el software de CAD, como AutoCAD, y se envía a una empresa externa para la producción de una fotomáscara.
3. Fotolitografía para producir el patrón principal. Portaobjetos de vidrio siguen el modelo, ya sea con un resultado positivo delgada resistencia o negativa de grosor resisten dependiendo del tamaño de la estructura se está creando. Portaobjetos de vidrio se utilizan para sus beneficios de ser de bajo costo, más fuerte que las obleas de silicio y que no produce polvo tanto cuando se rompen. Por otra parte, otras estructuras convenientes tales como redes de difracción se puede utilizar como el modelo maestro.
4. La diapositiva patrón se une a un montón de diapositivas que no han sido modelados. Todos los pasos se llevan a cabo dentro de una campana de flujo limpia para minimizar el polvo.
5. Creación de moldes principales. Un recipiente con un poco más grande que la pila de láminas de papel de aluminio se ha creado para celebrar los 30 g de polidimetilsiloxano (PDMS), que se vierte sobre la superficie photolithographically patrón para crear un molde inicial. El PDMS se desgasifica y se dejó curar durante uno o dos días.
6. Una vez curado el PDMS se despega del modelo maestro y forma un molde para el siguiente paso.
7. 6 g de epoxi parte 2 (# 14310 Devcon (6 g) se mezcla durante 1 minuto y luego se vierte en el molde maestro, se desgasifica y se dejó curar. Desgasificación la resina se debe hacer rápidamente (<8 min) con muchas burbujas romper los ciclos y con sólo una fina capa antes de que los conjuntos de epoxy y la eliminación de burbujas se convierte en imposible de eliminar las burbujas. El G-6 utilizados produce una fina capa que facilita la eliminación rápida de burbujas.
8. Después de una hora, el epoxi parte 2 será parcialmente curado epoxi y más se pueden añadir en la parte superior sin desgasificación para producir una estructura más gruesa que es easer de manejar en los pasos posteriores. El epoxi se deja curar durante uno o dos días.
9. Una vez curado, la resina se extrae del molde maestro PDMS y la cinta se envuelve alrededor del molde de epoxy para formar un recipiente. Un molde de trabajo, se crea mediante el vertido de PDMS sobre el molde de epoxy, desgasificación del PDMS, y la curación de uno o dos días.
10. Una vez curado, el molde de trabajo se despega de la resina y se almacena para mantener la limpieza.

2. Los patrones de las superficies de los moldes para la orientación de células

1. Pequeñas secciones del molde de trabajo se cortan y se coloca sobre una placa de Petri de poliestireno. La ubicación de estas secciones del molde están etiquetados.
2. Un trípode está formado por las secciones pequeñas y ponderados para asegurar el contacto entre el molde de conformación de trabajo y la superficie de la placa de Petri. La buena ubicación se puede observar al mirar en el fondo del plato.
3. El conjunto se coloca en la cámara de plasma. Tratamiento con plasma se ha iniciado y continuado a 150 Pa a 29,6 W (potencia máxima) durante 10 minutos con aire de plasma.
4. Después del tratamiento de plasma, el molde y acusación de peso se eliminan.
5. La placa de Petri se coloca bajo luz ultravioleta durante 10 minutos de la esterilización en el interior del gabinete de bioseguridad y se almacena allí hasta sembrada con células.

3. La siembra de las superficies con las células

1. Células SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastoma humano o de otro tipo se cultivan a través de protocolos estándar para el tipo de célula.
2. La confluencia de la SH-SY5Y CRL-2266 células de neuroblastoma humano se mide visualmente antes de la siembra en la superficie modelada.
3. División celular estándar se lleva a cabo para eliminar las células de la superficie de su placa de Petri.
4. Las células, flotando, una vez libre, se siembran en la superficie de la placa de Petri con dibujos después de ser diluido para lograr la confluencia deseada cuando se coloca sobre la superficie modelada.
5. Las células se asientan y se adhieren a la superficie.
6. El plato Petri patrón se incuba durante varias horas a varios días, mientras que las células de montar en el modelo creado por el plasma.
7. Cuando el cultivo de las células del neuroblastoma, el ácido retinoico (10 M) se añaden a diario con el fin de inducir la diferenciación de las células en un estado de tipo neuronas. La adición del ácido retinoico se realiza en la oscuridad.
8. El ácido retinoico es por día durante varios días, después de que la diferenciación se podrán observar.
9. Los medios de comunicación se sustituye cada 3-4 días.

4. Observación y Análisis

1. Imágenes periódicas de las células vivas o videos se toman con el fin de observar el comportamiento de la célula a través del tiempo. Para las imágenes en vivo, las células se colocan en un microscopio de fase superior incubadora que mantiene las células a 37 ° C CO, 100% de humedad y 5% _2. Las células también pueden ser fijados y teñidos para su observación en la fluorescencia
2. Las imágenes o videos de las células que han sido capturados son importados a un sistema de análisis de imágenes y mediciones se llevan a cabo entre la tasa de crecimiento, tamaño de la celda, la velocidad de la migración, la diferenciación, la alineación, la localización de proteínas específicas, entre otros.

5. Los resultados representativos:

Un resultado típico de la aplicación de la técnica de la litografía de plasma es la formación de un patrón de células que se asemeja a una estructura arbitraria o natural. Esto se ve en la Figura 1a-b, donde las líneas y redes de neuronas se han creado. Otros tipos de células se pueden utilizar, así como se ve en la figura 1c-d, lo que demuestra Humanos de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) y C2C12 células del músculo esquelético que forman las redes. Materiales tales como poli-l-lisina también puede ser modelada, la figura 1e para facilitar la fijación de ciertos tipos de células y para otros usos. En el caso de las neuronas se muestra, lo que se crean redes de células que tienen conexiones entre ellas. Esto reproduce lo que ocurre naturalmente en el cerebro donde las neuronas tienen conexiones discretas entre las células vecinas que influye en el funcionamiento del cerebro. Con la creación de una estructura en el laboratorio, el número, localización, frecuencia y otros factores de las conexiones puede ser controlado de manera sistemática. El resultado de estas comparecencias se puede medir visualmente y aportes adicionales tales como la química o la estimulación eléctrica se puede implementar para investigar el comportamiento de la red.

Un resultado negativo sería un patrón de maleza o incompleta, o una muestra contaminada. Un patrón incompleto o agrandamiento de que el resultado de la siembra del sustrato con células muy pocos o demasiados que no proporcionaría el modelo con una cantidad ideal de las células. Además, si el patrón no está diseñado correctamente (por ejemplo, las líneas demasiado estrecha), las células no serán capaces de unir y crecer con éxito en él. En el caso de una muestra contaminada, la limpieza adecuada no se han mantenido durante uno de los pasos, aunque esto es raro cuando se sigue el protocolo adecuado de cultivo celular, debido al hecho de que el patrón de plasma también esteriliza el sustrato.

Figura 1. Patrones de células y proteínas.

Discusión

El método de investigación de células que aquí se presenta permite la creación de patrones complejos de redes multicelulares que imitan las estructuras biológicas, así como proporciona un método para producir estímulos que son subcelular en la naturaleza que a su vez facilita la investigación de los comportamiento de las células agrupadas y las respuestas de células individuales a factores ambientales. El uso de este método es simple, pero fuerte, ya que puede realizarse rápidamente con equipos de bajo costo en el mismo laboratorio como el cultivo celular. También es muy sensible a la célula, permite una fácil observación de la conducta resultante y es, por naturaleza estable durante largos períodos, lo que permite la investigación de comportamiento a largo plazo de células. Es, además, permite una amplia gama de experimentos a realizar, ya que es compatible con muchos tipos de células y puede crear patrones arbitrarios. La estabilidad a largo plazo de la técnica deriva del hecho de que la funcionalización superficial impartida por el plasma es parte de la superficie y no es una capa o una capa de otros que pueden ser eliminados o degradados. Si se mantiene bajo agua, este tipo de modificación puede conservar su capacidad de orientación para celulares meses.

La parte más crítica de la experiencia necesaria para garantizar resultados significativos es el de crear el modelo maestro que en última instancia será utilizado para la orientación de la célula. Si este patrón no está bien diseñado, las células no se ajustará adecuadamente a la estructura y no puede producir un comportamiento útil. Parámetros como el ancho de línea, el espacio de patrones, y otros pueden influir mucho en la compatibilidad de células con un patrón determinado, y por lo general una serie de parámetros como pueden ser creados en la fotomáscara inicial para detectar el diseño más apropiado.

Otros parámetros importantes relacionados con la ejecución del patrón incluyen la creación del molde, el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, la siembra de células y la esterilidad general de cultivo de células. La creación del molde se puede efectuar por los pasos sucesivos traslados que se llevan a cabo para permitir repetir PDMS arrojando un molde de epoxi. El molde de epoxy se crea debido a que no se degradará de la misma manera como resistir el moho con estructuras pequeñas, de alta relación de aspecto en fundición repetida. Si el moldeo por transferencia se hace correctamente, las dimensiones y el rendimiento no se verá afectada, pero si se hace incorrectamente, como por el mal de desgasificación, la curación incompleta, o calor excesivo, las burbujas, la aspereza y la deformación de un patrón puede ocurrir que afecta el resultado final. En relación con el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, el moho se debe mantener lo más limpio posible, ya que el polvo puede interferir con el contacto adecuado entre el molde de trabajo PDMS y la superficie y por lo tanto adecuada protección de plasma y los patrones químicos. La densidad de siembra de las células también deben ser optimizados para asegurar que ni las células de muy pocos o demasiados habitan en el área de diseño y la esterilidad se debe mantener para evitar la contaminación bacteriana y otras de las células que se utiliza.

La técnica también se pueden incorporar otros elementos como la microfluídica, microelectrodos, sondas y mecánica. Esto ofrece estímulos adicionales a las células con el fin de reproducir mejor los distintos estados fisiológicos durante la experimentación y el trabajo futuro se centra en estudiar los efectos de estas combinaciones

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Limpiador de plasma y cámara de vacío	Harrick Plasma	PDC-001
Fluorescencia invertido y el microscopio de contraste de fase	Nikon	TE2000-U
Microscopio etapa superior incubadora	AmScope	Modelo TCS-100	Modificado para incluir un recinto que proporciona un ambiente adecuado
Placa de Petri de poliestireno	VWR	25384-090
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy	Devcon	2 ton claro epoxi # 14310
Medios de cultivo celular	Varios		Los medios de comunicación sigue las fórmulas habituales para el tipo de células
El ácido retinoico	Sigma	R2625