RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Resumen

En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic Pristionchus pacificus Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.

Resumen

A pesar de que es cada vez más asequibles para los organismos modelo emergente para obtener genomas secuenciados completamente, más a fondo la función de genes y análisis de expresión de ARN de interferencia y la transgénesis estable siguen siendo limitados en muchas especies debido a la anatomía particular y la biología molecular celular del organismo. Por ejemplo, en las afueras de la corona Caenorhabditis grupo que incluye Caenorhabditis elegans ^3, de forma estable de transmisión en las líneas transgénicas no Caenorhabditis especies no han sido reportados en este phylum engañosa (Nematoda), con la excepción de Strongyloides stercoralis ⁴ y ⁵ Pristionchus pacificus. Para facilitar la ampliación del papel de P. pacificus en el estudio del desarrollo, la evolución y el comportamiento de ^6-7, se describe aquí los métodos actuales para el uso de microinyección para la fabricación de animales transgénicos y knock por RNAi. Al igual que las gónadas de los P. pacificus es sincitial y capaz de incorporar el ADN y ARN en los ovocitos cuando se entrega por microinyección directa. A diferencia de C. elegans Sin embargo, la herencia del transgén estable y la expresión somática en P. pacificus requiere la adición de ADN genómico digerido con endonucleasas auto complementario a los extremos de los transgenes blanco y marcadores coinyección ^5. La adición de ADN genómico de transporte es similar a la necesidad de expresión del transgen en Strongyloides stercoralis ⁴ y en las células germinales de C. elegans. Sin embargo, no está claro si el requisito específico de ADN de los animales genómica propia se debe a P. pacificus soma es muy eficiente en el silenciamiento no complejos multi-copia genes o conjuntos de extracromosómico en P. pacificus requieren secuencias genómicas para el montaje adecuado cinetocoro durante la mitosis. La migración ventral de la (de dos brazosdidelphic) en las gónadas hermafroditas complica aún más la capacidad de inyectar ambas gónadas en los gusanos individual ^8. También demostrar el uso de microinyección para derribar un mutante dominante (rodillo, tu92) mediante la inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en las gónadas para obtener información no rodar progenie F _1. A diferencia de C. elegans, pero como la mayoría de otros nematodos, P. pacificus PS312 no es receptiva a RNAi sistémico a través de la alimentación y el remojo y por lo tanto dsRNA debe ser administrado por microinyección en las gónadas sincitial. En este estudio, esperamos que para describir el proceso de microinyección necesarias para transformar un promotor PPA-EGL-4:: reportero GFP fusión y caída de un rodillo dominante prl-1 (tu92) mutante en un protocolo informativo visual.

Protocolo

1. Transgénesis: la preparación de ADN

1. Dominante co-inyección marcador: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)]
   El pRL3 plásmido es un dominante co-inyección marcador para identificar visualmente los eventos exitosos de transformación. Este plásmido codifica para un alelo mutante dominante (tu92) del gen de la PPA-prl-1 estrechamente relacionado con el SQT-1 gen del colágeno en el C. elegans y transforma la locomoción sinusoidal de tipo salvaje en las agujas del reloj movimientos de torsión a lo largo del cuerpo del gusano del eje ^1,5. El animal se transforma muy similar a la del marcador de selección populares rol dominante-6 (su1006) que se utiliza en C. elegans en los últimos 20 años.
2. Objetivo reportero transgén: PPA-EGL-4p:: GFP
   Un gen de interés se pueden vincular transcripción o traslación a una secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias ^9. En este estudio, la PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, proteína quinasa dependiente de cGMP) was utilizado para determinar si un fragmento de 2 kb corriente arriba del inicio de la traducción puede conferir la expresión de GFP en P. pacificus PS312. Este vector GFP contiene una región de codificación de las buenas prácticas agrarias con la modificación
   intrones y el polivalente PPA-RPL-23 3 'UTR Terminator ⁵ amablemente proporcionados por Xiaoyue Wang y Ralf J. Sommer (Instituto Max-Planck, Tuebingen, Alemania, UE).
3. ADN genómico: PS312
   La adición de tipo salvaje P. pacificus ADN genómico PS312 es necesario para obtener la herencia del transgén estable, sobre todo a partir de transgénicos animales F ₁ a su progenie F ₂ ^5. No se sabe con certeza si el ADN genómico de las formas complejas matrices de cromosomas extra con los dos transgenes (el marcador de la co-inyección de PRL-3 y el Pap-4p-EGL:: reportero gfp) similares a los observados en el establo de F ₂ en las líneas transgénicas C. elegans ^3. Sin embargo, el requisito de tener el ADN genómico y transgenes a compartir identicavoladizos l coherente sugiere la formación de complejos arreglos extra-cromosómicos de las células huésped puede reconocer en la transmisión adecuada del ADN (ADNg preparado con Sigma G1N10 kit).
4. Digestión del ADN
   Las enzimas de restricción se utilizan para alinear la PPA-EGL-4p:: GFP vector de ADN y producir voladizos pegajosa compatible con el marcador pRL3 co-inyección y ADNg PS312. Homogeneizar golpeando, no agitación. Incubar durante una hora a 37 ° C.

pRL3	4 mg
10xbuffer	10 l
PstI (10 U / l)	4 l
dH 2 O	~
Total:	100 L
Ppa-EGL-4p:: GFP	4 mg
Buffer 10x	10 l
SalI (10 U / l)	4 l
dH 2 O	~
Total:	100 l
ADNg PS312	10 mg
Buffer 10x	10 l
Pst I y Sal I (10 U / l)	L 8
dH 2 O	~
Total:	100 l

Tabla 1. Mezcla de enzimas de restricción implícita.

5. ADN precipitación y la preparación
   1. Añadir acetato de sodio 01:10 (3 M NaCOOCH ₃ pH 5,2) y 2,5 veces el volumen de etanol al 100% para el producto digerido, añadir 20 ng / l de glucógeno para ver pellet más fácil.
   2. Centrifugar a14.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C.
   3. Se decanta el sobrenadante inclinando lentamente el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel, asegurándose de que la pastilla es segura en la parte inferior del tubo y libre de etanol.
   4. Añadir 1 ml de etanol al 75%.
   5. Inmediatamente girar a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C.
   6. Decantar el sobrenadante por lentamente inclinando el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel asegurando que la pastilla que seguro en la parte inferior del tubo y libre de etanol.
   7. Seco en pelets en centrífuga de vacío a 14.000 rpm durante 5 minutos a 25-30 ° C, hasta que se seque y completamente libre de etanol.
   8. Añadir 30 l de TE o estéril dH ₂ O y dejar toda la noche a 4 ° C antes de mezclar brevemente con un vórtice.
   9. La Tabla 2 describe cómo crear la mezcla de inyección de cada ADN purificado para inyección.
   10. Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla en elinyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para eliminar partículas de desechos que pueden obstruir la aguja de la inyección.

Material genético	Concentración
Ppa-EGL-4p:: GFP (SalI)	> 5 ng / l (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 ng / l
ADNg PS312 (PstI + SalI)	> 60 ng / l
dH 2 O	~
Total:	30 l

Tabla 2. Mezcla de Pap-prl-1 de la inyección

2. La interferencia de ARN: In vitro la síntesis de ARN de doble cadena

1. El uso de PCR para amplificar el gen de interés. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI) y 5'-RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 '(sitio PstI) se utilizaron para amplificar un fragmento de 464 pb genómica (la posición de 3 a 466) a partir del vector pRL3 que contiene el PPA-prl-1 (tu92) alelo.
2. Digerir el producto de PCR con BamHI y PstI.
3. Ligar el fragmento BamHI / PstI digerido pL4440 RNAi alimentación vector ^2.
4. Transformar el vector insertado en células competentes y hacerlos crecer en LB ampicilina placas de los medios de comunicación (50 mg / ml).
5. Seleccione el vector ha entrado con éxito por PCR utilizando los primers T7.
6. Utilice la T7 flanqueado producto de PCR que contiene el gen PRL-1 para hacer ARN de doble cadena dsRNA) usando el bloque-IT RNAi síntesis kit (Invitrogen).
7. La concentración de dsRNA es mejor si> 200 ng / l, hasta 1 mg / l para la inyección.
8. Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla de la inyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para deshacerse de las partículas de los desechos que puedan obstruir los injection de la aguja.

3. Microinyección: Protocolo para la inyección de los transgenes y / o dsRNA

1. Agujas de inyección
   1. Ajuste la aguja Narishige extractor (modelo #: PC-10) la temperatura:
      1. Girar el botón de abajo para "Calentador N º 2".
      2. A su vez la "Adj N º 2 del calentador." panel de mando hasta que se lee 55.0-60.0 ° C durante punta de la aguja cónica de diferentes longitudes.
   2. Gire el botón de abajo de nuevo a "Paso 1" (Saca la aguja en un solo paso).
   3. Carga de agujas en la cámara y asegúrese de que esté seguro.
   4. Pulse el botón "Inicio" (botón rojo) y permitir que la aguja se retiró con todos los pesos (esto debe hacer dos agujas iguales en direcciones opuestas).
   5. Retire la aguja de la cámara y guardar en una placa de cultivo de plástico asegurado en su lugar de Play-Doh para evitar que el polvo se acumule en las agujas.
2. Almohadillas de montaje
   1. En un tubo centrífugo de 1,5 ml, hacer una soluci 2% de agar Noblen mediante la adición de 0,02 g de agar Noble a 1 ml de H ₂ O. El agar se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un año.
   2. Mezclar bien y se funden en un bloque de agar de calor establecido en> 88 ° C.
   3. Usando una micropipeta de 1 ml, colocar una gota de líquido Agar Noble 2% a la media de la lámina de vidrio (Fisher, 12-544-F).
   4. Aplanar mediante la colocación de otra placa de vidrio en la parte superior de la gota.
   5. "Paso Drop" hasta que haya una capa de cinco diapositivas de cristal.
   6. Retire cada lámina de vidrio con deslizar el portaobjetos de vidrio de unos a otros.
   7. Seco aplanar pad agar en placas de vidrio en un horno de vacío a 70 ° C durante 4 horas a un día (o noche a temperatura ambiente).
   8. Hacer pastillas de inyección múltiple y almacenar para uso futuro.
3. Microinyección en las gónadas hermafroditas

Figura 1. Un dibujo esquemático de la P. pacificus anatnomía. Las células nucleadas claro son las células germinales femeninas (ovocitos) y la parte en gris es el intestino. Sólo una gónada anterior distal se muestra, pero el anuncio dos gónadas distal se cruzan entre sí dorsalmente cerca de medio cuerpo.

Figura 2. Imágenes de la microinyección. (A) La punta de la aguja de inyección está en el foco con la línea de la extrema derecha de la pieza tira capilar. Tocando ligeramente la punta de la aguja para que el borde, la punta de la aguja se rompe al tiempo que conserva una punta aguda. (B) Las inserciones de la aguja en la parte superior justo por encima de las gónadas de la curvatura del intestino para la primera inyección. (C) La aguja se inserta en la parte inferior de gónadas justo debajo de la curvatura del intestino para la segunda inyección.

3. 1. Asegúrese de que el contraste y ajuste de corte DIC es ideal para ver las gónadas hermafroditas.
   2. Carga 1.0-2.0 l de mezcla de la inyección en la tiracapilar aguja.
   3. Colocar la aguja en el manipulador de la microinyección, los indicadores de presión del tanque de nitrógeno se debe establecer en las condiciones ideales (10-20 psi para 0,5-1 seg).
   4. Romper la punta de la aguja al tocar ligeramente el borde de un tubo fino capilar sacó coloca en un portaobjetos (figura 2A).
      1. Aguja de diapositivas automático: la parte más delgada de un capilar sacó coloca en un portaobjetos de cristal en una gota de aceite
   5. Una vez que la aguja se rompe se puede colocar en una posición de reposo, mientras que usted escoja su gusano a la plataforma (P. pacificus tiene una ventana de 5 minutos para la inyección antes de que se seca y mueren).
   6. El uso de un plato lleno de gusanos adultos J4-young, vierta el aceite de parafina suficiente (pesado) para sólo cubrir todos los gusanos en el OP50 césped bacteriano.
   7. Elige un gusano y lo coloca en la plataforma de inyección.
   8. Colocar la placa de vidrio con el gusano en el microscopio, la posición gónadas del gusano en la dirección de la aguja y la vulva lejos de la necesidadle (Figura 2B, 2C).
   9. Baje la aguja a la posición de la vista del microscopio.
   10. Posición de la gónada parte superior y la aguja en el mismo plano focal (Figura 2B).
   11. Poke el gusano con cuidado y de la bomba en la mezcla de la inyección; ovocitos que separa hacia el extremo distal indican una inyección de éxito (para optimizar el transgén o entrega dsRNA, usted debe ver a la inyección de una ola de expansión en la gónada, que continúa hasta que se encuentra cerca de la parte distal punta).
   12. Vuelva a colocar la aguja para inyectar a la gónada inferior y repetir la inyección, sin embargo desde esta gónada se encuentra en el intestino la difusión de los ovocitos no se verá por lo que es más difícil de lograr (Fig. 2C).
   13. Gusano de aspecto normal indica una inyección de éxito después de la inyección, no debe haber ningún daño gónadas (que sobresale de la vulva o se extraen dentro de la cavidad del cuerpo).
   14. Vuelva a colocar la aguja en posición de reposo.
   15. Se preparan para rescatar a los gusanos.
   16. Añadir uncaída (0,5 l) de tampón de M9 en la almohadilla donde se encuentra el gusano inyecta.
   17. El uso de algunos OP50 bacterias en su selección, toque el gusano con el OP50, y debe pegarse. Nosotros no usamos pipetear con la boca.
   18. Colocar el gusano en el plato de cabeza de serie con 50 puntos de l OP50, 2-4 gusanos pueden ser rescatados en las placas de tal.
4. Después de la inyección de almacenamiento y cribado para la transgénesis
   1. Tienda inyecta gusanos (P ₀₎ a 20 ° C durante ~ 4 días para poner sus huevos y crecen F _1.
   2. Gusanos de pantalla en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de la transgénesis, búsqueda de animales rodar expresar la PPA-prl-1 marcador dominante).
   3. Solo pico independientes F ₁ 's animales con el fenotipo observado a las nuevas placas sin semillas y guárdela a 25 ° C, esta temperatura favorece la formación de líneas estables de la F _1' s.
   4. F solo _dos de las líneas independientes de F _1. Individuales F ₂ tienen similares tasas de transmisión del transgén. A menudo obtener> 15 F ₂ líneas por transformar _un F animal.
   5. Tienda de las generaciones posteriores a 25 ° C.
   6. La tasa de transmisión de los rodillos por lo general se mantiene constante después de la generación F _4, así que es necesario en este momento para determinar el nivel de expresión de los transgenes de destino (PPA-EGL-4p:: GFP) para cada línea individual. La expresión de GFP puede no correlacionarse con el grado de penetrancia del fenotipo dominante de rodillos.
5. Después de la inyección de almacenamiento y detección de fenotipos RNAi
   1. Tienda inyecta gusanos (P ₀₎ a 20 ° C durante ~ 4 días para descansar y crecer F _1.
   2. Pantalla de F ₁ gusanos en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de fenotipo RNAi desmontables, la búsqueda de fenotipos penetrantes que pueden estar asociados con la pérdida de la actividad del gen objetivo, en nuestro caso la pérdida de la PPA-prl-1 fenotipo).
   3. En nuestra experiencia, el fenotipo caída sin rodillos se pierde en> 97% de la F _2.

4. Los resultados representativos:

1. Resultado de la transgénesis

Sesión	Inyecta P 0	F 1 Rodillos	F 2% transgénicos	% De transmisión promedio después de F 2
1	60	2	(Línea 1) 0% (Línea 2) 13%	NA 13% ± 10
2	40	1 *	(Línea 3) 0%	NA
3	40	0	0%	NA
4	40	1	(Línea 4) 0%	NA
5	20	0	0%	NA
6	40	1	(Línea 5) 26%	22% ± 10

* Un rodillo de hombres que no pasó; NA: No aplica

. Tabla 3 Resultados de la PS312 inyectados con Pap-EGL-4p:: GFP (Sal I digerido), pRL3 (rodillo) (Pst I digerido), y ADNg PS312 (PstI y SalI digerido).

La figura 3 (A) de tipo salvaje (B, C) ​​La estabilidad F ₄ pRL3; Pap-EGL-4P:.: GFP línea transgénica muestra la cabeza de la neurona la expresión de GFP.

2. Resultado de la interferencia de ARN

Figura 4. ARN inyectado prl-1 mutantesmostrar caída completa de "rodar" la locomoción. (A) prl-1 rodillo de ganancia de función de mutantes tu92. (B) "derribado" prl-1 mutante muestra una postura normal de tipo salvaje y la locomoción. (C) inyectado prl-1 (inferior) también tiene más cuerpo que el prl-1 mutante (arriba). (D) El cuerpo de inyección ya prl-1 (inferior) es más largo que el PS312 de tipo salvaje (arriba). El fenotipo de cuerpo por más tiempo también se observó en el rol-5 (SQT-1) caída de RNAi C. elegans N2 (datos no mostrados).

	rollo	no-roll
A prl-1 dsRNA (200 ng / l)	13	21
B-1 prl dsRNA (1000 ng / l)	9	16
control	20	2

Tabla 4. Resumen de la ALP-prl-1 inyecciones dsRNA. (A) [dsRNA] = 200 ng / l (B) [dsRNA] = 1000 ng / l. P = 0,0019 y 0,041 por la prueba exacta de Fisher de dos colas, de 200 y 1.000 inyecciones ng / l, respectivamente.

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Discusión

Las poblaciones de P. pacificus se encuentran en estrecha relación con varias especies de escarabajo en todo el mundo y es un modelo intermedio entre los nematodos de vida libre y nematodos parásitos. La fuerza de la P. pacificus como un organismo modelo emergente radica en la integración de sus mapas genéticos y físicos que promuevan la asignación de posición de los mutantes aislados imparcial pantallas adelante genéticos (es decir, no sólo por los genes candidatos previamen...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Producto:	Catálogo #:	Proveedor:
DMI3000 inyección microscopio	DMI3000	Leica
Microinyector manipulador (transmisión directa)	Narashige BC-3 de rótula	Tritech Investigación
Extractor de agujas	Narashige PC-10	Tritech Investigación
Microinyector ™ Todo-Digital Multi-La presión del sistema	Narashige Minj-D	Tritech Investigación
GeneElute ™ mamíferos ADN genómico Miniprep Kit	G1N70	Sigma
pJet Jet kit de clonación	K1231	Fermentas
GeneJET plásmido kit Miniprep	K0502	Fermentas
ADN Clean & Concentrador ™	D4005	Zymo Investigación
BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® kit de transcripción	K3500-01 y K3650-01	Invitrogen
Agar Difco ™ Noble	DF0142-15-2	Fisher Scientifi
Microscopio cubierta de vidrio (1,5 - 0,16 a 0.19mm de espesor, tamaño: 50 x 45 mm)	12-554-F	Fisher Scientific
Capilares de vidrio (filamento)	615000	Los sistemas AM
Aceite de parafina (Heavy)	O122-1	Fisher Scientific
KH 2 PO 4	P386-500	Fisher Scientific
Na 2 HPO 4	AC20651-5000	Fisher Scientific
NaCl	BP3581	Fisher Scientific
MgSO4	M80-500	Fisher Scientific