Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

Resumen

Este artículo presenta los protocolos de la intrínseca señales ópticas y señales de autofluorescencia flavoproteínas imágenes de mapa de olor evoca las actividades en la superficie del bulbo olfatorio de los ratones.

Resumen

En el cerebro, la estimulación sensorial activa las poblaciones de neuronas distribuidas entre módulos funcionales que participan en la codificación de los estímulos. Técnicas de imagen funcional óptica tienen la ventaja de visualizar la activación de estos módulos en cortezas sensoriales con alta resolución espacial. En este contexto, endógeno señales ópticas que surgen de los mecanismos moleculares ligados a neuroenergetics son fuentes valiosas de cambio para registrar mapas espaciales de los estímulos sensoriales sobre los campos de ancho en el cerebro de roedores.

Aquí, se presentan dos técnicas basadas en los cambios endógenos de las propiedades ópticas del tejido cerebral durante la activación. En primer lugar las señales ópticas intrínsecas (IOS) se producen por una alteración local en la reflexión de la luz roja debido a: (i) la absorción por los cambios en el nivel de oxigenación de la sangre y el volumen sanguíneo (ii) la dispersión de fotones. El uso de IOS en vivo para grabar mapas espaciales comenzó a mediados de 1980 con el observatien los mapas ópticos de barriles bigotes de la rata y las columnas de orientación en la corteza visual del gato ^1. Imágenes de IOS de la superficie de los roedores principales bulbo olfatorio (OB), en respuesta a los olores se demostró más tarde por el grupo de Larry Katz ^2. El segundo enfoque se basa en las señales de autofluorescencia flavoproteína (FAS), debido a los cambios en el estado redox de estos productos intermedios del metabolismo mitocondrial. Más precisamente, la técnica se basa en la fluorescencia de color verde debido al estado de oxidación de las flavoproteínas cuando el tejido está muy entusiasmado con la luz azul. A pesar de estas señales fueron probablemente una de las primeras moléculas fluorescentes registrados para el estudio de la actividad cerebral de los estudios pioneros de Oportunidades Britton y sus colegas ^3, no fue sino hasta recientemente que se han utilizado para el mapeo de la activación cerebral in vivo. FAS imágenes se aplicó por primera vez a la corteza somatosensorial de roedores en respuesta a la estimulación por la pata trasera del grupo Katsuei Shibuki ^4.

El sistema olfativo es de vital importancia para la supervivencia de la gran mayoría de las especies vivas, ya que permite la detección eficaz y la identificación de sustancias químicas en el medio ambiente (alimentos, los depredadores). El OB es el primer relé de procesamiento de la información olfativa en el cerebro. Que recibe proyecciones aferentes del olfato neuronas sensoriales primarias que detectan las moléculas odoríferas volátiles. Cada neurona sensorial se expresa sólo un tipo de receptor odorífero y las neuronas que lleva el mismo tipo de receptor envían sus procesos del nervio al mismo bien definida microrregiones de ~ 100μm ³ constituido por neuropilo discreto, el olfato glomérulos (Fig. 1). En la última década, el IOS de imagen ha fomentado la exploración funcional del OB ^{5, 6, 7,} que se ha convertido en una de las estructuras sensoriales más estudiadas. El mapeo de la actividad de OB con el FAS de imagen no se ha realizado todavía.

En este caso, we muestran los pasos sucesivos de un protocolo eficiente para IOS y las imágenes de mapa de FAS olor evoca las actividades en el OB de ratón.

Protocolo

1. Preparación de los animales para obtener imágenes (de acuerdo con las recomendaciones europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio, la Directiva 86/609/CEE)

1. 6 a 8 semanas de edad C57BL6 ratones machos son anestesiados con una mezcla de ketamina (10mg/kg) y xilazina (100mg/kg) inyectó intraperitonealmente. La cirugía comienza cuando el ratón no responde a pata trasera pellizco. Durante todo el experimento el animal es colocado en una almohadilla térmica. La temperatura corporal es de un seguimiento continuo y se mantiene a 37 ° C. Profundidad de la anestesia se mantiene durante toda la cirugía y la sesión de imágenes por el control de la ausencia de las extremidades retirarse. Una inyección subcutánea de 20% de la inicial cóctel anestésico administrado de otra manera.
2. Usando las podadoras, quitar el pelo del cuero cabelludo. Limpie la piel desnuda de pelo residual mediante el uso de una gasa estéril empapada con una solución salina.
3. Sitúa el cursor en el marco estereotáxico. El hocico tiene que estar en el mismo plano que la parte de atrás de la cabeza,a fin de establecer la superficie del bulbo olfatorio a la horizontal. Asegure firmemente la oreja y la nariz con el fin de bares para evitar movimientos durante la exploración.
4. Aplique una pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad y el dolor.
5. Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol 70 ° y el cuero cabelludo con barridos sucesivos de betadine.
6. Para eliminar la piel que cubre el cráneo, comienza haciendo una incisión en la piel con unas tijeras en la parte posterior de la cabeza entre las orejas. Luego se corta en dos partes hacia la base de la oreja y en la dirección antero-posterior hacia el frente, a lo largo de los párpados. Terminar de quitar el cuero cabelludo por el corte de la piel en la parte superior del hocico cerca de la barra de la nariz.
7. Bajo observación binocular, use un hisopo de algodón empapado con una solución salina para separar suavemente el periostio en la parte superior del cráneo. Use unas pinzas para extraer el tejido restante y raspar la superficie del cráneo con un bisturí para tener una preparación limpia.
8. El OB es una estructura simétrica compuesta de dos hemibulbs que se encuentran entre los párpados. Están limitados en la rostral y caudal en la dirección de un seno venoso, y separados por la sutura sagital. Coloque un pedazo de esponja de gelatina absorbible empapado con agua destilada en el hueso por encima del OB. Es importante mantener esta área del hueso húmedo durante todo el experimento.

2. Preparación de la ventana craneal

1. Quite la esponja de gelatina y empezar a raspando suavemente el hueso con el n º 10 hoja de bisturí. Mantener un ángulo constante de 45 ° entre la hoja y el hueso, y mover la hoja de los párpados al lado sagital de los campos de tulipanes. No aplique una presión vertical sobre el hueso o el principio del hueso por encima del seno venoso.
2. Durante el proceso de adelgazamiento, parar cada 5 minutos y colocar una esponja de gelatina hidratada en el hueso que se enfríe la preparación. Limpie la cabeza con la esponja para quitar el polvo de hueso.
3. Mantener barrido yde refrigeración, alternativamente, hasta que la visualización de las trabéculas, la capa de hueso esponjoso. La vasculatura fina del OB debe ser visible en esta etapa. Dejar de rascarse el hueso, y comenzar a usar la punta del bisturí de forma perpendicular a "dibujar" un área rectangular que encierra el OB. En esta etapa, n ° 11 hoja de bisturí puede ser utilizado. Mantener la operación dentro de los límites de los senos venosos que debe ser seguro de cualquier golpe de bisturí.
4. Excavar la zanja de forma gradual rectangular con movimientos sucesivos del bisturí. Limpie la punta del bisturí periódicamente para limpiarlo y mantenerlo fuerte. Tenga mucho cuidado con la profundidad de la punta para evitar el contacto con la superficie dura.
5. Con el fin de tener una idea del grosor del hueso restante, presione suavemente con la punta de un par de pinzas. Si los pliegues colgajo óseo bajo presión, pasar a la siguiente etapa.
6. Bajo una gota de solución salina, utilice la punta del bisturí orientado horizontalmente para levantar el colgajo óseo. La eliminación de la aleta se tiene que hacer carefully para evitar que se rompa el hueso restante.
7. Una vez que la superficie de la OB está expuesta, comprobar la ausencia de sangrado o anastomosis de los vasos sanguíneos. Hiriendo a la duración o la superficie del tejido se reducen las posibilidades de obtención de las señales ópticas. Limpie el área con una esponja de gelatina empapada en una solución salina para mantener la humedad del bulbo.
8. Aplique el cemento dental poliacrilato para formar un pozo en el hueso alrededor de la ventana.
9. Ponga una gota de bajo punto de fusión de agarosa (1,2%) a lo largo de la dura, y poner una cubierta de vidrio estéril en las dimensiones de la ventana. Durante la sesión de imágenes, una pequeña cantidad de agarosa se puede agregar a fin de compensar la deshidratación. Agarosa evitará que el OB se mueva con la respiración y proporcionar una superficie plana para la obtención de imágenes ópticas.

3. Configuración de imagen óptica para el mapeo de la actividad olfativa

1. La estimulación olfativa debe ser definido con precisión en el tiempo y la intensidad de la utilización de un olfatómetro. Utilizamos una versión modificada de costumbre MultiVial sistema de perfusión 8II Valvebank de Automatización de la Ciencia básica asociada a un compresor de aire (aire comprimido respirable sería adecuado también). Este sistema permite un control preciso de la válvula rápida y externos. Las soluciones de olor puro se diluyen en aceite mineral en la concentración elegida. Para activar los aldehídos dorsal OB como hexanal se utilizan comúnmente. Un volumen preciso de la sustancia olorosa diluida (20 a 50μl) se carga en un papel de filtro y se coloca en un depósito de la jeringa. A través del sistema de perfusión, la presión de aire controlado se entrega al sistema, asegurando una velocidad constante de entrega odorizado flujo de aire en la nariz de los animales durante la apertura de la válvula. Olor se entrega a través de un tubo Tygon R-3603 de vacío (Saint-Gobain Corporation) llevar el aire a un caudal de ~ 1000ml/min. Evitar la contaminación entre los olores y cantidad de residuos de olor en el tubo. Si está disponible, la reproducibilidad de los estímulos de olor puede ser controlled a través del uso de un detector de ionización de llama (2020 microFID Photovac).
2. La configuración óptica está encendido. Se trata de un enfriado entrelazado 12 bits cámara CCD (ORCA AG Hamamatsu) asociado con un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Leica MZ16), un olfatómetro controlado por ordenador y se estabilizaron las lámparas de excitación con las correspondientes filtros de banda de interferencia. Un esquema que describe nuestra configuración se proporciona en la figura 2. Para intrínseca señales ópticas de imagen (IOSI), una lámpara halógena de tungsteno de 200W (Oriel QTH), junto con un anillo de luz de fibra (Schott) conectado todo el objetivo del microscopio se utilizan para proporcionar una iluminación estable y uniforme. Para flavoproteína autofluorescencia señales de imagen (FASI), una lámpara de metal Halide 150W (Leica) con una guía de luz líquida central 5mm proporcionar incluso la excitación de la fluorescencia localizada a través del puerto de epi-iluminación de la lupa binocular.

   Adquisición de la imagen y la sincronización de hardware se realiza por software a la medida. La s abiertauente micromanager software también se puede utilizar para controlar la configuración óptica y la adquisición.

4. Imágenes ópticas

1. Coloque el marco estereotáxico bajo el microscopio estereoscópico, la ventana del cráneo centrada en el campo de visión (ver fig. 2A para un esquema de la configuración óptica).
2. Ajustar el microscopio para centrarse en los capilares. Antes de los ensayos de estimulación (ver descripción en 5) una imagen de la bombilla se toma en 560nm (verde) luz (anillo de fibra), que proporciona un buen contraste para la imagen de los vasos sanguíneos. Esta imagen se utiliza como control anatómica para comprobar el estado de la preparación y se adquiere en varias ocasiones durante el experimento.
3. Para IOS de imagen, refleja la intensidad de la luz es grabada por la cámara CCD con 630 + / -10 nm (rojo) de iluminación. Las imágenes se adquieren en el fotograma completo (sin hurgar en la basura) a 5 fotogramas por segundo que corresponden a un tiempo de exposición de alrededor de 150 ms. El poder de la fuente de luz se ajusta de nuevo ada niveles de grises de por lo menos ~ 3000 en el área de obstetricia, cerca de la saturación de los pozos CCD píxeles. Si lo hace, lo hace posible para aprovechar la dinámica de 12bits de la CCD para capturar los cambios de intensidad débil durante la activación. Máxima IOS amplitudes llegar a aproximadamente el 1%.
4. De FAS imágenes de fluorescencia se adquiere bajo la excitación de 480nm + /-20nm (azul) epiflurorescence. Un filtro de paso alto a 515nm está configurado para capturar la luz. Las imágenes se adquieren en 5 fotogramas por segundo con un binning de 4 por 4 para maximizar la sensibilidad. Potencia de excitación de luz se ajusta de manera similar a IOS con niveles de gris de 3000 en el área de obstetricia. Máxima amplitud FAS llegar a 3%.

   Para ambas modalidades de imagen, la profundidad de campo en el plano sujeto es el mismo y se midió en 0,5 mm para un aumento de alrededor de 4 veces.

5. La luz debe estar apagada entre las pruebas de imagen para evitar el calentamiento y photobleaching de la preparación.

le "> 5. Imágenes ensayos

1. Sesión de imágenes estándar incluye un punto de referencia de 5 a 10 segundos donde se entrega sólo aire, seguido de la estimulación olor de 3 a 10 segundos dependiendo de la concentración de olor elegido, y de 70 a 82s son más grabado con un flujo de aire constante para la recuperación de línea de base (Fig. 2A). Al final de la prueba, la luz se apaga y el aire puro se entrega a la duración del ensayo intervalo entre (1 a 3 minutos) para lavar las moléculas de olor residual y evitar la habituación sensorial. Ensayos olor se intercalan con las pruebas en blanco (la entrega de aire).
2. Evoca el olor zonas activadas se visualizan como zonas más o menos esférico en los mapas y se corresponden con el tamaño de cada uno de los glomérulos (80 a 200μm de diámetro ^9). Procesamiento de imágenes se explica en la Figura 2B. Mapas olfativos se presentan en la Figura 3. Al contrario de cualquier sistema sensorial, la relación señal-ruido en el OB fue suficiente para resolver el olor evoca respuestas en las pruebas individuales (Fig. 3B para IOS y la figura. 3D para FAS).
3. Los ratones son sacrificados inmediatamente después del final de la sesión de imágenes utilizando métodos de acuerdo con las recomendaciones europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

6. Los resultados representativos (ver mapas olfativa en la figura 3):

Figura 1 Organización estructural del bulbo olfativo principal de los roedores. Las neuronas sensoriales olfativas, células primarias sensoriales localizados en el epitelio olfativo principal, expresan el receptor odorante mismo y convergen en el mismo glomérulo en el OB. Glomérulos olfativos, la neuropils de forma redonda (los círculos de puntos), se encuentran en la superficie del OB. Tenga en cuenta que una red vascular muy densa y compleja está presente a nivel glomerular. Abreviaturas (arriba / abajo): ONL: capa del nervio olfatorio, GL: capa glomerular, EPL: capa externa plexiforme; MCL:capa de células mitrales, GCL: capa de células granulares.

Figura 2 de reflectancia y las señales de fluorescencia de grabación en vivo. A. de campo amplio de configuración de imagen óptica. El cerebro de un ratón anestesiado se expone a cualquiera de rojo (IOS) o azul (FAS) a través de la luz sea un anillo de fibra anular en la lente óptica o un puerto de epi-iluminación de un microscopio. Los olores se cargan en frascos herméticamente cerrados y odorizado aire es entregado a la nariz de los animales (de color verde claro: abrir la válvula). B. Registro del protocolo y el procesamiento de datos. IOS y FAS se registran como una serie de ensayos individuales (90 de duración). El diagrama muestra la línea de tiempo de un solo ensayo: referencia varía de 5 a 10 segundos, la estimulación de 3 a 10 segundos, y vuelven a su nivel de 70 a 82s. Procesamiento de imágenes requiere píxel por píxel sustracción de valores de intensidad durante la línea de base a los valores de intensidad durante períodos de estimulación (por FAS) or estimulación más el retorno a los valores basales (IOS). Esta diferencia se divide entre los valores de referencia para obtener una variación en% (ver imágenes resultantes en la fig. 3).

Figura 3 de olores evocan mapas actividad en el OB con IOS y la imagen FAS. A. Vasos sanguíneos de la dorsal OB visualizados con luz verde. BC. IOS imagen (solo ensayo en comparación con un promedio de tres ensayos, respectivamente) para una presentación de 10 segundos de un 20% hexanal. Las flechas blancas indican las regiones esféricas de interés activa por este olor. Estos mapas de activación se han obtenido utilizando los marcos de promedio durante el primer segundo después de la final de la estimulación olor (con un máximo de variación de reflectancia -0,63% en A y B en -0,52%). Tenga en cuenta las zonas de negro de absorbancia en la activación de olor se ha producido. CD. FAS adquirido de forma secuencial en el mismo ratón de la misma sustancia odorífera (único ensayo frente a un promedio de tres ensayos respectivosly). Estos mapas de activación se han obtenido utilizando los marcos de promedio durante el primer segundo después del comienzo de la estimulación olor (con un máximo de variación de fluorescencia 0,72% en el D y 0,66% en E). Tenga en cuenta que las zonas blancas de la emisión de autofluorescencia indicado por flechas de color negro corresponden a las zonas de negro en IOS. El aspecto granulado se ve en el mapa FAS se debe a la 4 por 4 de agrupación para el mejoramiento de la sensibilidad. FAS imágenes no fueron corregidos a partir de la autofluorescencia de blanqueo. Las dimensiones reales de las imágenes SER: 0,7 mm de ancho x 1,2 mm de largo.

Discusión

En este artículo presentamos IOS y FAS técnicas de imagen para grabaciones en vivo de olor evoca las actividades en el OB de ratón. Para lograr este objetivo relativamente simple y asequible de gran campo de configuración de imagen óptica es necesario. La adquisición de datos de imágenes requiere de un entrenamiento para llevar a cabo los procedimientos quirúrgicos muy bien y evitar cualquier daño a la duración o el tejido cerebral. En particular, la hemorragia mayor se registró para absorber los fotones de imagen y terminar el experimento.

Uno de los beneficios de IOS y la imagen FAS es para evitar la inyección de trazadores fluorescentes que podrían dar lugar a toxicidad celular o efectos secundarios no deseados. Ellos hacen posible que para abordar temas acerca de los mapas por lo tanto olfativo de codificación espacial de los estímulos sensoriales. Al contrario de 2-desoxiglucosa imágenes, que ofrecen la posibilidad de olores de varias imágenes en un solo animal. Sin embargo, dado que la penetración de fotones está limitada en el tejido, el IOS y el FAS se limitan a la parte dorsal de la OBy no se puede grabar a partir de las regiones ventral.

Imágenes de endógena de la señal óptica ofrece una excelente resolución espacial de imágenes in vivo. Cálculos técnicos servir para mejorar cuantitativa de los componentes vasculares en la reflexión de las señales de ^8,9 así como la dinámica de la oxigenación sanguínea y el volumen durante la activación sensorial ^10. Imágenes múltiples longitudes de onda de la imagen IOS enfoques se desarrollan actualmente en nuestro laboratorio para cuantificar totalmente la concentración de hemoglobina total y de oxigenación en el OB durante la activación sensorial. Estas mediciones espectroscópicas ópticas añadido a FAS imagen dará la oportunidad de responder a la relación sin resolver entre la dinámica vascular e intracelulares durante la activación sensorial ^11,12.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de El Regente	Empresa	Número de catálogo
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Agarosa, tipo III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Hexanal 98%	Aldrich	115606-100ML