Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Resumen

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso para En vivo Los estudios en animales. Se describe cómo rAAVs se pueden producir en el laboratorio y cómo estos vectores se puede titularse para obtener una lectura precisa del número de partículas infecciosas producidas.

Resumen

En los últimos años recombinantes adeno-asociado vectores virales (AAV) se han convertido cada vez más valioso para los estudios in vivo en animales, y también se está probando en ensayos clínicos humanos. AAV de tipo salvaje es un miembro no patógena de la familia Parvoviridae e inherentemente replicación deficiente. El perfil de transducción amplia, baja respuesta inmune, así como la expresión del transgen fuerte y persistente logra con estos vectores ha hecho una herramienta popular y versátil para la in vitro e in vivo en la entrega de genes. rAAVs puede ser fácil y barato producir en el laboratorio y, en función de su perfil de seguridad favorable, generalmente se les da una clasificación de seguridad bajo. Aquí se describe un método para la producción y titulación de rAAVs quimérico que contiene las proteínas de cápside de ambos AAV1 y AAV2. El uso de estos vectores quiméricos llamado combina los beneficios de ambos serotipos los padres, tales como acciones títulos altos (AAV1) y la purificaciónpor cromatografía de afinidad (AAV2). Estos serotipos AAV son el mejor estudiado de todos los serotipos de AAV, y todos tienen un patrón de infectividad amplio. Los vectores quiméricos descritos aquí deben tener las propiedades infecciosas de AAV1 y AAV2 y por lo tanto se puede esperar para infectar una gran variedad de tejidos, incluyendo las neuronas, músculo esquelético, páncreas, riñón, entre otros. El método descrito aquí utiliza la purificación columna de heparina, un método que cree que dar un título viral más alta y más limpio preparación viral de los métodos de purificación, tales como la centrifugación a través de un gradiente de cloruro de cesio. Además, se describe cómo estos vectores pueden ser rápida y fácilmente titulación para dar una lectura exacta del número de partículas infecciosas producidas.

Protocolo

Ver Figura 1 para un ejemplo que resume el siguiente protocolo.

Nota de seguridad: Todo el material que ha estado en contacto con el ensamblado de partículas virales se debe desinfectar con una solución de Virkon o desinfectante adecuado.

1. Preparación de las poblaciones de ADN plásmido (~ 2 días)

1. Los plásmidos son necesarios los siguientes ^1:
   • pRV1 - Con un contenido de la Rep AAV2 y secuencias de Cap
   • pH21 - Con un contenido de la Rep AAV1 y secuencias de Cap
   • pFdelta6 - Adenovirus-helper plásmido
   • AAV plásmido que contiene el cassette de expresión recombinante flanqueado por AAV2 señales de empaquetamiento (repeticiones terminales invertidas, RTI)
2. Mientras pFdelta6 deben cultivarse en Stbl2 células competentes para evitar la eliminación parcial, pRV1 y pH21 se pueden cultivar en las células DH5alpha competente. AAV plásmidos pueden ser cultivadas en células Stbl2 si deleciones parciales ocurren en las células DH5alpha.
3. Plásmido de ADN debe ser de alta calidad y libre de contaminantes ARN. Los plásmidos pueden ser examinados para la integridad utilizando los siguientes compendios:
   • pRV1 - digestión con XbaI para dar a las bandas de 7,5 kb y 3,8 kb
   • pH21 - digestión con EcoRI para dar a las bandas de 4,5 kb, 2,8 kb y 0,2 kb
   • pFdelta6 - digestión con HindIII para dar a las bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, kb y 2,3 kb 1.5

2. Preparación de las células embrionarias humanas de riñón 293 (HEK293) para la transfección (2 - 3 días)

1. Placa de dos 80% confluente de 150 cm ² frascos de células HEK293 en cinco de 15 cm de diámetro placas de cultivo de tejidos Nunc. Las células deben ser de 70 - 80% confluentes antes de la transfección (aproximadamente 48 horas después de la siembra). Las células de cultivo en medio estándar Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con bajos niveles de glucosa que contiene 10% de suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml.
2. 3 horas antes de la transfección DMEM eliminar y sustituir por Iscove'S medio modificado de Dulbecco (IMDM) que contiene 5% de suero fetal bovino.

3. Transfección de plásmidos virales (aproximadamente 1 hora para la transfección, 3 días de incubación)

1. Prepare las siguientes personas por un solo lote (5 x 15 cm placas de cultivo de tejidos) de virus:
   • 62,5 g del plásmido AAV
   • 125 mg pFdelta6
   • 31,25 mg pRV1
   • 31,25 mg pH21
   • 1650 l 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. En una clase de dos filtros de tejido cubierta de cultivo estéril la mezcla de transfección en un tubo de 50 ml.
3. Mientras agitación de la solución, añadir rápidamente 13 ml de HEPES 2 x solución salina tamponada (pH 7,05). Vuelva a colocar la tapa del tubo de 50 ml y continuar vórtice durante 15 segundos. Dejar reposar durante 1 minuto y 45 segundos, un precipitado blanco fino debe formar.
4. Suavemente añadir 5 ml de la solución de transfección a cada placa de cultivo de 15 cm de tejido. Placas de remolino para mezclar y retorno a la incubadora.
5. 16 horas después de la transfección medio IMDM eliminar y reemplazar con DMEM.

4. Lisis de las células y la cosecha de rAAVs (2 horas)

1. 72 horas después de la transfección, retire el material de las placas de cultivo celular y descarte. Todos los residuos deben ser tratados con una solución de Virkon o desinfectante adecuado.
2. Lave suavemente las células de fosfato 1x caliente (PBS, pH 7,4).
3. Añadir 25 ml de PBS caliente a cada plato y retire suavemente las células con un rascador de células. Recoger la suspensión en tubos de 50 ml.
4. Pellet células a 800 g durante 10 minutos.
5. Desechar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, el uso de 10 ml por placa de cultivo de tejidos. Dividido en dos tubos de 50 ml.
6. Prepare una solución fresca de desoxicolato de sodio al 10% en dH ₂ O. Añadir 1,25 ml de este a cada tubo, para una concentración final de 0,5%. Añadir benzonasa nucleasa a una concentración final de 50 unidades por ml. Mezclar el tubo completamente.
7. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora.
8. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 3000 xg durante 15 minutos. Traslado al nuevo tubo de 50 ml, asegurar que todos los restos celulares se ha eliminado para evitar el bloqueo de las columnas de la heparina (ver paso 5). En esta etapa, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C antes de continuar. Hemos almacenado las muestras durante varias semanas a -20 ° C sin reducción de la infectividad.

5. Purificación de columna de heparina de rAAVs (2 - 3 horas)

1. Configuración de columnas HiTrap heparina usando una bomba peristáltica para que las soluciones de flujo a través de la columna a 1 ml por minuto para los pasos 5.2 a 5.4. Es importante asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido en la columna de heparina.
2. Equilibrar la columna con 10 ml de NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8,0.
3. Aplicar 50 ml de solución de virus de la columna y permitir que fluya a través.
4. Lavar la columna con 20 ml de NaCl 100 mM, 20 mM Tris, pH 8,0.
5. Con una jeringa de 5 ml seguir lavando la columna wITH 1 ml de 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml de NaCl 300 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. Deseche el flujo continuo.
6. Utilizando jeringas de 5 ml y eluir una presión suave que el virus de la columna mediante la aplicación de:
   • 1,5 ml de 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 3,0 ml de 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 1,5 ml de 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • Recoger estas en un tubo de centrífuga de 15 ml.

6. La concentración y la filtración estéril de rAAVs (1 hora)

1. Concentrado de vectores usando Amicon Ultra-4 unidades de filtro centrífugo con un límite de peso molecular 100.000. Carga de 4 ml de eluido de la columna en la planta concentradora y se centrifuga a 2000 xg durante 2 minutos (a temperatura ambiente). Deseche caudal contínuo y el concentrador vuelva a cargar con la solución de virus restantes y repita la centrifugación. El volumen de concentrado debe ser de aproximadamente 250 l. Si el volumen de concentrados es mucho más que eso, deseche el flujo tediante y seguir los pasos de centrifugación en un minuto hasta que el volumen es de aproximadamente 250 l.
2. Añadir 250 l de PBS al virus por un volumen final de 500 l y retirar del concentrador.
3. Vector a través de un filtro de 13 mm de diámetro 0,2 micras filtro de jeringa. Vector debe ser en alícuotas y se almacenó a -80 ° C hasta su utilización.

7. Titulación de los stocks de virus (3 días)

Esto requiere de un promotor que es activo en células HEK293 la conducción de un gen reportero o un producto del gen immunocytochemically detectable. Cuando se produce un vector que no es compatible con las células HEK293 otras líneas celulares o cultivos primarios de células se pueden utilizar.

1. Prepare 18 poli-L-lisina cubreobjetos de vidrio recubiertos o 18 pozos de la cámara de diapositivas Nunc sembrando células HEK293 para que sean 40 - 50% confluente. Para la titulación de Cre-dependiente rAAVs uso HEK293 células que expresan establemente la recombinasa Cre ^2.
2. Infectar bien con serie dilutions del vector AAV (Fig. 2A). Utilice 3 pocillos por cada dilución. Nosotros habitualmente añaden el virus directamente a cada pocillo.
3. Después de 72 horas fijar HEK293 células mediante la adición de un volumen igual de paraformaldehído al 4% (PFA) a medio (dando una concentración final de 2% PFA) durante diez minutos a temperatura ambiente.
4. Lávese las células tres veces en PBS, enjuague en dH ₂ O y cubreobjetos.
5. Cuente el número de células transducidas de los tres pozos que tienen el mayor factor de dilución, pero aún contienen células infectadas, encontrar el promedio de estos y se multiplica por el factor de dilución para obtener el número de unidades infecciosas por microlitro (Fig. 2B).

8. Los resultados previstos

HEK293 células transducidas con una codificación de virus se muestran aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) en la Figura 2B. Por lo general, lograr títulos constante de alrededor de 6 x 10 ⁶ partículas infecciosas por microlitro. Nosotros usamos estos vectores para estereotáxica de colcción en el cerebro de roedores adultos. Esto proporciona una poderosa técnica para la región de la expresión génica específica ^2. Para combinar esta especificidad región con la expresión de genes de células de tipo selectivo que se inyectan la recombinasa Cre-dependiente rAAVs en las regiones objetivo de Cre-ratones transgénicos ^2. Figura 2C-E se muestran ejemplos de las inyecciones estereotáxica de Cre-dependiente rAAVs codificación eGFP en diferentes regiones del cerebro de ratones adultos parvalbúmina-Cre transgénicos ^3.

Figura 1. Esquema del protocolo para la producción de rAAV. 1.) HEK293 células se colocan y crecido a 70 a 80% de confluencia. 2.) Plásmidos AAV y el ayudante se preparan y se transfectaron en células HEK293. 3.) Media pasa a ser DMEM 16 horas después de la transfección y HEK293 células se cultivan durante otras 56 horas. 4.) HEK293 células se cosechan y se lisan. rAAV vectores están separados de los restos celulares por centrifugation. 5.) Las partículas virales se purifican a través de columnas de heparina antes de la concentración y la esterilización. 6.) HEK293 células se cultivan en placas de 24 pocillos e infectar con diluciones seriadas de los vectores AAV para determinar el número de unidades infecciosas.

Figura 2. Titulación y aplicación in vivo de rAAV1 / 2. (A) la instalación de células HEK293 para medir el título viral. HEK293 células se transducen con diluciones seriadas de rAAVs. C, el control no infectados, N, 1 l de stock viral sin diluir. (B) HEK293 células infectadas con rAAVs expresan EGFP. (CE) eGFP expresión viral se limita a Cre-neuronas que expresan en las diferentes zonas piloto de parvalbúmina-Cre ratones transgénicos después de la inyección estereotáxica de Cre-activa rAAVs. Las imágenes muestran ejemplos inmunorreactividad en las buenas prácticas agrarias (C) el pálido reticular del tálamo y el globo, (D) y el giro dentado (E) de la región CA1 del hipocampo. DG, dentate giro, RT, núcleo reticular talámico, GP, globo pálido. Las barras de escala: B, 500 m; C, 100 m; D, 100 m; E, a 500 micras.

Discusión

vectores rAAV son cada vez más valioso para los estudios in vivo en animales. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y barato para rAAVs producción, lo que puede facilitar la aplicación generalizada de este vector útil al evitar la costosa subcontratación de la producción del virus a las empresas. El protocolo (basado en la referencia 1) describe la producción de quimérico rAAV1 / 2 vectores que contienen proteínas de la cápside de los dos serotipos de los padres en proporciones iguales ^4. La purificación de los vectores rAAV uniéndose a las columnas de la heparina se basa en la expresión de proteínas de la cápside AAV2, pero se puede combinar con otros serotipos de AAV1 descritos aquí. Además, AAV6 Se ha informado que se unen a la heparina, aunque con una menor afinidad, y podría ser purificado con columnas de heparina con este procedimiento ^5,6. Cabe señalar sin embargo, que otros serotipos se requieren diferentes concentraciones de NaCl de elución de la columna de heparina ^5,7.

Embalaje rAAV genomas ha demostrado ser óptimo entre 4,1 y 4,9 kb con una fuerte reducción en la eficiencia de envases de hasta 5,2 kb ^8. Este límite de embalaje puede ser considerado como la mayor desventaja del sistema de rAAV, puesto que el tipo específico de células regulación de la expresión del transgen se suele conseguir grandes cis actuando elementos que no pueden tener cabida dentro de las partículas de AAV pequeños. Para superar los lotes de baja titulación, tales como las resultantes del intento de genes paquete que se encuentran cerca del límite de embalaje AAV que se combinan distintos lotes viral concentrada a 250 l en un lote de 500 l, en lugar de añadir PBS como se describe en el paso 6.3. Fiables del tipo de células específicas de transducción se puede lograr mediante la combinación de Cre-driver ratones y cassettes condicional rAAV (ver abajo) para evitar estirar el límite de embalaje.

Es de destacar que mientras que este protocolo pretende proporcionar fácil de seguir las instrucciones en la producción de t de altaiter rAAV, se requiere la presencia de restos de AAV2 proteína de la cápside para la purificación por cromatografía de afinidad con heparina. Otros serotipos de AAV2 debe ser purificado mediante procedimientos alternativos ^9. Una de las ventajas de la purificación columna de heparina es que se cree que produce vectores AAV que tienen una mayor tasa de infectividad de los producidos con un gradiente de cloruro de cesio ^10. Sin embargo, también existen algunas desventajas de este método. Por ejemplo, otras proteínas que se unen a la heparina también pueden estar presentes en la población viral purificada. Mientras que el tropismo de heparina purificada vectores pueden ser influenciados por el título vector ^10, nuestro enfoque para apuntar específicamente a cualquiera de excitación ²⁰ o neuronas inhibitorias (Fig. 2) emplea a Cre-inducida por la activación de la expresión del transgen AAV-mediada y es independiente del título. Una alternativa a la purificación de columna de heparina es el uso de un gradiente de densidad iodixanol, que produce un título viral más alta y más pura que la preparación de la utilización deun gradiente de cloruro de cesio ^10. Este método también se puede combinar con la purificación columna de heparina para producir un vector que es mayor que 99% ^11. Por lo tanto, la consideración cuidadosa debe ser tomada por los distintos grupos en cuanto a qué método de purificación viral es la mejor para su aplicación posterior en particular.

El problema más común asociado con este protocolo es título viral baja. En nuestra experiencia, esto se puede remontar a la eficacia de transfección de baja, o la elución del virus de las columnas de la heparina. Todos los materiales de la transfección debe estar a temperatura ambiente antes de la transfección, y transfections prueba se debe realizar para encontrar las condiciones óptimas en cada laboratorio. Otros métodos de transfección, como lipofectamina, son muy eficientes, pero puede ser muy caro. Además, la concentración y el pH de las soluciones de elución heparina columna es fundamental para la elución completa de los viriones de witho columnas heparinaut daños. Otro punto importante es que las células de envasado deben adherirse bien a la superficie de los platos de cultivo de tejidos. Si las células se separan en algún momento durante el procedimiento se recomienda dar por terminado el experimento y descongelar un nuevo vial de las células.

Espacio-temporales de control de la expresión del transgen en los roedores es fácil de lograr por objetivo anatómica precisa y la etapa de desarrollo del animal. Eficiente AAV-mediada por la transferencia de genes se ha demostrado en el útero ^12,13. En el cerebro adulto, el área infectada con partículas rAAV después de la inyección estereotáxica puede ser ajustado de las regiones objetivo muy pequeño, a áreas mucho más grandes no sólo por los cambios en el título viral, sino también mediante la alteración de los parámetros de inyección. Estos incluyen el volumen y la velocidad de las inyecciones y la inclusión de los polioles manitol con la suspensión del virus ^14. El manitol también se puede utilizar para mejorar la infección de una variedad de tejidos después de la inyección sistémica rAAV ^{15 <}/ Sup>.

La capacidad de envasado de rAAV (aproximadamente 4,7 kb) es probablemente el factor más limitante en términos de los genes que se pueden expresar de estos vectores virales. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que esto puede ser parcialmente superada por los genes de la división más grande o casetes de expresión en distintos vectores rAAV y la introducción de una secuencia de transición, iniciando la expresión de genes en los viriones infectan la misma célula ^16. Los niveles de expresión de los genes transportados por vectores rAAV también puede ser mucho mejor mediante el uso de auto-vectores gratis rAAV ^17. Inyección estereotáxica de vectores rAAV proporciona un método rápido, barato y eficaz para inducir la expresión de genes de una manera específicos de la región. En combinación con dos estrategias de ^segunda generación de interferencia de ARN ¹⁸ rAAVs también se puede utilizar para la región-gen específico de derribar. rAAVs se puede combinar con Cre-ratones transgénicos o de tipo de células específicas para lograr los promotores del circuito y del tipo celularExpresión de genes específicos, lo que permite la manipulación genética con alta resolución espacial ^2,19-21, mientras que rAAVs ajuste por ejemplo, con el sistema tet añade el control temporal sobre el virus de la expresión génica mediada ^22,23. Estos ejemplos ilustran el enorme potencial combinatorio de estos vectores y predecir un aumento rápido en rAAV estudios basados ​​en los próximos años.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amicon centrífugas filtros ultra	Millipore	UFC810024	100.000 MWCO
Benzonase nucleasa	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco de Eagle modificado (DMEM)	Invitrogen	10567014	Suplemento con 10% de FCS y 10 unidades / ml estreptomicina penicillin/100 mg / ml
HEK293	Tipo de la cultura estadounidense, la colección	CRL-1573	Uso en el paso de menos de 30
Solución salina tamponada con HEPES	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap heparina cartucho	Sigma-Aldrich	54836
Medio Iscove modificado de Dulbecco	Invitrogen	12440-053	Suplemento con 5% FCS
Desoxicolato sódico	Sigma-Aldrich	D5670	Haga una solución fresca para cada lote
15 cm de platos de cultivo de tejidos	Fisher Scientific	157150
Stbl2 células competentes	Invitrogen	10268-019
Virkon solución	Fisher Scientific	NC9821357	Deja para la desinfección de toda la noche antes de desechar el drenaje