Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Resumen

Las fuerzas mecánicas juegan un papel clave en el desarrollo pulmonar y lesión pulmonar. A continuación, describimos un método para aislar roedores pulmonares fetales células tipo II epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica mediante un In vitro Sistema.

Resumen

Las fuerzas mecánicas generadas en el útero por la repetición como la respiración, los movimientos y por la distensión del fluido son fundamentales para el desarrollo normal de los pulmones. Un componente clave del desarrollo de los pulmones es la diferenciación de las células alveolares de tipo II epiteliales, la principal fuente de surfactante pulmonar. Estas células también participan en la homeostasis de los líquidos en la luz alveolar, la defensa del huésped, y la reparación de lesiones. Además, las células del parénquima pulmonar distal puede estar directamente expuestos a la extensión exagerada durante la ventilación mecánica después del nacimiento. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares mediante el cual las células pulmonares detectan los estímulos mecánicos para influir en el desarrollo pulmonar y promover la lesión pulmonar no se conocen. Aquí, se proporciona un método simple y de alta pureza para aislar las células de tipo II y fibroblastos de pulmón fetal de roedores. A continuación, se describe un sistema in vitro, la Unidad de tensión Flexcell, para proporcionar la estimulación mecánica de las células fetales, simulando las fuerzas mecánicas deel desarrollo pulmonar fetal o lesión pulmonar. Este sistema experimental constituye una excelente herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares en las células del pulmón fetal expuestos a estirar. Con este enfoque, nuestro laboratorio ha identificado varios receptores y las proteínas de señalización que participan en mecanotransducción en el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.

Protocolo

1. El recubrimiento de placas con las proteínas ECM

1. En condiciones estériles, mezclar 120 g de laminina con 12 ml de PBS estéril 1X frío por placa.
2. Tomar Bioflex placas sin tratar y añadir 2 ml de la solución a cada pocillo (concentración final de laminina es 2 mg / cm ^2). Alternativamente, otras proteínas ECM podrían ser utilizados, tales como colágeno-1 [10 g / cm ^2], la fibronectina [5 g / cm ^2], vitronectina [0,5 g / cm ^2] o elastina [10 g / cm ^2]. La técnica de revestimiento es similar a lo que se ha descrito para laminina-recubrimiento. Asegúrese de que los pozos están completamente cubiertas por la solución.
3. Envolver las placas con plástico y poner a 4 ° C sobre una superficie plana durante la noche para permitir la laminina para adsorber al fondo de los pocillos. En estas condiciones, las placas pueden ser almacenados por lo menos una semana al tiempo que conserva una buena función ECM.
4. Al día siguiente, bajo condiciones estériles, lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X.
5. Añadir 1 ml de BSA al 1% en PBS 1X a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 1 hora para no bloquear sitios de unión específicos en las membranas.
6. Lavar las placas 3 veces con PBS 1X para eliminar las proteínas no adsorbidas.
7. Mantener las placas a 37 ° C en DMEM hasta que las células se aíslan de paso 2,14.

2. Aislamiento de pulmón fetal roedores células de tipo II epiteliales

El día antes del aislamiento que las tazas de pantalla con diferentes mallas de nylon de tamaño autoclave y listo.

1. Obtener los pulmones del feto a partir de disolución-embarazada de ratón / rata en la E17-19 de la gestación. Transferir el tejido en un tubo cónico de 50 ml que contenía medio DMEM y lo coloca en hielo.
2. Hacer tampón de digestión en un tubo cónico de 50 ml: (10 ml). Para este volumen, el tejido pulmonar de aproximadamente 20 fetos de ratón / rata se utiliza.
   8,5 ml de DMEM
   0,5 ml de 500 mM de pH 7,4 HEPES
   5 mg de colagenasa 1
   5 mg de colagenasa 1A
   1 ml de suero de pollo, inactivado por calor
3. Mezclar bien hasta que todos los componentes se disuelven y el filtro a través de un filtro de 0,2 micras jeringa dentro de la campana estéril. Se coloca el tubo cónico que contenía el tampón de digestión en un baño de agua a 37 ° C.
4. Eliminar el medio DMEM del tubo cónico de paso 2,1 y transferir el tejido en una placa de Petri estéril.
5. Picar los pulmones bien con tijeras estériles o cuchilla de afeitar para hacer piezas de tejido inferior a 1 mm y transferir el tejido en el tubo cónico que contenía el tampón de digestión pre-calentado desde el paso 2,3.
6. Digerir el tejido pipeteando arriba y abajo:
   100 veces con 10 ml de pipeta
   100 veces con 5 ml de pipeta
   100 veces con pipeta Pasteur
7. Centrifugar el homogenado a 1300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración y volver a suspender el precipitado que contiene las células en 15 ml de DMEM más FBS al 20%.
9. Saca las copas de pantalla con 100 -, 30 - y 15 micras y mallas de nylon º lugarem en estériles de 150 ml vasos.
10. Añadir homogenado de células a partir del paso 2.8 y secuencialmente filtrar a través de 100 -, 30 -, y 15 micras tazas de malla.
11. Recoge agrupadas sin filtrar las células de los años 30 - y las mallas de 15 micras después de varios lavados con DMEM más FBS al 10% para facilitar la filtración de células no epiteliales.
12. Desechar el filtrado de la malla 15-micras que contiene principalmente los fibroblastos.
13. Purificar nuevas células de tipo II mediante la incubación de las células de paso 2,11 cm en ^75-2 matraces durante 30 min (approximatelly10 ml de suspensión de células por matraz).
14. Recoger el sobrenadante y se centrifuga a 1.300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células.
15. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet que contiene las células en DMEM libre de suero. El volumen de resuspensión depende de la cantidad de tejido procesado. Aproximadamente, se placa el equivalente de células obtenidas de un feto en cada pocillo (2 ml) a fin de Achivíspera entre 60-70% de confluencia el día siguiente.
16. Placa de suspensión de la celda en Bioflex seis placas recubiertas con laminina y fibronectina.

3. Aislamiento de fibroblastos fetales roedores pulmonares

1. Siga los mismos pasos descritos anteriormente para las células de tipo II de aislamiento de hasta 2,11.
2. Tomar el filtrado de la malla 15-micrones (sin lavado previo; volumen aproximado es de 10-15 ml) y la placa a 75 cm de ² a 37 ° C durante 30-60 minutos para permitir que los fibroblastos de adherirse.
3. Aspirar el sobrenadante y reemplazar con DMEM libre de suero y se incuba durante la noche.
4. Al día siguiente, cosechar las células con 0,25% (peso / volumen) de tripsina en 0,4 mM EDTA y la placa de ellas en placas recubiertas previamente con fibronectina Bioflex.

4. Sistema experimental para proporcionar la estimulación mecánica a las células pulmonares

1. De semillas de las células (alrededor del 50% confluente) en placas de cultivo de Bioflex en DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y dejar que ellos adhieren y SPREanuncio por lo menos durante 6h antes de los experimentos. En general nuestro laboratorio mantiene células en cultivo de alrededor de 24 horas antes de la aplicación de la tensión mecánica. Si un número determinado de células son necesarios para los experimentos, después del aislamiento, las células de tipo II son mantenidos en DMEM libre de suero de 75 cm ² frascos y al día siguiente, las células se tripsinizaron, se contaron y sembraron entonces.
2. Al día siguiente, los medios se sustituyen con fresco DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y las placas Bioflex están montados en una unidad Flexcell FX-5000 Cepa. Monocapas no debe ser mayor del 80% confluentes antes de la iniciación de los experimentos.
3. Cepa Equibiaxial se aplica a las membranas. El régimen de deformación varía en función de simulación de fuerzas mecánicas in vivo (véase la discusión).
4. Las células cultivadas en no-estirados membranas cultivadas en paralelo se utilizan como controles.
5. Al final de los experimentos, las monocapas se pueden procesar para analizar los cambios en la expresión génica (por ejemplo la proteína C surfactante)por la abundancia de proteínas PCR en tiempo real, por Western blot, etc Además, las monocapas se puede fijar para los experimentos de inmunocitoquímica. Para esta técnica, después de la fijación, las membranas de silastic se cortan a partir de las placas y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando 10-20 l de agua como un agente de montaje antes de permeabilización e incubación con anticuerpos. El sobrenadante puede utilizarse también para investigar la presencia de factores de crecimiento, citoquinas, etc

5. Los resultados representativos

Figura 1 y Figura 2 muestra representativa de contraste de fase fotografías de fetos de ratón E18 células tipo II aislado utilizando la técnica descrita en este manuscrito.

La Figura 3 demuestra que la tensión mecánica induce la diferenciación de las células de tipo II fetales epiteliales utilizando la proteína surfactante-C como un marcador.

Figura 1. Repsentante de contraste de fase fotografía tomada justo después de aislamiento que muestra el aspecto de los fetos se agruparon las células tipo II.

Figura 2. E18 fetales células de tipo II epiteliales se aislaron como se describe aquí y chapada en placas recubiertas con Bioflex laminina. La fotografía fue tomada el día siguiente después de no estirado las células fueron fijadas en paraformaldehído. La pureza de las células se determinó que era de 90 ± 5% por análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales y inmunotinción para SP-C.

Figura 3. Fetal las células tipo II epiteliales fueron expuestos a la cepa cíclico de 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas. Una mancha) del Norte de la proteína surfactante C (SP-C) que muestra que la expresión del ARNm cepa induce la diferenciación de células de tipo II utilizando diferentes sustratos ECM . Signos + / - representan la exposición o no a la sentrenar, respectivamente. Los datos se presentan como media + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) Imágenes de fluorescencia inmunocitoquímica demuestra la SP-C los niveles de proteína (verde) en las células tipo II fetales expuestos o no (control) a una tensión mecánica.. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Bar, 10 m. C) los resultados de Western blot a partir de tres experimentos que demuestran que el estiramiento mecánico aumenta la proteína SP-C. N = 3; * p <0,05.

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Discusión

En este manuscrito, se describe un método para aislar células tipo II fetales epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica utilizando el aparato de tensión Flexcell. Hemos utilizado esta técnica para evaluar la diferenciación de las células epiteliales ^1,2 y el estudio de los receptores y las vías de señalización activadas por tramo ^3-9. Además, este método también se puede utilizar para investigar las respuestas de células inducidas por lesión mecánica ^1...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase 1	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
Screen cups	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Syringe filters	Fisher Scientific	09-754-25
100 micron nylon mesh	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
30 micron mesh	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
15 micron mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Collagen-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronectin	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastin	Sigma-Aldrich	E-6402
Bioflex plate	Flexcell International	BF-3001U	Uncoated
Flexcell Strain Unit	Flexcell International	FX-5000