Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Resumen

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Resumen

Los cultivos primarios de rata y las neuronas del hipocampo de ratón se utilizan ampliamente para revelar los mecanismos celulares en neurobiología. Al aislar y cultivar las neuronas individuales, los investigadores son capaces de analizar las propiedades relacionadas con el tráfico celular, estructura celular y la localización de la proteína individual, utilizando una variedad de técnicas bioquímicas. Los resultados de estos experimentos son críticos para probar las teorías que abordan las bases neurales de la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, los resultados inequívocos de estas formas de experimentos se basan en la capacidad de crecer cultivos neuronales con mínima contaminación por otros tipos de células cerebrales. En este protocolo, el uso de los medios de comunicación específicos diseñados para el crecimiento de neuronas y la cuidadosa disección de tejido del hipocampo embrionario para optimizar el crecimiento de las neuronas sanas y reducir al mínimo los tipos de células contaminantes (es decir, los astrocitos). Embrionario tejido del hipocampo de ratón puede ser más difícil de aislar de tejido roedor similar debido al tamaño de la muestra para dissection. Se muestran las técnicas de disección detallada de hipocampo de embriones crías de ratón del día 19 (E19). Una vez que el tejido del hipocampo es aislado, la disociación suave de las células neuronales se logra con una concentración diluida de la tripsina y la disrupción mecánica diseñado para separar las células de tejido conectivo mientras que proporciona el mínimo daño a las células individuales. Una descripción detallada de cómo preparar pipetas para ser utilizado en la interrupción está incluido. Densidades óptimas de planchas se proporcionan para los inmuno-fluorescencia protocolos para maximizar el cultivo de células de éxito. El protocolo proporciona una técnica rápida (aproximadamente 2 horas) y eficiente para el cultivo de células neuronales a partir de tejido del hipocampo del ratón.

Protocolo

1. Puesta en marcha antes de la cosecha

1. Para generar crías prenatales para la cosecha de las neuronas, programar la reproducción entre los ratones adultos 19 días antes del día de aislamiento neurona. (Ratones C57BL / 6 años de edad de 2-8 meses se utilizaron en los apareamientos para los propósitos de desarrollo de este protocolo). El éxito de apareamiento puede ser confirmado por la detección de un tapón vaginal en la confirmación de las mujeres, palpitaciones o visual del embarazo.
2. El día antes de aislar las neuronas:
   1. Para aplicaciones de inmunofluorescencia, cubreobjetos capa de vidrio en una placa de 24 pocillos con una ligera capa de 03:01 colágeno 1, Cola de Rata: poli-D-lisina solución.
   2. Para aplicaciones de cultivo celular, capa de tejido apropiado tamaño de la cultura material de plástico con una capa ligera de 3:01 colágeno 1, Cola de Rata: poli-D-lisina solución.
3. Resto de las placas descubiertas en una campana de cultivo de tejidos bajo una luz ultravioleta durante la noche.
4. Lavar las placas con solución de Hank estéril salina equilibrada de (HBSS) antespara su uso. Placas recubiertas se pueden llenar con HBSS y se almacena hasta una semana a 4 ° C en la oscuridad.

2. Tejido de cosecha

1. La esterilidad es siempre un factor que cada vez más cultivos primarios de células y, como tal, el mayor se debe tener precaución para asegurar el ambiente más estéril posible. Con una cuidadosa atención a la técnica estéril, la disección inicial y la recolección de tejido neural para este protocolo se puede realizar fuera de una campana de flujo laminar con un riesgo mínimo de contaminación. Después de la cosecha inicial, todos los pasos siguientes deben realizarse bajo condiciones de máxima esterilidad dentro de una campana clasificado para el cultivo de células.
2. La eutanasia de un ratón embarazada en aproximadamente 19 días después de la fertilización por decapitación. El uso de anestesia para la eutanasia de la mujer embarazada no se recomienda como la anestesia se sabe que causa la muerte de las células cerebrales (Stratmann, et al., 2010). Usando unas tijeras de disección estéril y pinzas, crear una abertura en el lado medio ventral delratón para revelar completamente la cavidad del cuerpo. Los instrumentos se pueden esterilizar con alcohol y una llama abierta.
3. Cachorros prenatales se encuentra hacia la parte posterior de la cavidad del cuerpo del ratón, y deben ser fácilmente visibles en el útero. Con pinzas esterilizadas en autoclave, abrir el útero y extraer los cachorros. Decapitar a los cachorros con nuevas tijeras estériles y la cabeza en lugar de retirar una gasa estéril bajo un microscopio de disección. Instrumentos estériles, pueden ser tratados en autoclave llama limpiarse con alcohol y una llama abierta antes de y durante el uso.
4. Con unas tijeras estériles o cráneo bisturí, abierto de las crías de la parte posterior del cuello hasta la nariz. Este procedimiento normalmente se puede completar mediante la inserción de una punta de las tijeras en el agujero vertebral para luego proceder hacia delante. Retire con cuidado todo el cerebro con una pinza. Coloque el cerebro de una gasa estéril. Con un bisturí estéril, retire el cerebelo y la incisión por la línea media del cerebro para separar en dos hemisferios (Figura 1) .
5. Tome una pequeña sección de las meninges que rodean al hipocampo con pinzas estériles y tire de ella suavemente. Aunque no es estrictamente necesario para eliminar las meninges antes de aislar el hipocampo, la presencia de las meninges puede hacer la disección del hipocampo más difícil debido a la tenacidad de la membrana. En cualquier caso, el hipocampo será más claramente visible después de las meninges se han eliminado. El hipocampo es una estructura curva que se inicia en la parte distal del hemisferio y se inclina ventral (Figura 2). A medida que el interior, el lado cóncavo, (caudal) se enfrenta a un ventrículo, ya es libre. Por lo tanto, para aislar el hipocampo, una necesita para cortar a lo largo del lado exterior convexo. Después de la disección, levante con cuidado cada uno de hipocampos con pinzas estériles y la transferencia de tejido en un plato pequeño con el cultivo de tejidos calientes (37 ° C) HBSS bajo una campana de cultivo celular. El tejido cerebral se pueden combinar de varias crías.

"> 3. Tejido disociación

1. Usando un escalpelo estéril tejido, suavemente pelos cerebro en 3 ml de HBSS estériles en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm.
2. Transferir el tejido picada y HBSS a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1,5 ml de HBSS y 0,5 ml de solución de tripsina 0,25% hasta un volumen total de 5 ml.
3. Cap e invertir suavemente el tubo 4-5 veces para mezclar. Trata de evitar la producción de burbujas como ADN liberado del tejido digerido se adherirá a las burbujas y provocar que el tejido picado a flotar en lugar de depositarse en el fondo del tubo (Figura 3).
4. Incubar tejido del hipocampo a 37 ° C durante 15 minutos, invirtiendo el tubo como por encima de cada 5 minutos.
5. Permitir que el tejido se depositan en el fondo del tubo.
6. Retirar con cuidado el exceso de solución con una pipeta estéril, dejando inalteradas tejido en la parte inferior del tubo.
7. Lavar sedimento de tejido con 5 ml de HBSS a 37 ° C durante 5 minutos. Repetición de un total de 3 veces. Permitir que el tejido para resolver por completoa la parte inferior del tubo cada vez antes de proceder a la etapa de lavado siguiente.
8. Quitar el lavado final a partir del tejido de pellets y reemplazar con 2 ml de HBSS frescas.

4. Neurona trituración

1. Antes de comenzar los pasos trituración, usted tendrá que preparar pipetas Pasteur pulida al fuego. El uso de un quemador Bunson, mantenga una estéril 9 pulgadas pipeta Pasteur punta (Figura 4a) en la llama hasta que el diámetro de la abertura pipeta es de aproximadamente 0,5 mm de tamaño y los bordes de la abertura pipeta se han redondeado ligeramente (Figura 4b). Permita que la pipeta se enfríe completamente antes de comenzar el proceso de trituración.
2. Usando una normal estéril 9 pulgadas pipeta Pasteur, se tritura suavemente el tejido un total de 7 veces. Los trozos más grandes de tejido son normales en este punto y se debe permitir que se depositan en el fondo del tubo antes de pasar al siguiente paso.
3. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico estéril 50 ml.
4. Para el tejido restante, añadir 2 ml de HBSS estériles y triturar con un total de 5 veces con el fuego, pulido pipeta Pasteur.
5. Dejar que todos los restantes grandes piezas de tejido se depositen en el fondo del tubo y se combinan con el sobrenadante sobrenadante anterior para un total de 4 ml células neuronales disociadas.

5. Revestimiento de la célula

1. Cuenta las células disociadas utilizando un hemocitómetro.
2. Como regla general, una vez que el número de células se han determinado, restar 20% de ese número final para dar cuenta de cualquier muerte celular que puede ocurrir después de placas.
3. Las células pueden ser cultivadas utilizando las siguientes recomendaciones:
   Para cubreobjetos en una placa y 24 - 6 x 10 ⁴ células / pocillo en 0,5 ml
   Durante 60 placas de cultivo de tejidos mm - 4 x 10 ⁵ células / placa en 3 ml
   Para placas de 100 mm de tejido Cultura - 6 x 10 ⁶ células / placa en 6 ml
4. Mezcle un número adecuado de células con el volumen indicado de los medios de enchapado Neurobasal (NeurobasalMedios que contienen B27 Suplemento [1 ml / 50 ml], 0,5 mM de solución de glutamina, 25 mM glutamato (Sr. 147,13 g / mol), penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) [250 l / 50 ml] , 1 mM de HEPES (Sr. 238,3 g / mol), Calor caballo al 10% de los donantes suero inactivado) y añadir las células a las placas. Placas de agitar suavemente para distribuir las células de manera uniforme. Cadena de Donantes de suero de caballo se añade a los medios de Revestimiento para enriquecer las células durante las primeras 24 horas de crecimiento. Las células son posteriormente retirados de el suero y devuelto a un medio ambiente libre de suero por la reducción de serie del suero en cada sustitución de los medios. También debe tenerse en cuenta que mientras que el glutamato a concentraciones más altas es tóxico para los cultivos de células neuronales, a las concentraciones más bajas añadido aquí, se inhibe la fijación de células no neuronales ^11. Sin embargo, sólo hay que añadir a los medios de las planchas para las primeras 24 horas en la cultura y, posteriormente, quedar fuera de los medios de alimentación para prevenir la neurotoxicidad de las células.
5. Pencaje de las neuronas en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante la noche.
6. Quitar la mitad del volumen de los medios de las células y sustituir con el mismo volumen de medios de alimentación Neurobasal (Medios Neurobasal contiene B27 Suplemento [1 ml / 50 ml], 0,5 mM de glutamina de soluciones, penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) [250 l / 50 ml], 1 mM de HEPES (Sr 238,3 g / mol).
7. Las neuronas deben ser alimentados cada 4 días mediante la eliminación de la mitad de los antiguos medios de comunicación y su sustitución por el mismo volumen de medios de alimentación fresca Neurobasal. Los procesos neuronales que empiezan a ser visibles en el Día 1 (Figura 5a) y llegado a ser frecuente a los 10 días (Figura 5b).

6. Los resultados representativos

La capacidad de crecer y la cultura primaria de las células neuronales se ha convertido en una parte indispensable de la neurociencia. Los cultivos primarios permitirá a los investigadores para analizar las vías celulares específicas, modificación química y el tratamiento, el objetivo de loclización y patrones de crecimiento en un entorno controlado. Muchos de estos procedimientos utilizan sofisticada metodología para visualizar cambios específicos en las respuestas de células. En este caso, las neuronas del hipocampo se utilizan para estudiar las vías neuronales específicas que sería difícil, si no imposible de analizar en el cerebro intacto. Preparación de cerca de poblaciones homogéneas de las neuronas de áreas específicas del cerebro es fundamental para el estudio de la función cerebral. Efectos moleculares en las neuronas individuales puede ser un instrumento más en la delimitación de las vías de orden, como la memoria o el aprendizaje. Como este protocolo produce cultivos relativamente puras de las neuronas del hipocampo, sin la necesidad de una capa alimentadora de células gliales, estas neuronas son fácilmente utilizada para los estudios de inmunofluorescencia. Sin embargo, como con todos los cultivos primarios de los órganos que contienen múltiples tipos de células, alguna contaminación por las células menos deseados pueden ocurrir. En el aislamiento de las células neuronales, la contaminación por las células gliales puede ser un problema común. Las células gliales cun ser fácilmente detectado en visualización microscópica del cultivo como su morfología difiere significativamente de las neuronas diana (Figura 6). El impacto de la contaminación de células gliales dependerá del uso previsto de los cultivos. Si las células se están utilizando para el examen de inmunofluorescencia, la contaminación de la glía puede ser nada más que un inconveniente cuando se trata de fotografiar a las neuronas individuales. Sin embargo, si los cultivos neuronales se van a utilizar para el análisis bioquímico, cualquier contaminación significativa por las células gliales podría causar cambios importantes en los resultados. Formas de abordar la contaminación de las células gliales se describen más en la discusión.

Una vez que las neuronas se han aislado con éxito y ha crecido en la cultura, una aplicación típica es el de examinar los procesos celulares de inmuno-fluorescencia técnicas. Como se ilustra en la Figura 7, orgánulos, tales como las mitocondrias, pueden ser teñidos utilizando colorantes vitales añadidos a los medios de cultivo antes de fijarción. Endógenas proteínas celulares pueden ser visualizados a partir de células fijas utilizando estándar inmuno-fluorescencia técnicas (Figura 8). Una vez que las células neuronales son fijos, los anticuerpos específicos para las proteínas de interés puede ser introducido en la célula y estas proteínas pueden ser visualizadas utilizando un microscopio de fluorescencia. Neuronas cultivadas también proporcionar al investigador con los medios para examinar los efectos individuales de proteínas en las funciones neuronales. Usando una variedad de técnicas, incluyendo las transfecciones de ADN, electroporación o transducción viral, las proteínas pueden ser sobreexpresada en las células neuronales (Figura 9). ¿Cómo las células nerviosas responden a los efectos de la sobre-expresó proteínas puede tener inferencias directas sobre cómo el cerebro puede responder y ofrece la posibilidad de identificar dianas celulares para el tratamiento con medicamentos. Los detalles de estos tipos de experimentos ir más allá del alcance de este documento pero ilustran que los cultivos preparados por esta técnica son adecuados para una amplia gama de abajo-stream aplicaciones. Sin embargo, la simplicidad general de este protocolo, así como, el corto período de tiempo necesario para preparar estos cultivos neuronales hacen de este un método ideal para su uso en laboratorio de neurociencia de hoy.

Figura 1. La disección del cerebro del ratón prenatal. La primera incisión es abajo de la línea media del cerebro que lo separa en dos hemisferios.

Figura 2. Ubicación del hipocampo en el cerebro del ratón prenatal. El cuerpo estriado se hizo a un lado para visualizar el hipocampo y se caracteriza por la curva de estructura de "frijol" tipo en la región distal de cada hemisferio.

Figura 3. La disociación del tejido del hipocampo en solución de tripsina.

Figura 4. Puntas de pipeta Pasteur utilizada en la trituración del tejido del hipocampo. (A) normal pipeta Pasteur de punta. (B) Pasteur pulida al fuego punta de la pipeta. Tome nota de los bordes redondeados y la disminución aproximada del 50% en el tamaño de la abertura pipeta.

Figura 5. Neuronas del hipocampo aislado utilizando este procedimiento y se sembraron en la Nota Media. (A) Crecimiento de las células un día después de la siembra. Procesos neuronales empiezan a ser visibles durante el Día 1. (B) el crecimiento de la célula 10 días después de la siembra, neuritas se ramifican y se superponen.

Figura 6. Las neuronas del hipocampo contaminadas con las células gliales cultivados durante 7 días y se tiñeron con el orgánulo marcador MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) y TaxisDirección Ejecutiva con GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Las mitocondrias son visibles en todas las células sin embargo, sólo una sola neurona se transfectadas con éxito con la construcción fluorescente. La contaminación con las células gliales hace que el análisis de GFP-LC3 expresión en los procesos neuronales difíciles de visualizar.

Figura 7. Neuronas del hipocampo cultivadas durante 7 días y se tiñeron con el orgánulo marcador MitoTracker Red CM-H ₂ Xros (Invitrogen # M7513). Este colorante vital se utiliza para teñir las mitocondrias activo en células de cultivo de tejidos. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% / PBS y se visualizó por microscopía de fluorescencia. El propio medio de contraste no es fluorescente hasta oxidados en la mitocondria. Activa las mitocondrias puede ser visto a través de los procesos neuronales.

Figura 8. neuronas del hipocampo cultivadas durante 7 días, se fijaron con paraformaldehído al 4% / PBS y la inmuno-teñidos con anticuerpo monoclonal anti-β tubulina (Sigma # T0198). Después de anticuerpo primario, Oregon Green etiquetados de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Invitrogen # O11033) se añadió y se visualizó por microscopía de fluorescencia.

Figura 9. Neuronales del hipocampo culturas fueron cultivadas durante 5 días y transfectadas con GFP-LC3β construcción de ADN utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). En el día 7, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% / PBS y aggresomes con LC3β GFP etiquetados incorporado en su membrana externa se visualizaron utilizando microscopía fluorescente. Aggresomes se encuentran en todo el cuerpo celular y neurites y se indican con flechas.

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Discusión

Cultivos de hipocampo se han utilizado en la biología molecular de más de 20 años. Aunque, en principio, cultivos neuronales se pueden hacer de cualquier parte del cerebro, cultivos de hipocampo han demostrado ser el más popular debido a la arquitectura relativamente simple de la población de células nerviosas en el hipocampo ^7. Cultivos de hipocampo son típicamente hechos de la última etapa del tejido embrionario. Este tejido es más fácil para disociar y contiene menos células gliales que funciona...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de Reactivo	Vendedor	Número de catálogo
Rata colágeno de cola 1	BD Biosciences	354236
Poli-D-lisina Solución	Chemicon	Una-003-E
Solución salina equilibrada de Hanks	Invitrogen	14175-095
Solución de tripsina (1X) 0,25%, líquido	Invitrogen	15050-065
Medio Neurobasal (1X) líquida	Invitrogen	21103-049
B27 Suplemento (50X) de líquido	Invitrogen	17504-044
L-glutamina 200 mM (100X) líquido	Invitrogen	25030-149
La penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donante de suero de caballo	Atlanta Productos Biológicos	S12150H