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La Drosophila Cámara de huevo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de localización del mRNA. Con el fin de capturar los eventos dinámicos que subyacen a los procesos de localización, imágenes de alta resolución rápida de tejido vivo se requiere. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y la imagen de las muestras en vivo con una interrupción mínima.
Imágenes de células vivas es una importante técnica se aplica a una serie de tejidos de Drosophila usados como modelos para investigar temas como la especificación del eje, la diferenciación celular y organogénesis 1. La correcta preparación de las muestras experimentales es crucial, a menudo descuidado, paso. El objetivo de la preparación es para garantizar la relevancia fisiológica y establecer las condiciones óptimas de imagen. Para mantener la viabilidad del tejido, es fundamental para evitar la deshidratación, el deterioro de la hipoxia, sobrecalentamiento o el medio 2.
La cámara de Drosophila huevo es un sistema bien establecido para examinar las cuestiones relativas, pero no limitado, a patrón del cuerpo, la localización del mRNA y la organización citoesquelética 3,4. Para cámaras de huevo primeros y mediados etapa, el montaje en el aceite de hidrocarburo halogenado es bueno para la supervivencia en que permite la libre difusión de oxígeno, evita la deshidratación y la hipoxia y tiene excelentes propiedades ópticas para microscopía. Imenvejecimiento de las proteínas fluorescentes es posible mediante la introducción de transgenes en la cámara de huevos o de inyección física de ARN, proteínas marcadas o anticuerpos 5-7. Por ejemplo, la adición de MS2 construcciones en el genoma de los animales permite la observación en tiempo real de ARNm en el oocito 8. Estas construcciones permiten en el etiquetado de ARNm in vivo mediante la utilización de la interacción MS2 bacteriófago bucle ARN vástago con su proteína de la cubierta 9.
Aquí, se presenta un protocolo para la extracción de los ovarios, así como aislar ovarioles individuales y las cámaras de huevos de la hembra de Drosophila. Para una descripción detallada de Drosophila oogenesis véase Allan C. Spradling (1993, reeditado en 2009) 10.
1. Drosophila antes de la preparación para la disección (Según E. Gavis, la Universidad de Princeton)
Nota: Como alternativa, mezcle una levadura pega en un recipiente aparte y añadir la pasta para el vial con una espátula.
2. Drosophila disección ovario
3. Ovarioles aislamiento
Nota: Cada ovario contiene cerca de 16 ovarioles compuestas de 6 a 10 cámaras de huevos de las diferentes etapas dispuestas como cuentas de un collar 10.
Nota: Antes de aislar los ovarioles, ajustar la fuente de luz en el microscopio de disección, para que la iluminación afecta a un ángulo bajo a la muestra. Esto da contraste a la muestra y permite la visualización de las cámaras de huevo jóvenes etapa.
Nota: ovarioles individuales se rompe entre las etapas de los jóvenes (germario a la etapa 10), como las etapas más antiguas son demasiado grandes para ser separado del ovario completo.
Nota: La punción un oocito etapa tardía con la sonda de disección se traducirá en el citoplasma fugas en el aceite y hacer la extracción de ovarioles individuales muy difícil. Si un óvulo última etapa se perfora, se mueven a un ovario fresco.
Nota: Es aconsejable para diseccionar cada uno de los ovarios de varias moscas en lugar de la disección de los ovarios de un menor número de moscas para aumentar el número n de moscas para el experimento.
Nota: El manejo brusco de la ovariola dará lugar a los ovocitos no saludables y pueden dar lugar a artefactos en el experimento.
Nota: Los ovocitos comenzará a mostrar cambios fenotípicos debido al estrés 40 minutos después de ser diseccionado por el ovario (comparar Figura 7E a la F).
4. De aislamiento individuales finales cámaras estado de huevo (De acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton)
Nota: La punción de un ovocito, mientras que la disección de finales de cámaras de la etapa de huevo no es tan condenando al igual que con la disección de iovarioles INDIVIDUALES para los más jóvenes.
Nota: Para la etapa de huevo 14 cámaras, utilice las pinzas para agarrar los apéndices dorsales para la orientación.
5. Inyección de la preparación
Nota: Para la inyección de ovocitos etapa intermedia, orientar la ovarioles perpendicularmente al eje longitudinal de la hoja de la cubierta.
6. La inyección de ARN fluorescente
Antes de comenzar: Establecer el aparato de inyección y micro-manipulador tales controles que la aguja de inyección se coloca sobre el centro del campo de visión.
Nota: Si utiliza una etapa automatizado con capacidad de punto de visita es recomendable para marcar toda la etapa de 8-9 ovocitos para la inyección antes de empezar. Esto permite por visitar fácil y la inyección de oocitos seleccionados.
Nota: El proceso de inyección completa debe tener menos de 10 segundos cuando se ejecuta correctamente. Amplia punzante o persistentes con la aguja en su interior de los ovocitos dará lugar a graves daños a la cámara de huevos.
Nota: Si se comete un error mientras se inyecta, pasar a la siguiente marca de ovocitos. No pierda el tiempo en los ovocitos dañados.
Nota: La aguja puede obstruirse durante una sesión de la inyección. En este caso, mover la aguja adyacente a la pieza rota de vidrio en el aceite sobre el cubreobjetos. Ingenioh, el vidrio y la aguja en el mismo plano focal, suavemente incrustar la aguja en el vaso (Figura 6H). Prueba de que la aguja se unclogged pulsando el botón de inyección y ver si cualquier líquido sale de la punta de la aguja.
Nota: Si un largo período de tiempo transcurrido entre el aislamiento de huevos de cámara y la inyección de ovocitos, óvulos, será difícil para inyectar y muestran cambios fenotípicos asociados con el estrés. Problemas similares pueden surgir con el manejo brusco de los ovocitos o la inyección de volúmenes de exceso (compare las figuras 6I, J, K).
7. Vivir el diseño experimental de imágenes
8. Los resultados representativos
In vitro sintetizado Alexa-546 GRK ARN se inyecta en un Me31B :: GFP huevo cámara (Figura 7A). El ARN se localiza en la parte anterior dorsal del oocito y forma un tapón alrededor del núcleo (Figura 7B). Para más ejemplos de la localización del ARN ver MacDougall N., et al. (2003) 11.
Ovocitos etapa de mediados y finales que expresan la proteína fluorescente etiquetados (Tau-GFP, Figura 7C) o los sistemas de etiquetado de ARN (GRK * mCherry, la figura 7D) se pueden obtener imágenes sin inyección.
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Imágenes de células vivas es un ensayo de gran alcance para el examen de los procesos celulares en tiempo real. Además de la simple observación de campo brillante, la adición de marcadores fluorescentes a las proteínas y ARN de interés ha llevado a muchos avances. Aquí hemos descrito un protocolo de oocitos de imagen de vida individuales que pueden ser utilizados en combinación con los ensayos genéticos y bioquímicos.
En este protocolo, también se explica cómo manipular experimentalmente los ovocitos mediante una inyección de vida. Existen muchas posibilidades para el material a inyectar, incluyendo sintetizado in vitro del ARN marcadas fluorescentes para ensayar la capacidad de una estructura secundaria de ARN directa localización (bola y Davis, no publicado) y anticuerpos que inhiben la función de las proteínas 6. El trabajo futuro es probable que vea la introducción de componentes de etiquetado y otras maquinaria celular de ovocitos de vida que permitan a los mecanismos moleculares a ser probado.
t "> Para preservar la viabilidad y la salud de los tejidos es esencial cuando se trabaja con células vivas. En este protocolo, señalamos una serie de medidas que pueden conducir al estrés de la cámara de huevos. Por ejemplo, a pesar de petróleo fue superior para obtener imágenes, la cultura extendida en el aceite puede provocar estrés en la cámara de huevos. Esto puede ser fácilmente controlados en la exposición de campo claro mediante el examen de la morfología nuclear y la posición, la membrana de los ovocitos que se distorsionan y la ampolla bajo estrés (comparar Figura 7E (átona) para Figure7F ( hizo hincapié en)). Etapa 9 cámaras de huevos muestran la localización del ARN y la migración de borde de la celda 12 horas sobre múltiples. Sin embargo, una etapa de 7.8 cámara de huevos comenzará a mostrar efectos negativos en el aceite de carbón de halo después de aproximadamente 40 minutos de los ovarios que son removidos de la de sexo femenino. cámaras de última hora de huevo, estadio 11 a 14, pueda desarrollarse con normalidad, ya sea en aceite o medios acuosos debido a la secreción de la cáscara del huevo de las células de los folículos en estas 13 etapas. Ha sido reported que la adición de insulina al medio de insectos acuosa puede mantener la etapa 9 ovocitos para un máximo de 6 horas y 14 germaria hasta 14 horas 15. En todos los casos, las maniobras agresivas de la cámara de huevos debe evitarse, ya que hace hincapié en los ovocitos y reduce su viabilidad. Imagen menos cámaras de huevos y el cuidado para el tratamiento de cada uno con cuidado es la mejor manera de asegurar la viabilidad óptima.No tenemos nada que revelar.
Este trabajo fue financiado por una Beca de Investigación Wellcome Trust Principal I. Davis.
Las herramientas utilizadas en la disección debe ser limpio, pero no necesitan ser esterilizados en autoclave. Limpie las herramientas con EtOH y dejar que se sequen antes de empezar.
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