Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Resumen

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Resumen

El cromosoma bacteriano se puede utilizar para mantener establemente ADN extraño en el intervalo de mega-base ^1. La integración en el cromosoma elude cuestiones tales como la replicación del plásmido, la estabilidad del plásmido, la incompatibilidad del plásmido, y la varianza plásmido número de copias. Este método usa la integrasa sitio-específico del fago Streptomyces (Φ) C31 ^2,3. La integrasa ΦC31 cataliza la recombinación directa entre dos sitios de ADN específicas: attB y attP (34 y 39 pb, respectivamente) ^4. Esta recombinación es estable y no se volverá ^5. Una "pista de aterrizaje" (LP) consiste en la secuencia de un gen de resistencia a la espectinomicina, aadA (SPR), y E. de la coli ß-glucuronidasa gen (uidA) flanqueado por sitios attP se ha integrado en los cromosomas de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum y Agrobacterium tumefaciens en una región intergénica, el ampC locus, y el locus tetA, respectivamente. S. meliloti se utiliza en este protocolo. Vectores que contienen sitios donantes movilizable attB flanquean una embutidora rojo proteína fluorescente (RFP) de genes y un gen de resistencia a antibióticos se han construido. En este ejemplo la gentamicina pJH110 plásmido resistente se utiliza. El gen rfp ⁶ puede ser reemplazado con un constructo deseado utilizando Sph I y Pst I. Alternativamente una construcción sintética flanqueado por sitios attB puede ser sub-clonado en un vector movilizable como pK19mob ^7. La expresión del gen de la integrasa ΦC31 (clonado a partir de pHS62 ⁸⁾ es impulsado por el promotor lac, en una amplia gama de huéspedes movilizable plásmido pRK7813 ^9.

Un protocolo de apareamiento tetraparental se utiliza para transferir el cassette en la cepa donante LP reemplazando así los marcadores en la secuencia de LP con el cassette de donantes. Estas células son trans-integrantes. Trans-integrantes se forman con una eficiencia típica de 0,5%. Trans-integrantes se encuentran típicamente en los primeros 500-1,000 colonias seleccionadas por la sensibilidad a antibióticos o cribado azul-blanco, utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico (X-gluc). Este protocolo contiene los procedimientos de apareamiento y la selección para la creación y aislando trans integrantes.

Protocolo

1. Producción de la Cultura

1. Preparar los medios líquidos estériles: TY ¹⁰ (5 g / l de triptona, 3 g / l de extracto de levadura, 0,44 g / l de cloruro de calcio dihidrato), y LB ¹¹ (10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 5 g / cloruro de sodio, pH 7).
2. Inocular a partir de una sola colonia: SmUW227 (S. meliloti LP-deformación: la construcción se describe en otro lugar, la cepa detalles de la construcción están disponibles bajo petición) () en 5 ml de TY medios de comunicación con 50 mg / ml de espectinomicina. Inocular las siguientes cepas en 5 ml de medio líquido LB, que complementa con el antibiótico que se administra: E. E. DH5a ¹² contiene pJC2, la expresión integrasa plásmido, con 10 mg / ml de tetraciclina, E. E. MT616 ^13, el activista, con 10 mg / ml de cloramfenicol, y E. E. DH5a contiene pJH110, el casete de plásmido donante, con 5 ug / ml de gentamicina.
3. Incubar E. E. noche a la mañana a 37 y las cepas°; C con agitación constante. Incubar S. meliloti cepa a 30 ° C durante dos días con agitación. Es posible obtener una S. meliloti noche a la mañana con un inóculo grande (1:500 subcultura de una cultura saturada) la cultura.

2. Cultura preparación y mezcla

1. Lavar 1,5 ml de cultivo de cada cepa por recoger el sedimento celular por centrifugación a 17.000 xg durante 30 segundos y resuspender en 1 ml estéril 0,85% de NaCl; repetir una vez.
2. Resuspender el pellet en 100 l de NaCl al 0,85% estéril.
3. Individualmente detectar 10 l de la cultura lavado para cada cepa en una placa de agar simple TY. Estos puntos son puntos de control.
4. Añadir 40 l de cada cepa de E. excluyendo el coli DH5a ^{12 que} contiene pJC2 en un tubo estéril, mezclar, y el punto 120 l de esta mezcla sobre una placa de agar simple TY. Este punto es el control sin la integrasa negativo.
5. Añadir 40 l de cada cepa en un t estérilube, mezcla, y el punto 160 l de esta mezcla sobre una placa de agar simple TY. Este lugar es el lugar de apareamiento IMCE.
6. Permita que los puntos que se seque en una campana de flujo laminar.
7. Sello placas y se incuba a 30 ° C durante la noche.

3. Aislamiento de Trans-integrantes

1. Manchas de imagen unidimensional de control y terreno IMCE sobre discos de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina (SmUW227 se basa en Rm1021 que lleva una mutación que confiere resistencia de alto nivel a la estreptomicina ¹⁴⁾ y gentamicina 30 mg / ml.
2. Para el cálculo de la eficiencia IMCE, resuspender aproximadamente ¼ de la mancha de apareamiento IMCE en 500 l estéril al 0,85% de NaCl. Hacer 10 veces diluciones seriadas de 10 ^-7. Diluciones de placa 10 ^-2 a través de 10 ^-5 en placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina y 30 ug / ml de gentamicina, para seleccionar para trans-integrantes. Diluciones Plate 10 ^-3 through 10 ^-7 en placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina, para seleccionar para ambos trans integrantes y receptores potenciales, es decir, los receptores totales.
3. Para el aislamiento de markerless trans integrantes resuspender aproximadamente un cuarto del punto de acoplamiento IMCE en 500 l de estéril al 0,85% de NaCl. Hacer 10 veces diluciones seriadas hasta 10 ^-6. Placas 10 ^-4 a 10 ^-6 sobre cuatro placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina y 200 ug / ml de X-gluc diluciones.
4. Incubar las placas a 30 ° C durante 3 días.
5. Ver RFP trans-integrantes bajo la luz verde (525 nm) ya través de un filtro rojo (> 610 nm) ^15.
6. Calcular la eficiencia IMCE por ciento de UFC de trans-integrantes en comparación con el UFC de los beneficiarios totales. Aproximadamente la mitad de trans-integrantes se han sometido a cambio de cassette de verdad haciéndolos blanco y espectinomicina sensible.
7. Para encontrar los markerless trans integrantes (waquí el vector de donantes no contiene Gm ^r como en pJH110) la pantalla para una colonia de color blanco (un prolongado período de incubación, 1-2 días adicionales a temperatura ambiente, mejorará la diferenciación de las colonias a través de X-gluc, esto es necesario en S. meliloti SmUW227), confirman la sensibilidad de la colonia espectinomicina por el análisis en una placa de agar TY sin antibióticos y una placa de agar TY que contenía 100 mg / ml de espectinomicina.

4. Los resultados representativos

Después de tres días de incubación en TY complementadas con estreptomicina y gentamicina las rayas de control no debe tener ningún crecimiento. La raya IMCE debe tener crecimiento confluente en la raya de cabeza y muchas colonias en la franja segundo, como se ve en la Figura 2. La eficiencia de trans-integración, expresada como el porcentaje de trans-integrantes a los destinatarios totales, debe estar en el intervalo de 0,5%. Aproximadamente la mitad de trans-integrantes será espectinomicina sensible y blancomostrando que han sido objeto de cambio de cassette de verdad. Trans-integrantes que contienen el cassette probador rfp donante de pJH110 debe mostrar fluorescencia de RFP discernible cuando se observa bajo la luz verde (525 nm) ya través de un filtro rojo (> 610 nm) ^15.

. Figura 1 ilustración mezcla de conjugación: Ayudado por la expresión de los genes de transferencia de pRK600, todos los plásmidos se transfieren al azar de célula a célula. Esta transferencia de los resultados en la creación de trans-integrantes de la mezcla, a través de adquisición del sistema LP-deformación de los dos plásmidos necesarios para IMCE, la integrasa (int) pJC2 plásmido auxiliar y el pJH110 plásmido donante. El cassette de los donantes del plásmido donante no replicante (pJH110) se intercambia a través de la actividad de la integrasa ΦC31 con los marcadores de la LP-cassette en el cromosoma, lo que resulta en la pérdida de la LP-marcadores (Sp.^r y uidA) y el mantenimiento de la casete de donante (RFP y ^r gm) en la resultante trans-integrante.

Figura 2. A: B placa apareamiento lugar en una placa no selectivo TY mostrando mezclas secas de células en la superficie de agar. Manchas de apareamiento en bandas sobre estreptomicina-gentamicina-X-gluc placa, desde la parte superior izquierda hacia la derecha sin control de la integrasa, IMCE en S. meliloti, E. coli DH5a que contiene el control pJC2, E. E. DH5a contiene pJH110 de control, E. E. MT616 de control, y S. . meliloti UW227 de control C: 10 ^-2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-X-gluc agar D:. 10 ^-2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-gentamicina-X-gluc agar (colonias azules son recombinantes individuales, colonias de color blanco han sido objeto de cierto. de cambio de cassette) E: 10 ^-2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-X-gluc agar que muestra la falta de fluorescencia F:. 10 ^-2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-gentamicina-X-gluc agar que muestra a dos niveles de la fluorescencia (más brillantes corresponden a las colonias de colonias de color azul y tienen una mayor expresión de rfp presumiblemente debido a la promotora de lectura-aunque a partir de la secuencia del vector, donde las colonias de haber sufrido cierto-cassette de cambio contienen RFP con sólo su promotor inmediato sin leer a través del promotor lac en el vector, que está ausente.).

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Discusión

La técnica IMCE permite la integración eficiente de un cassette de ADN única attB flanqueado en el LP-locus de una cepa previamente diseñado. Una vez que la construcción deseada se clona en lugar de RFP para crear el casete donante, la técnica no requiere la purificación posterior del ADN y la transformación, lo que es muy robusto. Es crítico que los controles apropiados de crecimiento se incluyen, para estar seguro de la resistencia a los antibióticos se debe a la creación de trans-integran...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Estreptomicina	Bioshop Canada Inc.	STP101
La espectinomicina	Bioshop Canada Inc.	SPE201
Gentamicina	Bioshop Canada Inc.	GTA202
Choramphenicol	Bioshop Canada Inc.	CLR201
La tetraciclina	Bioshop Canada Inc.	TET701
Kanamicina	Bioshop Canada Inc.	KAN201
Agar bacteriológico de grado	Bioshop Canada Inc.	AGR001
Triptona	Bioshop Canada Inc.	TRP402
Extracto de levadura	Bioshop Canada Inc.	YEX401
Cloruro de Sodio	Bioshop Canada Inc.	SOD001
Cloruro de calcio	Bioshop Canada Inc.	CCL444
X-gluc	Gold Biotechnology Inc.	G1281C1
E. coli cepa MT616	Disponible bajo pedido		También se usa fuera de nuestro laboratorio
E. coli cepa pJC2	En la casa, disponible bajo pedido
E. coli cepa pJH110	En la casa, a disposición por request
SmUW227 cepa	En la casa, disponible bajo pedido