La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

Resumen

Una rápida y precisa en el punto de atención de la prueba para la aspergilosis pulmonar invasiva se presenta. Se aprovecha de flujo lateral tecnología utilizando un anticuerpo monoclonal específico que se une a un Aspergillus secretada durante las infecciones pulmonares. El ensayo es compatible con el lavado de suero y brochoalveolar y representa una prueba adyuvante novedoso para el diagnóstico de enfermedades.

Resumen

Aspergilosis pulmonar invasiva (API) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los pacientes hematológicos y tumores malignos madre hematopoyéticas receptores de trasplante de células ^1. Detección de la API representa un reto diagnóstico formidable y, en ausencia de un "estándar de oro", se basa en una combinación de datos clínicos y de microbiología e histopatología cuando sea posible. El diagnóstico de la IPA debe ajustarse a la Organización Europea para la Investigación y Tratamiento del Cáncer y el Instituto Nacional de (EORTC / MSG) Alergias y Enfermedades Grupo de Infecciosas Micología estudio de consenso la definición de "probada", "probable" y "posible" Las infecciones fúngicas invasivas ² . En la actualidad, no a base de ácidos nucleicos, las pruebas han sido validados externamente para la detección de la API y por lo tanto la reacción en cadena de polimerasa (PCR) no está incluido en las actuales EORTC / MSG criterios diagnósticos.

La identificación de Aspergillus en las secciones histológicas es problemático debido a Simiirregularidades en las morfologías de hifas con otros patógenos fúngicos invasivos ^3, y la identificación comprobada requiere el aislamiento del agente etiológico en cultivo puro. Basada en el cultivo enfoques se basan en la disponibilidad de muestras de biopsia, pero éstos no siempre son accesibles en los pacientes enfermos, y no siempre producen propágulos viables para el cultivo cuando se obtienen.

Una característica importante en la patogénesis de Aspergillus es la angio-invasión, un rasgo que ofrece oportunidades para realizar un seguimiento del hongo mediante pruebas inmunológicas que detectan las moléculas antigénicas características de las firmas en el suero y lavado broncoalveolar (LBA) líquidos. Esto ha conducido al desarrollo de la inmunoensayo enzimático Platelia (GM-EIA) que detecta Aspergillus galactomanano y una "pan-hongos 'ensayo (ensayo Fungitell) que detecta la conservada componente fúngico pared celular (1 → 3)-β-D- glucano, pero no en los Mucorales que carecen de este componente en sus paredes celulares ^1,4. Esdemanda que rodea a la exactitud de estas pruebas de ^1,4-6 ha llevado a la reciente desarrollo de la próxima generación de anticuerpos monoclonales (Mab)-basados ​​en ensayos que detectan marcadores de infección ^1,5.

Thornton ⁵ describió recientemente la generación de un anticuerpo monoclonal específico de Aspergillus (JF5) utilizando tecnología de hibridoma y su uso para desarrollar un ensayo inmuno-cromatográfico de flujo lateral del dispositivo (LFD) para el punto de atención (PDA) el diagnóstico de la API. Una ventaja importante de la LFD es su capacidad para detectar la actividad desde el MAb JF5 se une a un antígeno glucoproteína extracelular que es secretada durante el crecimiento activo del hongo sólo ^5. Esta es una consideración importante cuando se utilizan líquidos como BAL pulmonar para el diagnóstico de la API ya que las esporas de Aspergillus son un componente común de aire inhalado. La utilidad del dispositivo en el diagnóstico de IPA se ha demostrado utilizando un modelo animal de infección, donde la LFD muestra sensibilidad mejorada y especificacionesificity en comparación con el MM Platelia y Fungitell (1 → 3)-β-D-glucano ensayos ^7.

A continuación, presentamos un procedimiento sencillo LFD para detectar el antígeno de Aspergillus en el suero y fluidos humanos BAL. Su velocidad y precisión proporciona un complemento de la novela en el punto de atención de la prueba para el diagnóstico de la API en pacientes con neoplasias malignas hematológicas.

Protocolo

1. Recolección, almacenamiento y preparación de los líquidos de lavado broncoalveolar y suero

1. Recoger el suero de las muestras de sangre sin tratar al permitir que la sangre coagule a 4 ° C, y el suero como almacén de alícuotas a -20 ° C antes de su uso. Los líquidos de lavado broncoalveolar (LBA) también se debe almacenar en alícuotas a -20 ° C. Nota: El almacenamiento de suero y BAL como alícuotas limita el potencial de la degradación del antígeno diana por repetidos de congelación-descongelación de las muestras durante las pruebas de repetición.
2. Descongelar las muestras y se mezclan las muestras de suero y BAL bien y centrifugue durante 1 min a 14.000 rpm.
3. Para las pruebas de rutina de muestras de suero humano, diluir el suero 01:01 (v / v) con medio de cultivo tisular (MTC). MTC consta de medio RPMI-1640, 10% (v / v) de suero fetal de ternera, 1% (v / v) de 200 mM de L-glutamina solución, y azida de sodio (0,02% w / v) como conservante. El medio se prepara de antemano y se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses. Echar 100 l de la diluted suero a la LFD.
4. Por BAL fluidos humanos, y para los fluidos de BAL de los modelos animales, se aplican 100 l de muestra pura a la LFD, sin pre-tratamiento.
5. Para el suero de los modelos animales, diluir suero 1:2 (v / v) con tampón fosfato salino que contiene 4% (w / v) de EDTA, el calor para 3min en un baño de agua hirviendo, de centrifugación durante 5 min a 14.000 rpm, y se aplican 100 l de sobrenadante ordenada al dispositivo LFD.

2. La aplicación de suero y BAL en el dispositivo de flujo lateral

1. Almacenar los dispositivos de flujo lateral a temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, los dispositivos son estables durante 12 meses. Retire los dispositivos de las bolsas y colocar en una superficie plana.
2. Usando una punta de pipeta estéril, se aplican 100 l de pre-tratado muestra de suero o BAL ordenada al puerto de liberación del dispositivo.
3. Permitir el ensayo para ejecutar durante 15 minutos a temperatura ambiente, momento en el cual los resultados de las pruebas debe ser registrada. Nota: En cuestión de segundos el líquido se hace a traES a migrar por acción capilar a lo largo de la membrana de nitrocelulosa en la ventana de observación.

3. Registrar e interpretar los resultados LFD

1. El LFD consta de una línea de control interno (indicado por la letra C en la carcasa de plástico) y una línea de prueba (indicado por la letra T). La línea de control siempre debe aparecer independientemente de antígeno de Aspergillus en la muestra de suero o BAL. Esto demuestra que el ensayo ha funcionar correctamente.
2. Si el antígeno de Aspergillus está presente en la muestra de suero o BAL, la línea de prueba aparecerá también dentro de 15 minutos de aplicación de la muestra. Debido a la intensidad de la línea de prueba es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra de Aspergillus, la línea de prueba puede aparecer como un positivo débil (+), una moderada positivo (+ +) o como una fuerte positivo (+ + +) . Sin embargo, cualquier línea de prueba positiva, independientemente de la intensidad, que indicaría la presencia de antígeno de Aspergillus en la muestra. En ªla ausencia del antígeno e de Aspergillus, ninguna línea de prueba aparecerá, y el resultado se registrará como negativo (-).

4. Los resultados representativos

Ejemplos representativos de negativos, positivo débil, positivo moderado, y fuertes resultados positivos LFD con muestras de BAL y el suero se muestra en la Figura 1.

Los resultados de las pruebas de antígeno-positivas UDF (débil y fuerte) o negativas las pruebas de LFD con BAL fluidos de la leucemia mieloide aguda (LMA) de los pacientes diagnosticados de acuerdo a la EORTC / MSG criterios de diagnóstico se muestran en la Tabla 1. Se incluyen en esta tabla son los correspondientes clínica y micológica (galactomanano y la cultura) de datos, y los resultados de una prueba de Aspergillus PCR específica desarrollada en el St. Bartholomew Hospital de ^8, para cada paciente. El diagnóstico de la enfermedad se basa en los factores del huésped (neutropenia, el uso prolongado de corticoides, el tratamiento con otros reconocidos de células T immunosuppressants), criterios clínicos y la positividad de GM para BAL (en este caso definida como un valor de índice de GM> 0,8). En el 2002 EORTC / MSG directrices ^10, 12 pacientes, 13 y 16 fueron diagnosticados con "posible" IA sobre la base de los factores del huésped y los criterios clínicos o de positividad de GM. De acuerdo con la versión revisada (2008) EORTC / MSG directrices ^2, factores del huésped y la positividad de GM por sí solos o factores del huésped y los criterios clínicos por sí solos no indican "posible" infección micótica invasiva, a menos acompañada de la evidencia de los datos clínicos y micología, respectivamente. Paciente 6 fue diagnosticado con "probable" IA, con los dos años 2002 y 2008 debido a las directrices de los factores del huésped, las características clínicas mayores y menores y la positividad de GM. Tenga en cuenta que, si bien ni la LFD, ni los ensayos de PCR están actualmente incluidas en las directrices de EORTC / MSG, hay un fuerte acuerdo entre los dos ensayos y la prueba comercial de galactomanano que indican la presencia de antígeno de Aspergillus y el ácido nucleico en la muestra de BAL s de los pacientes 6 y 12. Los resultados adicionales de los ensayos demuestran la eficacia de los ensayos LFD y PCR en el diagnóstico de IPA se pueden encontrar en Johnson et al ^8.

Figura 1. Negativo (línea de control) y positivo (el control y la línea de la prueba) los resultados de las pruebas de LFD con suero y BAL. Las intensidades de las reacciones de prueba de línea son proporcionales a las concentraciones del antígeno diana en las muestras de suero y BAL. Las reacciones suelen oscilar entre débil (+) a través de moderada (+ +) a fuerte (+ + +). Independientemente de la intensidad de prueba de línea, las tres reacciones positivas de suero que indicaría la enfermedad invasiva aspergilosis pulmonar debido a la presencia de antígeno de Aspergillus que circula en el torrente sanguíneo. Reacciones positivas BAL (débil, moderada o fuerte) podría indicar la germinación de las esporas y el desarrollo de las hifas potencialmente patógeno en los pulmones.

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Paciente no.	Patient información	Criterios clínicos 1	BAL cultura 2	GM EIA índice 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR resultado	Resultado LFD
6	-	Los principales signos de TC (nódulo y el halo) y un menor	Negativo	0,9 (positivo)	Probable	Probable	Positiva	Débil positivo (+)
12	Presunto infección por hongos anterior	No mayor, menor un	Candida glabrata	6,43 (muy positiva)	Posible	Ninguno	Positiva	Fuerte positivo (+ + +)
13	El estafilococo coagulasa-negativosylococcus y E. coli en sangre	N mayor, dos menores	Negativo	0,25 (negativo)	Posible	Ninguno	Negativo	Negativo (-)
16	Infección del tórax;	3 criterios menores incluyen nueva efusión plural infiltrarse en más	Negativo	0,16 (negativo)	Posible	Ninguno	Negativo	Negativo (-)

¹ Los nódulos o halos en una tomografía computarizada es sugestivo de infección por hongos
² Candida glabrata en el líquido de BAL, se consideraría como un contaminante como lo es la levadura segundo más común aislado como parte de la flora normal humanos ^9
3 Un índice de> 0,8 en la prueba de evaluación del impacto ambiental de GM de BAL es un indicador de infección por Aspergillus
⁴ A partir de los 2002 EORTC / MSG criterios de diagnóstico para 'posible "," probable "o" probado "la enfermedad invasiva por hongos ^10
5 Basado en la versión revisada (2008) EORTC / MSG criterios para el diagnóstico de "posible", "probable" o "probado" la enfermedad invasiva por hongos ²

Tabla 1. Resultados de las pruebas LFD de muestras de BAL de pacientes con leucemia mieloide aguda con IPA probable y de control de los pacientes con LMA (sin evidencia de infección) y EORTC / MSG diagnóstico de la infección.

Discusión

La identificación definitiva de la API sólo puede ser verdaderamente alcanzado por el aislamiento del agente etiológico a partir de muestras de biopsia, pero la recuperación de muestras adecuadas a menudo no es posible en pacientes muy enfermos y Aspergillus rara vez es objeto de reembolso a partir de sangre. Mientras los mayores avances se han hecho en el uso de tomografías axiales computarizadas del tórax en el diagnóstico de la API, características que son indicativos de la API pulmonar, tales como el "halo" o "Media Luna" signos de aire son o transitorio o se puede atribuir a los artefactos de respiración u otras infecciones por hongos ^11,12. Estos datos son por lo tanto, complementado con técnicas serológicas que tienen como objetivo identificar las moléculas de la firma (GM y β-glucano) de hongos que están circulando en el suero del paciente o que están presentes en los fluidos del LBA, esputo o muestras de orina ^13. Aunque estos ensayos muestran sensibilidad satisfactoria, carecen de suficiente especificidad o sufren de interferencia bajo ciertas condiciones ^1,6 .

La prueba para la detección de LFD IPA que aquí se presenta permite el diagnóstico del "punto de atención" de la tecnología de la API y las hazañas que se ha utilizado hasta la fecha en las pruebas para la detección de virus, bacterias, parásitos y toxinas ^14-19 y, lo más famoso, para la prueba de embarazo casera introdujo por primera vez Unipath en 1988. En la LFD Aspergillus se describe aquí, los géneros Aspergillus-MAb específico JF5 se inmoviliza a una zona de captura (la línea de prueba) en una membrana de nitrocelulosa poroso. Anti-inmunoglobulina de ratón inmovilizado en la membrana en una zona separada sirvió como un control interno (línea de control). En adición de suero o líquido BAL al puerto de liberación, el MAb JF5-coloidal conjugado de oro en la almohadilla de liberación se une al antígeno diana y el complejo a continuación, pasa a lo largo de la membrana porosa por acción capilar. MAb JF5 inmovilizado en la zona de captura se une a la JF5-oro coloidal-antígeno complejo resultante en una línea de prueba de color rojo. Cualquier JF5 sin consolidar-oro coloidalconjugado se une al control interno que indica que el ensayo ha funcionar correctamente. Esto da como resultado una línea de control rojo.

La prueba es rápida, teniendo tan sólo 15 minutos para llevar a cabo, es barato en comparación con las pruebas de suero y BAL sobre la base de GM y la detección de β-glucano, y no requiere de equipos costosos o amplias instalaciones de laboratorio para correr. Por otra parte, el MAb JF5 no presenta reacción cruzada con los fármacos o contaminantes que se han demostrado para causar falsos positivos en la reacción de GM y β-glucano pruebas ^1,4,6. Una ventaja adicional importante sobre las pruebas de diagnóstico actuales es la capacidad para detectar la actividad LFD que es indicativo del crecimiento invasivo de las especies de Aspergillus.

Un paso crítico en el procedimiento LFD es la necesidad de leer los resultados 15 minutos después de la aplicación de la muestra de suero o BAL al dispositivo. La prueba no se debe dejar por más de 15 minutos antes de registrar los resultados, ya que este resultado puede sesgo interpretatisucesivamente. Una reacción débil no se verá reforzada por la ampliación del período de incubación. El tratamiento térmico de suero de modelos animales de la infección se ha encontrado para mejorar la sensibilidad del ensayo. Una limitación de la prueba es que es cualitativa, y se basa en el operador para hacer una evaluación subjetiva de la positividad. La intensidad de la línea de prueba varía de acuerdo con el contenido de antígeno de las muestras de suero y BAL (Figura 1). Sin embargo, cualquier reacción positiva (determinado por comparación con los negativos conocidos) indica la presencia de antígeno de Aspergillus y por lo tanto la infección. Para limitar la subjetividad de los ensayos de LFD, los dispositivos de mano disponibles que permiten la cuantificación de la LFD intensidades de prueba de línea y permitir el establecimiento de valores umbral para la detección de antígeno ^20.

La evolución futura de la LFD incluyen su comercialización y el desarrollo de un LFD múltiple que permite la detección simultánea de otros patógenos fúngicos invasivosutilizando anticuerpos monoclonales altamente específicos ^3.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aspergillus LFD	Universidad de Exeter		Disponible en el autor correspondiente solicitud de
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-glutamina	Sigma	G7513
Suero de ternera fetal	Biosera	S9100	Otras fuentes de suero fetal de ternera se puede utilizar en la preparación de TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1