Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Resumen

Se describe el uso de la tecnología IMAGESTREAM ( Www.amnis.com), Que combina la citometría de flujo cuantitativa simultánea con imágenes de alta resolución digital, para cuantificar los mecanismos celulares de las células inmunes primarias de cohortes de pacientes bien definidas. Nuestros estudios proporcionan un modelo para las investigaciones traslacionales para cuantificar las respuestas específicas de linaje celular en pequeñas muestras de cohortes de sujetos.

Resumen

Las variaciones individuales en el estado inmunológico determinar las respuestas a la infección y contribuyen a la severidad de la enfermedad y los resultados. El envejecimiento se asocia con una mayor susceptibilidad a las infecciones virales y bacterianas y la disminución de la capacidad de respuesta a las vacunas con una disminución bien documentada en la humoral, así como mediada por células respuesta inmune ^1,2. Recientemente, hemos evaluado los efectos del envejecimiento sobre los receptores tipo Toll (TLR), los componentes clave del sistema inmune innato que detectan la infección microbiana y de disparo antimicrobianos respuestas de defensa del huésped ^3. En una gran cohorte de donantes humanos sanos, mostró que los monocitos de sangre periférica de la tercera edad han disminuido expresión y función de los TLR ciertos ⁴ y similares niveles de reducción de TLR y respuestas de señalización en las células dendríticas (DC), células presentadoras de antígenos que son fundamentales en el el vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa ^5. Hemos demostrado la desregulación de TLR3 en los macrófagos unad menor producción de IFN por países en desarrollo procedentes de donantes de edad avanzada en respuesta a la infección con el virus del Nilo Occidental ^6,7.

De suma importancia para nuestra comprensión de la inmunosenescencia y para la intervención terapéutica es una comprensión detallada de determinados tipos de células que responden y el mecanismo (s) de la transducción de señales. Los estudios tradicionales de la respuesta inmune a través de imágenes de células primarias y de topografía marcadores celulares por citometría de flujo o inmunoblot han avanzado de manera significativa nuestra comprensión, sin embargo, estos estudios se limitan generalmente técnicamente por el pequeño volumen de muestra a disposición de los pacientes y la incapacidad para llevar a cabo complejas técnicas de laboratorio en múltiples muestras humanas. IMAGESTREAM combina con la citometría de flujo cuantitativa simultánea de imágenes de alta resolución digital y por lo tanto facilita la investigación en poblaciones de células múltiples simultáneamente para una captura eficiente de la susceptibilidad del paciente. Aquí se demuestra el uso de IMAGESTREAM en países en desarrollo para evaluar TLR7 / 8mediada por la activación de los aumentos en la fosforilación y translocación nuclear del factor de transcripción clave, NF-kB, que inicia la transcripción de numerosos genes que son críticos para la respuesta inmune ^8. Utilizando esta tecnología, también hemos demostrado recientemente una alteración previamente desconocida de TLR5 y la vía de señalización de NF-kB en los monocitos de donantes mayores que pueden contribuir a la capacidad de respuesta inmune alterada en el envejecimiento ^9.

Protocolo

1. El aislamiento y la estimulación de las células inmunes

1. Obtener 10-50 ml de sangre heparinizada de voluntarios sanos después de consentimiento informado por escrito en virtud de las directrices de la Junta de Revisión Institucional local. Para los estudios de envejecimiento o la enfermedad de la patogénesis, la exclusión y los criterios de inclusión para cada voluntario o el paciente tiene que determinarán de forma expresa.
2. Aislar las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con CPT o tubos de Ficoll Paque-Plus de acuerdo a las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, NJ) y realizar experimentos en el día de aislamiento ⁷ (reactivos, tabla 1).
3. Incubar PBMC (3 x 10 ⁶ / tubo) en tubos de 1,5 ml en medio 0,6 ml solos o estimulados con ligandos TLR u otros agentes activantes, por ejemplo, el ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de medio, más 0,6 l de 10 mM de TLR7 / 8 ligando R848, concentración final 10 mM) a 37 ° C durante 10-60 minutos (Invivogen, CA) ^9.

2. LaboratorioEling de las células

1. Etiqueta de linaje celular y otros marcadores de superficie en las suspensiones de células vivas con fluorescencia utilizando anticuerpos conjugados. Etiqueta 3 x 10 ⁶ PBMC durante 20 min a 4 ° C en 100 l de PBS / 2% de FBS en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con un cóctel de anticuerpos específicos de superficie para los linajes de monocitos o DC (Tabla 2). Diluciones óptimas de anticuerpos se puede determinar en experimentos preliminares y las muestras deben ser procesados ​​en lotes para minimizar lote a lote variación. Para la acción vendedor anticuerpo de 0,1 mg / ml de usar 5 l de anticuerpo (1:20 dilución). Utilizar un tubo separado de las células marcadas con sólo un conjugado de un solo color para configurar los canales fluorescentes en el instrumento.
2. Después de etiquetado superficie, fijar las células en PFA 4% / PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Para el almacenamiento hasta el momento del análisis, las células centrifugar a 500 xg, y volver a suspender las células en tampón de congelación (90% de FBS que contiene 10% de DMSO) a -80 ° C hasta que el día de ensayo.
3. Para la evaluación, el proceso de lotes of células no tratadas y estimulado de un grupo de donantes a fin de minimizar la variabilidad. En el día de análisis, las células descongelación rápida en 37 ° C baño de agua, se centrifuga a 500x g para eliminar tampón de congelación.
4. Para permeabilizar las células para la detección de citoquinas intracelulares u otros marcadores, suspensiones volver a suspender las células en 100 l BD Perm / Wash buffer (BD Biosciences, NJ). Etiqueta para los componentes intracelulares de señalización con, por ejemplo, una dilución de 1:20 de conejo anti-NF-kB (p65), anticuerpo (concentración final de 10 mg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a temperatura ambiente, se centrifuga a 500 xg, sobrenadante aspirado y Resuspender las células en 100 Perm BD l / tampón de lavado que contiene 1:250 dilución de cabra anti-IgG de conejo-Alexa647 (Invitrogen, CA) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
5. Inmediatamente antes de la formación de imágenes, contratinción núcleos con DAPI (0,2 g / ml, Invitrogen, CA) o yoduro de propidio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. Análisis IMAGESTREAM

1. Llevar a cabo por la imagen IMAGESTREAM en muestras de lotes para reducir la variabilidad entre las muestras humanas. Ajuste del equipo para poder de los láseres fueron como sigue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm y 250 mW para 405 nm.
2. Para el análisis de archivos de datos (Fig. 1), en primer lugar, la puerta de eventos con la intensidad de PI normal y alta relación de aspecto de PI (ancho: relación altura) para distinguir células individuales (R1) de los desechos (de baja intensidad PI) o los eventos multi-celulares ( PI de alta intensidad y baja relación de aspecto). Los monocitos se encuentran dentro de una puerta para células CD14 positivas. mDCs se encuentran dentro de una puerta de las celdas que tienen un alto contenido de CD11c y bajo de CD4 (R2) y baja también por Lin-1 marcadores (R3).
3. Utilizar ideas de software (Amnis, WA) para proporcionar una medida eficaz cuantitativa del grado de activación de cada celda. Determinar la similitud (o co-localización) del factor de transcripción NF-kB citoplasmática con la energía nuclear tinte de PI para indicar la translocación en el núcleo (R4). Una alta correlación de NF-κB/PI localización se refleja en una puntuación de similitud elevada e indica el grado de activación ^10.
4. Comparar los índices de similitud entre los diferentes grupos de tratamiento o poblaciones de pacientes para indicar la eficiencia relativa funcional de las células. Cuantificar los datos entre las muestras a través de la comparación estadística de los valores absolutos o las diferencias de plegado. Utilice el software de IDEAS para mostrar imágenes de las células de los principales segmentos de la población de histogramas (Fig. 2).

4. Los resultados representativos

Hemos cuantificado vías de señalización en respuesta a un ligando modelo viral mediante la estimulación de PBMC con el ligando TLR7 / 8, R848 (fig. 1). Se recogieron las dos imágenes de localización de celulares y las estadísticas de población en los grupos de la muestra (Fig. 2). IMAGESTREAM nos permite subconjuntos de células de puerta directamente de CMSP y las respuestas de imágenes de células de las poblaciones de células cerradas, pero sin clasificar. Aquí hemos cuantificado el efecto de los TLR signaling en la localización nuclear de NF-kB (p65) en Lin1-, CD4 tenue, CD11c + DCs mieloides (mDCs). Al inicio del estudio, se observó un alto porcentaje de células no estimuladas con el factor de transcripción NF-kB (p65) en el citoplasma. Después de la estimulación, las células tratadas tienen una puntuación significativamente más alta similitud de NF-B (p65) con PI tinción nuclear, lo que indica que el NF-kB (p65) trasladadas en el núcleo después de la estimulación (mediana de las puntuaciones de similitud son 1,52 y 3,01, respectivamente, la figura. 2). Resultados similares se observan en TLR5 estimulados monocitos ^9.

Figura 1. Tinción y estrategia de apertura de puerta para cuantificar los efectos de la estimulación en mDCs humanos. El factor de transcripción NF-kB regula la expresión de numerosos genes del sistema inmunológico. Este estudio mide la localización nuclear de NF-kB (p65) en mDCs sujeto representativo de uno después de TLR7 / 8 liga ª estimulación. En foco las células individuales fueron identificados por la compuerta de PI eventos positivos con altas proporciones de aspecto nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) fueron cerrada en R3. Localización nuclear de NF-kB (p65) se representa en la R4. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. . La translocación de NF-kB en mDCs después de la estimulación La translocación de NF-kB (p65) en el núcleo después de la estimulación (R4) se representa en las poblaciones de mDCs no tratados y estimulados, la puntuación de similitud promedio es de 1,52 en la muestra sin tratar y 3,01 en el la muestra estimulada (A). Las imágenes digitales recogidas de forma simultánea de las poblaciones de células no tratadas o R848 estimulados muestran células representativas y la intensidad de NF-B trasladadas en el núcleo de la célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.

Discusión

Los pasos críticos en el uso de IMAGESTREAM para los estudios de traducción son la selección de los grupos de comparación relevantes y la optimización y validación de la especificidad del anticuerpo. Las diferencias entre los grupos de sujetos en el objetivo marcado será fácilmente evidente a través de histogramas y las imágenes de células. En combinación con un análisis exhaustivo de los cambios en los receptores relevantes y vías de señalización, estos datos proporcionan información valiosa sobre los ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-R848
El paraformaldehído (16%)	Microscopía Electrónica de Ciencias	15710
BD Perm / Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Cóctel de Lineage 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
de conejo anti-NF-kB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 de cabra anti-IgG de conejo	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
IMAGESTREAM X	Amnis

Tipo de célula	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocitos		CD14	NF-kB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4