Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría

Resumen

La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.

Resumen

Después de su liberación en la hendidura sináptica de dopamina, ejerce sus propiedades biológicas a través de sus objetivos pre y post ^{sináptica-1.} La señal de la dopamina se termina por difusión ^2-3, enzimas extracelulares ^4, y transportadores de membrana ^5. El transportador de la dopamina, que se encuentra en la hendidura peri-sináptica de las neuronas de dopamina despeja las aminas liberadas a través de un flujo de dopamina hacia adentro (absorción). El transportador de la dopamina también puede funcionar en sentido inverso para liberar aminas del interior al exterior en un proceso llamado transporte hacia el exterior o flujo de salida de la dopamina ^5. . Hace más de 20 años atrás Sulzer et al informaron el transportador de dopamina puede funcionar en dos modos de actuación: avance (absorción) y marcha atrás (flujo de salida) ^5. El neurotransmisor liberado a través de flujo de salida a través del transportador puede mover una gran cantidad de dopamina en el espacio extracelular, y se ha demostrado que desempeñan un papel regulador importante en dopamina extracelular homeostasis ^6. Aquí se describe cómo patch clamp y la grabación simultáneas amperometría se puede utilizar para medir la dopamina liberada mediante el mecanismo de eflujo con resolución de tiempo de milisegundos cuando el potencial de membrana se controla. Por esto, su conjunto de células actuales y oxidativa (amperométrico) señales se miden simultáneamente utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, con un conjunto de paso bajo del filtro de Bessel a 1.000 Hz para células enteras de grabación actual). Para amperometría grabación de un electrodo de fibra de carbono está conectado a un segundo amplificador (Axopatch 200B) y se coloca adyacente a la membrana plasmática y se mantuvo a +700 mV. Las células enteras y oxidativa (amperométrico) corrientes puede ser grabado y la actual relación de tensión puede ser generada utilizando un protocolo de paso de tensión. A diferencia de la calibración habitual amperométrica, que requiere la conversión a concentración, la corriente se comunica directamente sin tener en cuenta el volumen efectivo ^7. Así, los datos resultantesrepresentan un límite inferior para el eflujo de dopamina porque algunos transmisor se pierde a la solución a granel.

Protocolo

1. Equipos y Suministros

1. Montar una jaula de Faraday en la parte superior de la mesa de vibración anti (TMI) para disminuir el ruido de fondo.
2. La abrazadera simultánea parche amperometría sistema de grabación necesita un microscopio invertido con excelentes óptica DIC y una larga distancia de trabajo de la lente. Conecte el microscopio faro a una batería de coche. Esta fuente de luz de CC para el sistema disminuirá aún más el ruido eléctrico.
3. Micromanipuladores hidráulicas (Siskiyou) nueva disminución de ruido. En nuestra configuración, se utiliza un manipulador diestro para la grabación de célula entera, y el zurdo de amperometría.

2. Preparar Electrodos para grabación

1. Tire de electrodos de conexión utilizando pipetas de cuarzo en un extractor P-2000 (Sutter). Nuestra tracción dura aproximadamente 5 segundos, con dos ciclos de calor. Esta vez, el calor ha dado lugar a una resistencia consistente (3-4 mW) en nuestros pipetas de células enteras patch.
2. Llenar el electrodo con lapipeta solución que contiene 2 mM de dopamina y montarlo en el manipulador derecha. Envolver el recipiente que contiene la solución de la pipeta que contiene DA con papel de aluminio. Mantenga en hielo. La dopamina es oxidable. Manteniendo la solución en hielo, protegidos de la luz disminuirá la tasa de oxidación de la dopamina.
3. Retire suavemente un ProCFE (Dagan) de carbono bajo ruido electrodo amperométrico de fibra de la caja de almacenamiento, llenar con mercurio, montaje sobre el adaptador amperométrica (como se representa en la Figura 1) y, a continuación, montar en el maniupulator derecho. Proteger el extremo de la fibra de carbono de daño al sujetar el extremo de la fibra de carbono. Inspeccionar el electrodo con un microscopio de laboratorio para asegurarse de que la punta esté limpio e intacto.
4. Examinar la integridad del electrodo amperométrico por poner el electrodo en un fondo del plato Petri de vidrio que contiene la solución externa. Grabar una corriente de línea de base en la ausencia de dopamina. Añadir 10 l de una solución 1 mM de DA al plato. Una re bueno electrodo amperométricocables de un aumento en la corriente oxidativo. Repita este paso en el inicio y el final de cada experimento para asegurarse de que el electrodo amperométrico funciona correctamente.

3. Preparar el cultivo primario de neuronas de dopamina neuronal o Células modificadas genéticamente para expresar transportador de dopamina en placas de Petri de vidrio de fondo

1. Lave suavemente las células o neuronas de dopamina tres veces con solución externa caliente.
2. Monte el plato de Petri con fondo de cristal en la platina del microscopio.

4. Visualice la célula y realizar Experiment

1. Encuentre el punto focal correcta para visualizar claramente las celdas. Coloque presión positiva en el electrodo de parche. Entonces, pase suavemente hacia abajo ambos electrodos en la solución, y cerca de la célula.
2. Coloque el electrodo amperométrico próximo a la célula (en el lado izquierdo), y el electrodo de parche a la derecha.
3. Alcanzar un sello gigaohmio en la celda con el electrodo de parche. La rotura del sello con succión alograr la configuración de células enteras.
4. Permitir 5-8 min para la diálisis de la solución interna que contiene la dopamina en la célula.
5. Utilice paso deseado de tensión o de protocolo de rampa. Simultáneamente adquirir datos de que la pipeta del parche y el electrodo amperométrico para medir las corrientes de células enteras y el transporte inverso de la dopamina a través del transportador de la dopamina, mientras que el potencial de membrana se controla a través de la pipeta de parche.

Resultados

Patch clamp combinada con amperometría puede medir el voltaje dependiente de DAT mediada por flujo de salida de DA. Figura 2A muestra una configuración representativa experimental y grabación de DAT mediada por flujo de salida de DA cuando el medio intracelular y el potencial de membrana se sujeta mediante una pipeta zonal de célula completa. Usando esta técnica, las células que expresan YFP-DAT proteínas tienen tensión fijada con una pipeta de células patch entero mientras que un electrodo amp...

Discusión

Simultánea de fijación de voltaje y amperometría tiene las siguientes ventajas. Todos los tipos de células son accesibles y se pueden utilizar para la grabación. La identificación de las células o neuronas donde las grabaciones son realizadas es sencilla y directa. En particular, si la celda está marcada con fluorescencia mediante la adición de una etiqueta fluorescente para la proteína de interés, el experimentador puede seleccionar fácilmente la célula diana o neurona. La configuración experimental permi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Equipo
Anti-vibración tabla w / jaula de Faraday	Técnico Manufacturing Corporation	63-500 serie	utilizamos el modelo 63-543
Microscopio invertido Nikon TE-2000	Nikon	suspendido	ahora Eclipse Ti
Dos amplificadores de bajo ruido Axopatch 200B	Molecular Devices		800-635-5577
1-CV 203 BU headstage	Molecular Devices		800-635-5578
1-HL-U pipeta titular	Molecular Devices		800-635-5579
Digidata 1440A convertidor A / D	Molecular Devices		800-635-5580
Dos manipuladores Siskyou, a la izquierday la mano derecha	Siskiyou	MX6600R MX6600L	877-313-6418
Laser pipeta extractor	Sutter Instruments	P-2000	888-883-0128
Bajo nivel de ruido de fibra de carbono electrodo amperométrico	ProCFE		www.dagan.com
Bajo nivel de ruido cuarzo pipeta	Sutter Instruments	QF100-70-7,5	888-883-0128
12-voltio la batería del coche			ampliamente disponibles
Carga de los elementos			ampliamente disponibles
			Reactivo
De cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S7653
HEPES	Sigma	H3375
Dextrosa	Sigma	G7528
Sulfato de magnesio (MgSO 4)	Sigma	M2643
Potasio fosfato monobásico (KH 2 PO 4)	Sigma	P5655
El cloruro de potasio (KCl)	Sigma	P9333
El calcio dihidrato de cloruro (CaCl 2 • 2H 2 0)	Sigma	223506
Magnesio cloruro hexahidrato (MgCl 2 • 6H 2 0)	Sigma	M2670
EGTA	Sigma	E0396