Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Resumen

Hemos desarrollado una plataforma de microarrays de alta densidad que consiste en 3D nano-biopelículas de C. albicans Llamada Ca BChip. El perfil de susceptibilidad de medicamentos probados en una Ca BChip es comparable a la del modelo convencional de la placa de 96 pozos, lo que sugiere que el chip de hongos es ideal para una verdadera selección de alto rendimiento de los fármacos antimicóticos.

Resumen

Candida albicans sigue siendo el principal agente etiológico de la candidiasis, que actualmente representa la infección nosocomial cuarto torrente sanguíneo más común en los hospitales de Estados Unidos ^1. Estas infecciones oportunistas constituyen una amenaza creciente de un número creciente de individuos comprometidos, y llevar a las tasas de mortalidad inaceptablemente alta. Esto es en parte debido al arsenal limitado de fármacos antifúngicos, sino también a la aparición de resistencia contra los agentes más comúnmente utilizados antifúngicos. Para complicar más el tratamiento es el hecho de que una mayoría de las manifestaciones de la candidiasis están asociados con la formación de biopelículas, y dentro de estas células biopelículas muestran mayores niveles de resistencia a la mayoría clínicamente utilizados agentes antifúngicos ^2. Aquí se describe el desarrollo de una micromatriz de alta densidad que consiste de C. albicans nano-biopelículas, que hemos denominado Ca BChip ^3. En pocas palabras, un microarrayer robótica se utiliza to las células de levadura de impresión de C. albicans sobre un sustrato sólido. Durante la impresión, las células de levadura están encerrados en una matriz tridimensional utilizando un volumen tan bajo como 50 nL y inmovilizado sobre un sustrato de vidrio con un recubrimiento adecuado. Después de la impresión inicial, los portaobjetos se incubaron a 37 ° C durante 24 horas para permitir el desarrollo del biofilm. Durante este período, los puntos se convierten en la plena madurez "nano-biofilms" que muestran las características típicas estructurales y fenotípicos asociados con la madurez C. albicans biopelículas (es decir, la complejidad morfológica, tres dimensiones y la arquitectura de resistencia a los medicamentos) ^4. En general, el BChip Ca está compuesto de ~ 750 biopelículas equivalentes y distinta espacialmente, con la ventaja adicional de que múltiples chips se pueden imprimir y procesan simultáneamente. La viabilidad celular se calcula midiendo la intensidad de fluorescencia de Fun1 metabólica mancha utilizando un escáner de microarrays. Este chip de hongos es ideal para la Use en verdad cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos antifúngicos. En comparación con los estándares actuales (es decir, el modelo de microtitulación de 96 pocillos de la formación de biopelículas ^5), las principales ventajas del chip biopelícula hongos son automatización, miniaturización, el ahorro en la cantidad y el coste de los reactivos y el tiempo de análisis, así como la eliminación del trabajo pasos intensivos. Creemos que el chip de tal forma significativa a acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos antifúngicos.

Protocolo

1. Preparación de las diapositivas funcionalizados

1. Coloque los portaobjetos en un bastidor deslizante extraíble, y lavar dos veces por inmersión en una cubeta que contiene 99% de etanol (grado histológico). Limpie las diapositivas limpiar con toallas de papel (para asegurar que no genere polvo de papel), y seca con un chorro de gas nitrógeno comprimido.

NOTA: No utilice paños de Kim-para eliminar las diapositivas, ya que podría generar el polvo de papel fino.

2. Sumerja la parrilla corrediza que contiene las diapositivas en una cubeta llena de ácido sulfúrico concentrado y se incuban a temperatura ambiente durante la noche.

NOTA: Para evitar el contacto con la piel, use guantes resistentes y gafas de seguridad mientras se trabaja con ácidos concentrados y productos químicos tóxicos y corrosivos.

3. Soníquelos las diapositivas durante 30 min y lavado con agua Milli-Q (18 MW) de agua durante 30 minutos, siga con otro lavado en uncetona durante 5 min. Este tratamiento expone los grupos de silanol en la superficie del vidrio.
4. Cubrir las diapositivas limpias con 2,5% (vol / vol en agua) de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) solución, sumergiendo la rejilla deslizante en APTES durante 30 minutos, lavado 3 veces en agua Milli-Q durante 15 minutos cada lavado, y hornear las diapositivas en un horno a 110 ° C durante 15 min. Horneado permite la reticulación de los APTES, resultando en-NH2-funcionalización de la superficie.

NOTA: Hacer la solución APTES en un recipiente de plástico ya que los depósitos APTES preferentemente en las paredes del recipiente de vidrio.

5. Usando una revestidora de giro, recubrir las diapositivas con 1% (peso / volumen en tolueno) Poliestireno-co-anhídrido maleico (PS-MA) (Sigma) para lograr una mono-capa de revestimiento hidrófobo ^6. Añadir 2,0 ml de PS-MA en un portaobjetos de vidrio limpio montado en una recubridora de rotación y la capa a 3.000 rpm durante 30 s. Estas condiciones pueden variar en función de los parámetros de recubrimiento por rotación, tales como revestimiento por lolución, el sustrato, el espesor de recubrimiento y se rige por la siguiente ecuación ⁷

donde h es el espesor de recubrimiento de película, e es la tasa de evaporación, η, C y ρ son la viscosidad, la concentración y la densidad de la solución de revestimiento, respectivamente, y ω es la velocidad angular.

NOTA: El tolueno es perjudicial cuando se inhala por un largo tiempo y el uso de una campana de humos se recomienda.

6. Las diapositivas se pueden almacenar en un soporte de diapositivas para un máximo de un mes en lugares secos y libres de polvo las condiciones de temperatura de 2 - 8 ° C.

2. Preparación de los inóculos de levadura y la encapsulación de colágeno

1. Preparar un cultivo de una noche de C. albicans cepa SC5314, en levadura peptona dextrosa [YPD; 10 g / L de extracto de levadura, peptona 20 g / L y 20 dextrosa g / l] medio líquido mediante la inoculación de una sola colonia de C. alalbicans en 10 a 20 ml de YPD ^8. Incubar la cultura en un agitador orbital (alrededor de 150 a 200 rpm) a 30 ° C durante la noche. Cosecha 1 mL de Candida albicans de células de levadura durante la noche culturas YPD (por centrifugación a 5.000 rpm durante 5-10 minutos) y se lava dos veces durante 10 minutos en 1 ml de solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS; tampón fosfato 10 mM, 2,7 mM de cloruro de potasio, 137 mM de cloruro de sodio, pH 7,4) (Sigma) por lavado. Cosecha lavaron las células también por centrifugación a 1900 rpm durante 10 minutos. Resuspender las células lavadas en 1 ml de tampón de reconstrucción (0,2 N solución de NaOH con bicarbonato de sodio 2,2% (peso / vol) y 4,8% (peso / vol) de HEPES, pH 7,2).

NOTA: C. albicans es un microorganismo del grupo de riesgo 1/BSL1. Recuerde siempre utilizar buenas técnicas de asepsia / estéril para trabajar con este microorganismo y seguir los procedimientos institucionales para la disposición apropiada de los materiales de riesgo biológico.

2. Contar las células usando un hemocytOmeter en un microscopio de campo brillante y ajustarse a una densidad celular de 5 x 10 ⁷ células / ml.
3. Además diluir la suspensión diez veces por adición de 10 x RPMI-1640 suplementado con L-glutamina y tamponado con morpholinepropanesulfonic (MOPS) de ácido (pH 7,2).
4. Encapsular las células de levadura en el colágeno mediante la mezcla de la suspensión de células en RPMI-1640 con colágeno (1,8 mg / ml) (Tipo 1 de cola de rata, BD Biosciences, Bedford, MA), para obtener una concentración final de 4 x 10 ⁶ células / ml. Mantener la suspensión de colágeno de células en hielo para evitar la gelificación de colágeno antes de imprimir.

3. Preparación de Ca BChip

1. Limpie y desinfecte todas las superficies del microarrayer, incluyendo la placa de la fuente emisora, el lavado y la estación de vacío, plato deslizante de vacío y la cámara de impresión, frotándolo con isopropanol al 70%.
2. Colocar y mantener al vacío el número deseado de portaobjetos de vidrio PS-MA-recubiertos en la cubierta deslizante del micrófonoroarrayer.
3. Vórtice de la suspensión de células de colágeno y aspirar con fuerza 100 L de la suspensión bien mezclada en un pocillo de una placa de 96 pocillos, justo antes de imprimir. Coloque este plato de origen en la estación de carga.
4. Conectar el humidificador para mantener una humedad relativa del 100% en la cámara de microarrays en todo el proceso de impresión.
5. Imprimir 50 º latitud norte de la suspensión de células en una matriz de 48 filas y 16 columnas con puntos espaciados 1,2 mm de distancia con un vigilante de microarrays (Omnigrid Micro, Digilab Inc., Holliston, MA) por el depósito sin contacto utilizando cónica consejos de orificio 190 micras de cerámica (Digilab).
6. Primer, enjuagar y secar al vacío-las puntas de dos veces después de cada ronda de la impresión.
7. Inmediatamente después de la impresión, coloque el portaobjetos en un espacio cerrado, cámara húmeda (cassette de hibridación, Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA) y se incuba a 37 ° C durante 24 horas para permitir la formación de biopelículas.

4. Pruebas de sensibilidad de la Preformed biopelículas en Ca BChip contra los agentes antifúngicos

1. Desde soluciones madre o polvo de fármacos antifúngicos, preparar una solución de trabajo en medio RPMI-1640. Las concentraciones típicas de máximos de la solución de trabajo son 1.024 mg / ml para fluconazol y 16 mg / ml para la anfotericina B ^5. Otras concentraciones puede ser utilizado para diferentes agentes.
2. Preparar ocho diferentes concentraciones del compuesto mediante la dilución de la solución madre en dos diluciones, que abarca una gama con el estimado IC ₅₀ del compuesto en el medio.
3. Después de 24 horas de formación de biopelículas, utilice el microarrayer para imprimir 50 º latitud norte de ocho diferentes concentraciones de los fármacos, junto con el positivo (es decir, no hay células de drogas en los medios de comunicación sólo) y negativo (tratamiento con hipoclorito de sodio durante 20 minutos) controles de, al menos en seis repeticiones en la parte superior de las biopelículas.

NOTA: Mantener una humedad relativa del 100% para evitar el secado de las manchas mientras complementoIng las drogas.

4. Poco después de la adición de las drogas, se incuba el chip con las drogas en una cámara húmeda a 37 ° C durante 24 horas.
5. Lavar las drogas fuera por mojar la CaBChip 3-5 veces durante 2 minutos cada vez en PBS y se tiñen mediante la incubación de la BChip Ca con 0,5 mM Fun1 a 37 ° C durante 30 min ^9.
6. Lave la mancha por meter el BChip Ca 3-5 veces en PBS durante 1-3 min cada mate, y secar la BChip CA mediante una corriente de nitrógeno. Leer la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microarrays (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) a una longitud de onda de 532 nm con una ganancia de PMT 380.
7. Ajuste la intensidad de fluorescencia del control positivo (sin drogas) y muertos (lejía) tratados con manchas de biopelículas en 100% y 0%, respectivamente.
8. Determinar el porcentaje de inhibición por la reducción en la intensidad de fluorescencia (F) en relación con la media de los puntos de control utilizando la siguiente ecuación

donde F, F _max y F son primas _o la intensidad de fluorescencia de las drogas, el control no se trata de drogas y los puntos tratados con cloro, respectivamente. La configuración del escáner se ajusta para obtener F _max y F _o de 30000 y 4000 RFU, respectivamente.

9. Calcular la concentración inhibitoria del 50% o IC ₅₀ mediante el ajuste de la ecuación la variable pendiente de la colina con el software GraphPad Prism (La Jolla, CA).

5. Los resultados representativos

Un representante de Ca BChip, que consiste en una matriz de 48 × 16 de la nano-biopelículas de C. albicans, se muestra en la Figura 2. La microscopía de campo claro muestra una característica general de arquitectura de la nano-bio-película. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido de la demostración de que la biopelícula hifas de los hongos están incrustados en la matriz defibras de colágeno, que son aproximadamente 2 micras y 100 nm de diámetro, respectivamente. Las imágenes de microarrays Fun1 manchadas de escáner muestran la levadura y las formas de hifas, que son característicos de las biopelículas fúngicas. Las imágenes de fluorescencia 2D-3D y confocal de Fun1-teñidos de biopelículas se puede ver que tienen heterogeneidad espacial, con las regiones de las células metabólicamente activas intercalados dentro de la matriz extracelular (compuesta de colágeno como el material de encapsulación y muy probablemente también de material producido por exopolimérica biofilm las células), que no está manchada por el colorante metabólico. El espesor de la biopelícula se estimó en aproximadamente 50 micras. El BChip Ca se utilizó para estimar la susceptibilidad antifúngica de dos fármacos, fluconazol y anfotericina B, y los resultados se muestran en la Figura 3. De acuerdo con informes publicados sobre el estándar de la industria 96-y los ensayos de placa, las biopelículas son resistentes a fluconazol ¹⁰ y el ₅₀ para calcular IC anfotericina B es de 0,3 mg / ml ^11.

Figura 1. Diagrama de flujo para la fabricación de Ca BChip.

Figura 2. Una imagen de la BChip alta thoughput Ca, impreso con un microarrayer robótico y que contiene 768 puntos en PS-MA-revestida de diapositivas. Cada punto es semiesférica 50 nL en volumen, aproximadamente 700 micras de diámetro, y con una separación de 1,2 mm entre los puntos. También se muestra (a la derecha) son la microscopía de luz, lector de microarrays, la microscopía de 2D y 3D de fluorescencia, y escaneado de imágenes de microscopía electrónica de las biopelículas individuales en el BChip Ca. La cifra de SEM a gran aumento de 25.000 x muestra un filamento de hifas de 2 micras de ancho.

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Figura 3. Los resultados de las pruebas de sensibilidad antifúngica y la determinación de _valores de IC50 para (A) fluconazol y (B) con la anfotericina B Ca BChip. Las imágenes de microscopio de fluorescencia de anfotericina B tratados con biopelículas se muestran en (C). Los resultados son la media ± error estándar de la media de dos chips independientes que contienen 10 repeticiones para cada condición.

Discusión

Hemos desarrollado una base de células de alta densidad de microarrays, Ca BChip, que consta de los volúmenes de nanolitros de Candida albicans biopelículas. El microarray fue impreso en el vidrio modificado sustratos, lo que permitió para la fijación sólida de los puntos de gel de colágeno mientras que proporciona hidrofobicidad necesaria para la no propagación de gel 3D hemisférica. Una sola BChip Ca puede reemplazar aproximadamente ocho placas de 96 pocillos, y varios chips se pued...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
3-aminopropiltrietoxisilano (APTES)	Sigma-Aldrich	440140
Poliestireno-co-anhídrido maleico (PS-MA)	Sigma-Aldrich	426946
Portaobjetos de vidrio de microscopía	Fisher Scientific	12-549-3
Cola de Rata colágeno tipo I	BD Biosciences	354236
Robótica Microarrayer	Omnigrid Micro	MICROSYS4000/4100A
Microarray Scanner	Genepix personal 4100A	GENEPIX4100A
La hibridación de cassette	Arrayit Corporación	AHCXD
Fun1 [2-cloruroRO-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiazol-2-il)-metiliden)-1-fenil quinoliniumiodide]	Invitrogen Corp.	F-7030
Fluconazol	Sicor Pharmaceuticals, Inc.	J02AC01
La anfotericina B	Sigma	A2411
RPMI-1640	Mediatech, Inc.	50 a 020-PC
Consejo de cerámica 190 m del orificio	Digilab	60020441-00
GraphPad Software Prism	GraphPad Software, Inc.
GenePix Pro V4.1	Molecular Devices