Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

Resumen

Este es un método rápido y completo de inmunofenotipo mieloide derivados de células supresoras (MDSC) y enriquecedora Gr-1 ⁺ Leucocitos de bazos de ratones. Este método utiliza la citometría de flujo y Celular AutoMACS clasificación para enriquecer viables Gr-1 ⁺ Leucocitos antes de FACS clasificación de MDSC para su uso En vivo Y In vitro Ensayos.

Resumen

MDSC son una población heterogénea de los macrófagos, células dendríticas inmaduras y granulocitos que se acumulan en los órganos linfoides en condiciones patológicas, incluyendo la infección parasitaria, inflamación, estrés postraumático, la enfermedad de injerto contra huésped, la diabetes y el cáncer de ^1-7. En ratones, MDSC expresa Mac-1 (CD11b) y Gr-1 (Ly6G y Ly6C) antígenos de superficie ^7. Es importante señalar que MDSC se ha estudiado bien en varios portadores de tumores anfitriones donde son significativamente expandidas y reprimir anti-tumorales respuestas inmunes frente a las contrapartes no tratados previamente ^7-10. Sin embargo, dependiendo de la condición patológica, hay diferentes subpoblaciones de MDSC con distintos mecanismos y objetivos de supresión ^11,12. Por lo tanto, los métodos eficaces para aislar poblaciones viables MDSC son importantes para dilucidar sus diferentes mecanismos moleculares de supresión in vitro e in vivo.

Recientemente, el GHansah grupo ha informado de la expansión de MDSC en un modelo murino de cáncer de páncreas. El portador de tumor MDSC muestran una pérdida de la homeostasis y el aumento de la función supresora en comparación con el ingenuo MDSC ^13. MDSC porcentajes son significativamente menores en los compartimentos linfoides de los ratones no tratados frente a un tumor-cojinete. Esta es una advertencia importante, que a menudo dificulta la precisión de estos análisis comparativos MDSC. Por lo tanto, enriquecer la Gr-1 ⁺ leucocitos de ratones no tratados previamente antes de la clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) mejora la pureza, la viabilidad y reduce significativamente el tiempo de ordenación. Sin embargo, el enriquecimiento de Gr-1 ⁺ leucocitos de ratones portadores de tumores es opcional ya que se encuentran en abundancia para la FACS rápidas de clasificación. Por lo tanto, en este protocolo, se describe un método muy eficaz de inmunofenotipo MDSC y enriquecer Gr-1 ⁺ leucocitos del bazo de los ratones no tratados previamente para ordenar MDSC de una manera oportuna. Ratones inmunocompetentes C57BL / 6 se inoculan con murino ce Panc02LLS por vía subcutánea, mientras que los ratones no tratados previamente recibirá 1XPBS. Aproximadamente 30 días después de la inoculación, el bazo se cosechan y se procesan en una sola célula suspensiones utilizando una celda de la disociación tamiz. A continuación se esplenocitos de glóbulos rojos (RBC) se lisaron y una alícuota de estos leucocitos se tiñen con un fluorocromo conjugado con anticuerpos contra la Mac-1 y Gr-1 a los porcentajes MDSC inmunofenotipo por citometría de flujo. En un experimento paralelo, los leucocitos de los ratones no tratados enteros están manchadas con fluorescentes conjugados con 1 gr de anticuerpos, se incubaron con el PE-MicroBeads y seleccionados de manera positiva con un sistema automatizado magnético de células activadas clasificación (autoMACS) Pro Separator. A continuación, una parte alícuota de Gr-1 ⁺ leucocitos se tiñen con Mac-1 anticuerpos para identificar el aumento en porcentajes MDSC utilizando citometría de flujo. Ahora bien, estos Gr1 ⁺ leucocitos enriquecidos están listos para la clasificación de MDSC FACS para ser utilizados en los análisis comparativos (ingenuo vs tumor cojinete-) in vivo e in vitro

Protocolo

Antes de comenzar, preparar las siguientes soluciones:

3% de tinción Media (SM):

-3% Suero bovino fetal (FBS) en 1X tampón fosfato salino (PBS)

MACS búfer (MB):

- 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) en 1XPBS

1. El bazo de los ratones de cosecha

1. Inyectar por vía subcutánea de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones (Harlan), con 1,5 x 10 ⁵ células murinas Panc02 en 100 l de PBS 1x (portador de tumor, la tuberculosis). Los ratones de control (ingenuo) recibirá 100 1XPBS l.
2. Aproximadamente 4 semanas después de la inyección, los ratones eutanasia por asfixia de dióxido de carbono.
3. El bazo de los ratones de la cosecha de disección roma con pinzas y tijeras a continuación, pesar con una balanza. Coloque en el bazo por separado, con la etiqueta 50 tubos cónicos que contienen 1 x PBS.

2. Generar un Suspensio una sola célulan de los leucocitos a partir de bazos

Todos los procedimientos se debe realizar en un ambiente estéril bajo una campana de seguridad biológica y las células y los anticuerpos mantuvieron en hielo.

1. Montar la disociación celular tamiz mediante la inserción de la pantalla de malla en la abertura de la copa hacia el fondo. Luego, inserte el anillo de retención en el área de la rosca con el lado ranurado y utilizar el llavero para apretar el anillo de retención, manteniendo así la pantalla en su lugar. Coloque el tamiz montado en una placa de Petri que contiene 10 ml de 1 x PBS.
2. Con bazos y maja vidrio uso para moler bazos contra la pantalla de malla de la disociación celular tamiz y en la placa de Petri. Repetir para cada grupo de tratamiento de los ratones.
3. Suspensión de células de filtro en un tubo cónico de 50 ml utilizando un colador 70 micras celular y una pipeta serológica de 5 ml. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 ml de una solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos por el bazo x. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Parar la reacción añadiendo 20 ml de 1 x PBS. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 ml de PBS estéril 1 x. Pipetear arriba y hacia abajo con fuerza.
6. Contar células utilizando azul de tripano y un hemacitómetro y resuspende a una concentración deseada en el 3% SM de modo que 50 l es equivalente a 5x10 ^{5-1x10 6} células (1x10 ⁷ células / ml - 2x10 ⁷ células / ml).

3. La tinción de la superficie celular / Inmunofenotipo de MDSC mediante citometría de flujo

1. Etiquete los pocillos de una placa de fondo 96-V bien para el control y muestras experimentales y manchas individuales para los controles de compensación (no hay manchas, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC y DAPI).
2. Añadir 5x10 ^{5-1x10 6} células equivalentes a 50 l / pocillo de esplenocitos a sus respectivos pozos en el 96-V-así placa inferior. Centrifugarplaca a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
3. Preparar "mezcla maestra" (MM) de ratón BD Fc Bloque (rata anti-ratón CD16/32 anticuerpo monoclonal) diluido en 3% SM, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. Como punto de partida, utiliza 1 g Bloque Fc en 3% SM para un volumen final de 50 l, por pocillo.
4. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-V-así placa inferior mediante la rápida inversión de la placa sobre y hacia atrás, sobre un contenedor de desechos o sumidero sin interrupción de los sedimentos celulares.
5. Vortex, brevemente centrifugar MM Fc bloque durante 5 segundos y se añaden 50 l de todos los pellets en el 96-V-así placa inferior. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, dejando muestras en sus pozos. Incubar la placa durante 15 minutos en la oscuridad sobre el hielo. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
6. Preparar "Master Mix" (MM) de fluorocromo conjugado con anticuerpos diluidos en un 3% SM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo, mientras que las muestras se incuban con el bloque de Fc. Los anticuerpos se debe ajustarpara determinar las diluciones óptimas para la tinción de los procedimientos. Como punto de partida, se combinan una dilución 1:25 de Mac-1-FITC y 1:20 dilución de Gr-1-APC en 3% SM para un volumen final de 50 l, por pocillo de muestra.
7. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V como se ha descrito anteriormente.
8. Vortex, brevemente centrifugar MM de anticuerpos conjugados con tinción fluorescente de 5 segundos y se añaden 50 l para el control y pellets de experimentación. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Para una sola mancha compensaciones, añadir una dilución 1:25 de Mac-1-FITC, 1:20 dilución de Gr-1-APC y 75 ng / ml de DAPI, en 3% SM para un volumen final de 50 l por pocillo a sus respectivos pocillos. Añadir 50 l SM 3% de mancha así (no mancha). Mezclar bien e incubar las células en 96-y-V placa inferior durante 30 minutos en la oscuridad en hielo.
9. FACS Label tubos (5 ml, 12 mm x 75 mm de poliestireno tubos de fondo redondo) que corresponden a cada pocillo en la placa de 96 pocillos con fondo en V. Añadir 200 l SM 3% a cada uno de FACStubo.
10. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min y eliminar sobrenadantes. Lavar gránulos mediante la adición de 100 l SM 3% a cada sedimento y mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar la placa a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. Repita el paso de lavado, una vez más.
11. Retirar con cuidado el sobrenadante de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V como se ha descrito anteriormente. Resuspender cada sedimento en 100 l SM 3% y mezclar bien.
12. Transferir 100 l precipitado resuspendido de cada pocillo de la 96-bien con fondo en V a su placa de tubo, respectivamente, etiquetados FACS.
13. Antes de análisis de flujo de la citometría, añadir 75 ng / ml DAPI para el control y muestras experimentales y de control de DAPI sola mancha de compensación.
14. Realizar la adquisición de citometría de flujo de datos de los porcentajes de MDSC. Lleve a cabo una compensación con el negativo (sin control de mancha) y los controles positivos individuales. Crear un gráfico de puntos que muestra la dispersión frontal (FSC) versus lateral (SSC) en escala logarítmica de forma que las poblaciones de leucocitos deinterés pueden ser identificados. Dibuja una puerta grande en todos los leucocitos, con exclusión de los desechos y grupos con menor avance y la dispersión lateral. Desde esta puerta principal, cree un gráfico de puntos que muestra nueva cooperación Sur-Sur en comparación con DAPI y la puerta de DAPI (en vivo) de las células. Seleccione esta población recién cerrada y crear un gráfico de puntos que muestra Mac-1 en comparación con Gr. 1-y la puerta de su doble positivo (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Enriquecimiento magnética de Gr-1 ⁺ leucocitos

1. Alícuotas 1x10 ⁷ restantes leucocitos teñidas en tubos debidamente etiquetados FACS y centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
2. Preparar MM de Gr-1-PE anticuerpo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para un máximo de 10 ⁷ células, utilizar una dilución 1:10 de Gr-1-PE anticuerpo en 50 MB l, por muestra. Por el número de células mayores, aumentar el volumen en consecuencia. En pocas palabras centrifugar durante 5 segundos, se suman a los leucocitos en los tubos de FACS y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
3. Añadir 2 ml de MB a los tubos de FACS, se centrifuga a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
4. Preparar MM de Anti-PE MicroBeads en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para un máximo de 10 ⁷ células, use una dilución 1:4 de anti-PE MicroBeads en 200 MB l, por ejemplo. Por el número de células mayores, aumentar el volumen en consecuencia. En pocas palabras centrifugar durante 5 segundos, se suman a los leucocitos en los tubos de FACS y se incuba durante 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
5. Añadir 2 ml de MB a los tubos de FACS, se centrifuga a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 3 ml de SB. Filtrar a través de un colador 70 micras en un nuevo tubo, con la etiqueta 50 ml cónico.
6. Preparar y el primer separador MACS Auto Pro. Recarga todas las botellas con las soluciones adecuadas y vaciar la botella de residuos, si es necesario. Encienda el instrumento y examinar el estado de los depósitos de fluidos y de la columna (s) después de la inicialización. Todos los símbolos deben ser de color verde. En el menú, seleccione "separación" de la parte superiorbarra de menú, seguido de "Lavar ahora" en la barra de menú inferior. Seleccione "Rinse" de la opción de pop-up, seguido de "Ejecutar" para iniciar el proceso de cebado. Una vez que el proceso de cebado se completa con éxito, el instrumento mostrará entonces que es "Listo para la Separación" en el menú de estado.
7. Elija bastidor adecuada del tubo fría para tamaños de tubo y el lugar 50 ml tubo cónico con células marcadas magnéticamente en la fila A, 50 ml tubo cónico para la recogida de fracción negativa en la línea B y 15 ml tubo cónico para la recogida de la fracción positiva en la fila C.
8. Seleccione la opción "POSSEL_S" programa de separación de células para la selección positiva de las células diana marcadas en el modo de sensibilidad de las muestras. Magnéticamente células diana marcadas son retenidos en la columna de autómatas; células no marcadas se liberan en el tubo de recogida de fracción negativa en B. En la fila retracción automática del imán, las células diana marcadas se libera en el tubo de recogida positivo en la fila C del tubo bastidor.

5. Post-Ordenar Análisis de Gr-1 ⁺ leucocitos enriquecidos

1. Recuento de Gr-1 ⁺ y Gr-1 ^{- Fracciones} con azul de tripano y un hemacitómetro. Resuspender las células en la concentración deseada en el medio de la tinción de 3% en lo que el 50 l es equivalente a 5x10 ^{5-1x10 6} células (1x10 ⁷ células / ml - 2x10 ⁷ células / ml) y transferir 50 l de tubos etiquetados correspondientemente FACS.
2. Preparar un MM de Mac-1 solamente, a una dilución 1:25 en 3% SM para un volumen final de 50 l por muestra. Teñir las células individuales y preparar las compensaciones mancha de Gr-PE, Mac-1 FITC y DAPI para el análisis de citometría de flujo. Añadir 200 l 3% SM y colorante DAPI viabilidad como se ha descrito anteriormente.
3. Realizar la adquisición de citometría de flujo de datos para determinar Gr-1 ⁺ y Gr-1 ^- porcentajes y también para comparar porcentajes MDSC enriquecimiento de pre-y post-autoMACS.

6. Los resultados representativos

Aquí se muestra r epresentante resultados para el enriquecimiento autoMACS de Gr-1 ⁺ leucocitos de agrupados, el bazo ingenuos para FACS posteriores de clasificación de la MDSC (Figura 1). 1x10 ⁶ leucocitos ingenuos fueron teñidas con Mac-1-FITC y anticuerpos Gr-1-APC para identificar los porcentajes MDSC utilizando un instrumento BD LSRII, antes de la clasificación autoMACS. 1x10 ⁷ leucocitos ingenuos fueron teñidas con anti-Gr-1-PE anticuerpos y de educación física de microesferas para el enriquecimiento de Gr-1 ⁺ leucocitos mediante un separador de autoMACS Pro. Post-autoMACS enriquecimiento, Gr-1 los porcentajes de Gr-1 ⁺ y Gr-1 ^- fracciones recogidas fueron evaluadas mediante citometría de flujo. 1x10 ⁶ Gr-1 ⁺ leucocitos fueron removidos y se tiñeron con Mac-1-FITC para analizar y comparar los porcentajes de MDSC de enriquecimiento, se agruparon los leucocitos ingenuos que no enriquecido, se reunieron con tumores leucocitos por citometría de flujo.

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Figura 1. AutoMACS enriquecimiento de Naïve Gr-1 ⁺ leucocitos para FACS MDSC Clasificación. Los bazos se recogerá a partir de los ratones portadores de tumores de páncreas e ingenuo y se transforma en una sola célula suspensiones. El análisis de citometría de flujo de la superficie de los leucocitos ingenuo tiñeron con Mac-1 y Gr-1 anticuerpos fluorescentes conjugados, antes de enriquecimiento autoMACS (A). Análisis de flujo de la citometría de Gr-1 ⁺ (B) y Gr-1 ^- (C) las fracciones de post-autoMACS enriquecimiento de Gr-1 ^{+ en las} células de los agrupados leuckocytes ingenuos manchadas de Gr-1-PE anticuerpos y microesferas de anti-PE. Análisis de flujo de la citometría de MDSC y Gr-1 ⁺ porcentajes post-autoMACS enriquecimiento de Gr-1 ^{+ en las} células de leucocitos agrupados ingenuos (D) en comparación con los no enriquecidos leucocitos agrupados de ratones portadores de tumores (E) (los ratones no tratados previamente, n = 5 ; ratones portadores de tumores, n = 3). MDSC y los porcentajes de Gr-1 es cerrada en las parcelas representativas de contorno y los histogramas.

Discusión

Este es un método detallado para el procesamiento y immunophentyping poblaciones MDSC que es aplicable a diferentes tejidos linfoides de varios modelos animales. En particular, el enriquecimiento autoMACS puede ser utilizado para el aislamiento de varias poblaciones de leucocitos, incluyendo Gr-1 agotamiento de esplenocitos ^4, la purificación de subconjuntos mieloides de esplenocitos y ganglios linfáticos ^5, el aislamiento de los neutrófilos de médula ósea ¹⁴ y purificación de cé...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REACTIVO	EMPRESA	Catálogo #	COMENTARIOS
Fosfato 1X solución salina tamponada	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / Mg 2 + / rojo fenol libre
La albúmina de suero bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Vamos a BSA se disuelven sin problemas en PBS, medio ambiente estéril
Suero fetal bovino (SFB)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Inactivadas por calor, ambiente estéril
Rata anti-ratón CD16/32 anticuerpo monoclonal (Fc Bloque)	BD Biosciences	553142	Ambiente estéril
Anti-ratón CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	EstérilMedio ambiente
Anti-ratón Ly6G (Gr-1) de APC	eBiosciences	17-5931	Ambiente estéril
Anti-ratón Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Ambiente estéril
DAPI	Invitrogen	D1306	Medio Ambiente de dilución estéril de serie
Disociación celular Tamiz	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoclave antes de su uso
70-m colador	BD Biosciences	352350	Ambiente estéril
1X tampón de lisis de glóbulos rojos	eBiosciences	00-4333-57	Calentar a temperatura ambiente antes de su uso; ambiente estéril
Placas de Petri	Fisher Scientific	08-757-12	Ambiente estéril
Con 50 mltubos de cos	Thermo Scientific	339652	Ambiente estéril
5ml 12X75mm poliestireno tubos de fondo redondo	BD Biosciences	352054	Ambiente estéril, conocidos como tubos FACS
96 pocillos fondo en V placas	Corning	3897	Ambiente estéril
Azul de tripano	Cellgro	25-900-CI	Ambiente estéril
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	Ambiente estéril
AutoMACS Pro Separador	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Columnas	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS funcionamiento de amortiguación	Miltenyi Biotec	130-091-221