Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Resumen

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Resumen

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulo blanco. Ellos forman una parte esencial del sistema inmune innato ^1. Durante la inflamación aguda, los neutrófilos son las primeras células inflamatorias para migrar a la zona de la lesión. El reclutamiento de los neutrófilos a un sitio de la lesión es un proceso gradual que incluye la dilatación en primer lugar, de los vasos sanguíneos para aumentar el flujo de sangre, en segundo lugar, los cambios estructurales microvasculares y escapar de las proteínas plasmáticas de la sangre, la adhesión en tercer lugar, de rodadura, y la transmigración de los neutrófilos a través de la endotelio; y cuarto acumulación de neutrófilos en el sitio de la lesión ^2,3. Una amplia gama de in vivo e in vitro se ha desarrollado métodos para permitir el estudio de estos procesos ^4. Este método se centra en la transmigración de neutrófilos a través de las células endoteliales humanas.

Un método popular para el examen de los procesos moleculares implicados en la transmigración de neutrófilos humanos utiliza neutrophils que interactúan con las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) ^5. Aislamiento de los neutrófilos se ha descrito en otros lugares visual ^6, por lo que este artículo le mostrará el método de aislamiento de HUVEC. Una vez aisladas y cultivadas hasta confluencia, las células endoteliales se activan resultante en la regulación positiva de moléculas de adhesión y la activación. Por ejemplo, la activación de las células endoteliales con citocinas como el TNF-alfa resulta en aumento de E-selectina e IL-8 expresión ^7. E-selectina media de captura y la rodadura de los neutrófilos y la IL-8 y media la activación firme adhesión de los neutrófilos. Después de los neutrófilos de adhesión transmigrar. Transmigración puede ocurrir paracellularly (a través de uniones de las células endoteliales) o transcellularly (a través de la célula endotelial sí mismo). En la mayoría de los casos, estas interacciones se producen bajo condiciones de flujo que se encuentran en la vasculatura ^7,8.

La cámara de la placa de flujo paralelo es un sistema ampliamente utilizado que mimicrófonos el cizallamiento hidrodinámico tensiones encontrado in vivo y permite el estudio de reclutamiento de neutrófilos bajo condición de flujo in vitro de ^9,10. Varias empresas producir paralelas cámaras de flujo de placa y cada uno tiene ventajas y desventajas. Si fluorescente de imágenes que se necesita, vidrio o un polímero ópticamente similares necesita ser utilizado. Las células endoteliales no crecen bien en el vidrio.

Aquí presentamos un método fácil y rápida para obtener imágenes de contraste de fases, DIC y fluorescencia de la transmigración de neutrófilos con un bajo volumen de diapositivas canal ibidi hecha de un polímero que se apoya la adhesión rápida y el crecimiento de las células endoteliales humanas y tiene propiedades ópticas que son comparables a vidrio. En este método, las células endoteliales se cultivaron y estimulada en una μslide ibidi. Los neutrófilos se presentó bajo condiciones de flujo y la migración se evaluó. Imagen fluorescente de las uniones activado en tiempo real determinación de la extensión de paracelular frentetranscelular la transmigración.

Protocolo

1. Aislamiento y mantenimiento de las células endoteliales vasculares

1. Nivel 2 los procedimientos de bioseguridad debe ser utilizado cuando se trabaja con la sangre y tejidos humanos. Usando tijeras de cortar el cordón umbilical de la placenta y luego examinar de cerca el cable de coágulos sanguíneos y daños causados ​​por el pinzamiento del cordón durante el parto. Corte y deseche las partes de la cuerda.
2. Preparar una solución de colagenasa fresco a 1 mg / ml mediante el vertido de 50 ml de tampón de cable caliente en un tubo que contiene 50 mg de colagenasa.
3. Cambiar a guantes estériles y abrir una bandeja de instrumentos esterilizados en autoclave que contiene cánulas romas, pinzas, tijeras, cordón de tres vías de dejar de gallos y la gasa en una campana de flujo laminar.
4. Identificar las dos arterias y el presente sola vena en el cordón. Las arterias son más pequeñas y tienden a ser fuertemente restringido, mientras que la vena es grande y fácil de canular. Para lavar la sangre de la vena, suavemente insertar una cánula con una llave de paso de dos vías que se le atribuye into uno de los extremos de la vena y un lugar abrazadera alrededor de la cánula para sujetarlo firmemente en su posición. Perfundir cable de búfer a través de la vena. Repetir hasta que el flujo a través es claro y entonces sujetar el extremo del cable.
5. Colagenasa perfusión en la vena, cierre la llave de paso, colocar el cable en un vaso que contiene el tampón de cable de calentamiento y se incuba durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el cable y masajear suavemente el cable para aflojar las células endoteliales de la luz de la vena. Escurrir la solución en el tubo que contiene los medios de células endoteliales (ECM). Lavar con tampón cable dos veces para eliminar las células restantes. Escurrir la solución en el mismo tubo.
6. Centrifugar las células a 350 xg durante 10 minutos para sedimentar las células endoteliales.
7. Eliminar el sobrenadante y añadir 10 ml de ECM para el pellet. Resuspender las células en ECM, a continuación, transferir las células a un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,2%. Pre-recubrimiento con gelatina que se ha hecho por lo menos durante 1 hora a 37 ° C. Crecer las células a 37 ° C y 5% De CO _2.
8. Al día siguiente, agite suavemente el frasco para desprender las células rojas de la sangre a continuación, retire el sobrenadante y se lava con solución salina balanceada tibia de Hank (HBSS). Retire HBSS y alimentar a las células con 10 ml de ECM caliente. Se examinan las células bajo el microscopio para asegurar que las células rojas de la sangre se eliminaron. Evaluar el grado de confluencia y la morfología de las células endoteliales. Las células endoteliales en esta etapa debe ser alargado y no hay indicios de vacuolas.
9. Continuar para cambiar los medios de comunicación cada tres días hasta que las células llegan a las células confluencia, a continuación, se separaron utilizando una solución de 0,08% de tripsina que contiene EDTA 1 mM. Las células endoteliales de placa en los platos que desee pre-recubiertas con gelatina al 0,2%. Las células deben llegar a la confluencia en 3-6 días.
10. Cuando se utiliza ibidi cámaras, pre-capa cada cámara con gelatina al 0,2%. Eliminar el exceso de gelatina y fibronectina y luego añadir 1,5 x 10 ⁶ / ml de células endoteliales en suspensión en ECM en la cámara. Cambiar los medios de comunicación cada día hasta que confluent. Las células deben ser confluentes en 2-3 días, dependiendo de la médula.

2. Preparación de Neutrófilos

1. Los neutrófilos se aislaron de la sangre periférica de voluntarios humanos sanos utilizando centrifugación de densidad. Un protocolo detallado con una demostración visual para el aislamiento de los neutrófilos se puede encontrar en la edición anterior de esta revista ^6. Una vez aisladas, neutrófilos volver a suspender en una concentración de 1x10 ⁶ / ml en HBSS conteniendo 0,5% de albúmina humana.

3. La creación de la Cámara ibidi

1. Se cultivan las células endoteliales en una cámara revestida con gelatina ibidi. Examine todos los días mediante microscopía de contraste de fase hasta que se convierten bien confluente.
2. Estimular las células endoteliales para aumentar la expresión de moléculas de adhesión y la activación. Para los fines de este protocolo, las células endoteliales se estimularon con 10 ng / ml de TNF-α recombinante durante cuatro horas a 37 ° C y 5% de CO _{2 antes de configurar la cámara para obtener imágenes de ibidi bajo condiciones de flujo.}
3. Preparar el microscopio, y la bomba de jeringa como visual descrito por Wiese y sus colegas ¹¹ utilizando una cámara de vacío ibidi.
4. Las principales diferencias entre este protocolo y el procedimiento Wiese incluyen pre-llenado de la tubería para evitar la exposición de las células endoteliales a la atmósfera, el mantenimiento de la memoria intermedia a 37 ° C usando un baño de agua, utilizando tubos PharMed para mantener la memoria intermedia de la pérdida de la temperatura y el uso de diferentes objetivos en el microscopio, dependiendo de si la imagen con contraste de fase o de fluorescencia.
5. Una vez que el microscopio está configurada y el tubo se llena con HBSS, cierre todas las llaves de paso y quitar la cámara de vacío ibidi.
6. Conectar la cámara ibidi contiene TNF-α estimula las células endoteliales a la tubería.

4. El reclutamiento de neutrófilos y Transmigración

1. Visualice la monocapa de células endoteliales en el Microscopa utilizando un objetivo de contraste de fase 10x.
2. Establecer la bomba de jeringa para retirar e iniciar el flujo de HBSS en el esfuerzo cortante deseado (normalmente entre 0,5 a 2 dinas / cm ^2).
3. Por el lado de la entrada, cambio de HBSS a los neutrófilos aislados (1x10 ⁶ / ml), girando el camino de tres llave de paso.
4. Comience a grabar con una cámara CCD de conectar a un grabador de DVD o conectar directamente al ordenador. Inicie el cronómetro cuando los neutrófilos entran en la cámara. Perfundir los neutrófilos durante cuatro minutos. Un total de 3 ml de la suspensión de neutrófilos es suficiente para un solo experimento.
5. Después de cuatro minutos, volver a HBSS para evitar la adhesión de los neutrófilos nuevos. Si los datos de interacción total, rodamiento y adhesión firme se desea, imagen 6 campos al azar de 10 segundos cada uno con un objetivo de contraste de fase 10x entre los minutos 4 y 5.
6. Cambiar a un objetivo de 40x y graba un solo campo de visión entre los 5 y 10 minutos. A los 10 minutos, recopila losentre 5 y 10 campos aleatorios de vista.
7. Parar el flujo y pasar a la siguiente cámara.

5. Proyección de imagen fluorescente bajo condiciones de flujo usando una cámara de ibidi

1. Etiqueta, ya sea células endoteliales o neutrófilos con una sonda fluorescente de interés. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VE-cadherina conjugado a Alexa-[547] puede ser usado para visualizar las uniones de las células endoteliales.
2. Ensamble de cámara ibidi en un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) y capacidad de fluorescentes. Usamos una FluoView 1000 confocal (Olympus) con una cámara ambiental. Enfocar con un objetivo diseñado para el trabajo DIC y fluorescencia.
3. Adquirir imágenes simultáneas, DIC y fluorescencia utilizando el software suministrado por el proveedor mientras se sigue el curso del tiempo se describe en la sección 4.

6. Análisis de reclutamiento de neutrófilos

1. Análisis de rodadura y la interacción células se describe por Wiese et al ^11.
2. Para medir el porcentaje de neutrófilos de rodadura sobre la monocapa endotelial contar el número de neutrófilos que se han movido más de un diámetro de células en un período de 5 segundos. Divida este número por el número total de leucocitos en el campo para determinar el porcentaje de células de rodadura. Por extensión, las células restantes se consideran firmemente adheridas.
3. Medir la velocidad de rotación de los neutrófilos mediante el cálculo de la distancia que la recorrida de neutrófilos en un período de tiempo determinado y luego dividirlo por ese tiempo en segundos.
4. Transmigración se determinó contando el número de neutrófilos que hayan cambiado de forma y migran por debajo de la monocapa ^10. Estos neutrófilos son identificados por el hecho de que cambie de ser fase brillante cuando en la parte superior de la monocapa de ser oscuro fase cuando debajo de la monocapa ^10. El número de células transmigrados puede ser expresado como un porcentaje del total de células en el campo de visión o como materia prima entumecidaer de células transmigrados por unidad de área. En este sistema modelo, típicamente 50% de los neutrófilos transmigrar después de 10 minutos.

7. Los resultados representativos

Sin estimular las células endoteliales no son compatibles con el reclutamiento de neutrófilos. En contraste, la estimulación de las células endoteliales con el TNF-alfa en los resultados de los neutrófilos de rodadura, la adhesión firme y la transmigración. Un ejemplo de estos datos se muestran en las Figuras 1 y 2. Figura 1A muestra neutrófilos que interactúan con el TNF-α-células endoteliales estimuladas. Estas interacciones pueden ser cuantificadas, revelando el número total de neutrófilos que interactúan con las células endoteliales, así como el número de neutrófilos rodantes, firmemente adherente o transmigrado (Figura 2). Transmigración de neutrófilos puede ocurrir a través de uniones de las células o las células endoteliales mismos. Para diferenciar entre estas dos condiciones, las células endoteliales están etiquetados con un anti-VE-c adherin anticuerpos y la transmigración se califica como algo que ocurre paracellularly o transcellularly (fig. 1B y C). En este modelo, prácticamente toda la transmigración es paracelular ^7.

Figura 1. DIC simultánea y imágenes de fluorescencia bajo condiciones de flujo usando una cámara de ibidi. (A) Imagen DIC recién aisladas neutrófilos humanos migran a través de las células endoteliales de vena umbilical. La punta de flecha amarilla muestra un neutrófilos adherentes; la punta de flecha blanca muestra un neutrófilo transmigra. (B) las uniones de células endoteliales se tiñeron con un anticuerpo anti-VE-cadherina conjugado con Alexa-[547] y de imágenes. (C) muestra la superposición de los canales A y B revela que prácticamente todos los transmigración en este modelo es paracelular. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 2. Las células endoteliales se dejaron sin estimular o se estimularon con 10 ng / ml de TNF-α. Después de 4 horas, una cámara de flujo paralelo placa fue ensamblado y neutrófilos fueron perfundidos a través de una dinas / cm ^2. (A) las interacciones de neutrófilos fueron examinados y se mide utilizando el software ImageJ de NIH. Las células que interactúan totales fueron caracterizados como (B) de rodadura, firmemente adherente o transmigración (C). Los datos representan la media + SEM de entre 3 y 5 experimentos. La diferencia entre el control y TNF en los grupos A y C fue significativa (p <0,001).

Discusión

Los investigadores han utilizado rutinariamente las células endoteliales de los diferentes lechos vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos y la transmigración. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales microvasculares dérmicas ^12, el hígado células endoteliales sinusoidales ¹³ y las células endoteliales de vena umbilical humana ^10. Entre ellos HUVEC ganado amplia popularidad debido a su relativa facilidad de aislamiento y la disponibi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Los reactivos y equipos	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La colagenasa tipo 1	Worthington	4197
Cable de búfer			Composición: 140 mM de NaCl 4 mM de KCl 10 mM de D-glucosa en 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 tampón a pH 7,4
Medios de comunicación de las células endoteliales (ECM)			M199 con sales de Eagle suplementado con 16% de suero humano que contenía 100 unidades de penicilina 100 microgramos de estreptomicina y 0,3 mg de L-glutamine/ml
M199	GIBCO	31100-035
La penicilina glutamato Estreptomicina (100X)	Invitrogen	10378-016
Ibidi cámaras	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro Tech	300-01A
Humano solución de albúmina al 20%	Gemini Bioproducts	800120050
HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 +	Sigma	H2487-10X
HBSS con Ca 2 + y Mg 2 +	Sigma	H1387-10X