ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

Resumen

ARN de interferencia (RNAi) posee muchas ventajas sobre los octavos de final de genes y ha sido ampliamente utilizado como una herramienta en los estudios de genes funcionales. La invención de ADN basado en vectores RNAi la tecnología ha hecho a largo plazo y caída de genes inducibles posible, y también aumentó la viabilidad de silenciamiento de los genes En vivo.

Resumen

ARN de interferencia (RNAi) inhibe la expresión de genes de mRNAs objetivo concreto degradantes. Desde el descubrimiento de la doble hélice pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el silenciamiento génico ^1, el ARNi se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en los estudios de función de genes. En comparación con la supresión genética, RNAi mediada por silenciamiento de genes posee muchas ventajas, tales como la facilidad con la que se lleva a cabo y su idoneidad para las líneas celulares más. Múltiples estudios han demostrado las aplicaciones de la tecnología RNAi en la investigación del cáncer. En particular, el desarrollo del ADN vector basado en la tecnología para producir pequeña horquilla de ARN (shRNA) impulsado por el promotor U6 o H1 ha hecho a largo plazo y gen inducible silenciar posible ^2,3. Su uso en combinación con la ingeniería genética de vectores virales, como lentivirus, facilita una alta eficiencia de la entrega shRNA y / o la integración en el ADN genómico de expresión estable de ARNhc.

Se describe un detaileProcedimiento D utilizando el vector de ADN basada en la tecnología del RNAi para determinar la función de genes, incluida la construcción de vectores lentivirales que expresan shRNA, la producción y la infección por lentivirus de células, y los estudios funcionales a partir de un modelo de xenoinjerto de ratón.

Varias estrategias se han reportado en la generación de construcciones shRNA. El protocolo descrito aquí empleando amplificación por PCR y una ligadura de 3-fragmento puede ser utilizado para generar directamente y eficientemente ARNhc que contienen construcciones lentiviral sin dejar ningún adyacente nucleótidos extra a una secuencia codificante ARNhc. Puesto que las casetes de expresión ARNhc-creadas por esta estrategia puede ser cortada por enzimas de restricción, que se puede mover fácilmente a otros vectores con diferentes marcadores fluorescentes o un antibiótico. Reactivos de transfección más comerciales se pueden utilizar en la producción de los lentivirus. Sin embargo, en este informe, se proporciona un método económico mediante la precipitación de fosfato de calcio que puede alcanzar más del 90% en la eficiencia de transfecciónCélulas 293T. En comparación con vectores de expresión constitutiva ARNhc, un sistema inducible ARNhc es particularmente adecuado para derribar un gen esencial para la proliferación celular. Se demuestra el silenciamiento de genes de Yin Yang 1 (YY1), un potencial oncogen del cáncer de mama ^4,5, por un Tet-On inducible shRNA sistema y sus efectos en la formación de tumores. La investigación mediante lentivirus requiere de revisión y aprobación de un protocolo de bioseguridad por el Comité de Bioseguridad de la institución de un investigador. La investigación con modelos animales requiere de revisión y aprobación de un protocolo de animales por el Cuidado de los Animales y el empleo (ACUC) de la institución de un investigador.

Protocolo

1. Generación de construcciones shRNA

1. Identificar la secuencia del siRNA-objetivo (20-23 nucleótidos) en base a criterios previamente publicados ⁶ o utilizar un servidor algoritmo basado en la Web, tales como "buscador de siRNA objetivo" de Ambion y GenScript.
2. Sintetizar oligonucleótidos basados ​​en el diseño de secuencias de la Figura 1 y el ejemplo de la Tabla 1. Llevar a cabo la amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos P1 y P2 (de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación a 60 ° C durante 30 segundos, y alargándose a 72 ° C durante 30 segundos) y un plásmido que lleva el U6 o H1 promotor como una plantilla. Se purifica el producto de PCR usando una columna de purificación de PCR. Digerirlo por BamHI y HindIII y purificar el ADN digerido usando una columna de purificación de PCR. Recocer la P3 y P4 oligonucleótidos (2,5 pmol / l de cada uno en 100 l de 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) por ebullición durante 5 min y enfriar lentamente hasta temperatura ambiente. Digerir un vector lentiviralTor, tal como el descrito en la Figura 2A, por BamHI y EcoRI, y realizar purificación en gel.
3. Llevar a cabo una ligadura de 3-fragmento con el fragmento BamHI / EcoRI digerido vector, un fragmento BamHI / HindIII digerido con PCR y un par de oligonucleótidos hibridados (formando HindIII y sitios EcoRI en los dos extremos) en una proporción molar 01:10:10 (Figura 1).
4. Transformar competente de E. altamente eficiente coli DH5a células utilizando el producto ligado. Defienda las colonias utilizando los oligonucleótidos P5 (en el vector) y P6 (en el promotor H1 o U6). ⁷
5. Preparar ADN plásmido de las colonias positivas con un estuche comercial y confirmar la presencia del inserto por BamHI / EcoRI de digestión y electroforesis de ADN de agarosa. Secuencia de la región que contiene el promotor y ARNhc utilizando el oligonucleótido P5.
6. El uso de ADN plásmido Midi-o la preparación de los kits de la Maxi-libre de endotoxinas se prefiere) para preparar el ADN que lleva el lentivirus shRNA expresióncasete. Determinar la concentración de ADN mediante la medición de la absorción a 260 nm. Ver la pureza del ADN utilizando el 260 nm/280 nm y relación de asegurarse de que cae en el intervalo de 1,8 a 2,0. Compruebe la integridad de los lentivirus plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa. ADN para la transfección debe ser super-enrollado.

2. Lentivirus Transfección

Precauciones: Lentiviral vectores se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y la replicación del genoma incompetente. Ellos han sido ampliamente utilizados en la entrega de genes debido a la capacidad de infectar tanto dividir y no dividir las células. Sin embargo, existen dos riesgos principales en los estudios que utilizan los lentivirus. (1) El potencial para la generación de replicación competente lentivirus. Este riesgo se puede reducir considerablemente si el sistema de generación lentiviral tercero se utiliza. (2) El potencial para la oncogénesis. Este riesgo puede verse agravado si las inserciones realizadas son oncogénicos o reprimir los supresores de tumores.Las actividades de investigación que trabajan en VIH basada en lentivirus debe seguir las "Consideraciones de seguridad de la biotecnología para la Investigación con vectores lentivirales" de los NIH ( http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html ) y requieren una aprobación del Comité de Seguridad de la Biotecnología de la institución de un investigador. Por lo general, una mayor seguridad de la biotecnología de nivel 2 (BSL-2) de contención se requiere para el laboratorio, si se utilizan vectores lentivirales.

1. Placa 4 x 10 ⁶ HEK 293T células con medio DMEM completo (DMEM suministrado con fetal al 10% de suero bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) en platos de 10 cm y de cultivo durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora. Sustituir el medio con 5 ml de pre-calentado Opti-MEM I Reducido suero medios de comunicación (Invitrogen).
2. Preparar Solución A: 10 mg de shRNA-vector lentiviral que contiene, 5 mg cada una de las gene terceroación plásmidos lentivirus de embalaje (preparado con alta pureza, los tres plásmidos de embalaje incluyen VSV-G: para una proteína de la envoltura, pRSV-Ap: de revoluciones, y pMDLg / pRRE: para el gag / pol, que son esenciales para el envasado de los lentivirus), 36 l de 2M CaCl _2, y 300 l de agua estéril.
3. Preparar Solución B: 300 l de 2 x Hepes Buffered Saline (281 mM de NaCl, 100 mM de HEPES, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, pH ajustado a 7,12 por NaOH 0,5 N y se esteriliza por 0,22 m de filtro).
4. Poco a poco solución gota a la solución B, mientras que burbujas de aire a través de la solución B con una pipeta. Agregar el tubo a temperatura ambiente durante 30 min.
5. Poco a poco caer las soluciones mixtas A / B en el plato HEK 293T cultivo celular preparado en el paso 2.1 y se incuba a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora durante 4-6 horas.
6. Sustituir el medio con 7 ml de medio DMEM completo. Después de 24 horas, añadir otros 5 ml de medio completo DMEM. Se recoge el medio de containing los lentivirus después de otras 24 h de la cultura.
7. Derivado del medio a 1.500 rpm, temperatura ambiente durante 10 min. Se filtra el sobrenadante utilizando un filtro de 0,45 micras y girar el flujo a través de un medio que contiene el lentivirus por ultracentrifugación a 25.000 rpm (igual a 125.000 xg con un rotor de cubeta oscilante SW28, ultracentrífuga Beckman XL-90), 4 ° C durante 90 min. Decantar el sobrenadante a un recipiente con 5% de lejía (concentración final).
8. Resuspender el sedimento en lentivirus 0.5-1.0 ml de PBS frío y hacer alícuotas lentivirus en 50-100 l por tubo. Guárdelos a -80 ° C.
9. El título del lentivirus se puede determinar mediante kits comerciales (tales como Kit QuickTiter Cuantificación Lentivirus de Biolabs Cell, Inc.), por un protocolo de PCR en tiempo real ^8, o mediante la determinación del marcador fluorescente co-expresó mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo . Por lo general, una de 10 cm placa de cultivo puede producir alrededor de 0,5 a 1,0 × 10 ⁸ infecciónunidades infecciosas (UI).

3. La infección y Caracterización de las células infectadas

1. Semillas de las células para ser infectadas en 2 ml de medio completo en una placa de 6 pocillos con una confluencia del 30-40% (aproximadamente 5-8 x 10 ⁵ células, dependiendo de los tamaños de células). Cultivar las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora.
2. Sustituir el medio con 1 ml de medio fresco que contenía 8 g / ml de polibreno (Sigma, Cat. # H9268) o 5 mg / ml de protamina (Sigma, Cat. # P4020).
3. Determinar una multiplicidad adecuado de la infección (MOI), rango ⁹ para una línea celular particular a través de los lentivirus, con marcador fluorescente. Calcular o empíricamente determinar la cantidad de lentivirus para ser utilizado para infectar la línea celular. Poco a poco caer el lentivirus en la placa y agítelo suavemente durante 10 segundos.
4. Incubar la placa a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora durante 6 horas y luego vuelva a colocar el medio con medio completo normal.
5. Por lo menos dos days después de la infección, compruebe las células por medio de microscopía de fluorescencia para lentivirus que expresan marcadores fluorescentes y / o añadir el antibiótico correspondiente al medio de vectores lentivirales que expresan genes de resistencia a antibióticos. Para un vector inducible, tal como un Tet-On sistema (Figura 2), cultivar las células en medio preparado con tetraciclina libre de FBS. Dividir las células 2-3 días de la infección. Toma una porción de las células para probar desmontables genes inducibles por cultivo en medio suministrado con y sin 1,5 mg / ml de doxiciclina (DOX) durante 2 o más días.
6. Compruebe la caída de genes por Western blot, PCR en tiempo real o inmunotinción ≥ 2 días después de la infección, 2 días después de la selección de antibióticos, o (para un sistema inducible Tet-On) ≥ 2 días después de la adición Dox.
7. Utilizar enfoques diferentes (tales como los ensayos de proliferación celular, estudios de cultivo de agar blando, ensayos de migración, ensayos de invasión y estudios de formación de tumores) para determinar los efectos de la kn gen dianaockdown en la malignidad de las células.

4. Ratón Xenoinjerto Estudio Modelo

1. Limpiar todas las superficies para anestesia ratón y la inyección por 70% de etanol para prevenir la infección de los ratones. Anestesie ratones atímicos (NCI-Frederick) utilizando 2% de isoflurano mezclado con oxígeno en una cámara de inducción de la anestesia 10 minutos antes de la inoculación de células. Mantener la anestesia por medio de 1% de isoflurano se mezcla con el oxígeno a través de un cono de la nariz. Llevar a cabo este paso en una habitación con una excelente ventilación y colocar filtros de isoflurano del tesoro a la cámara de inducción.
2. Propagar las células portadoras de shRNAs. El uso de tetraciclina libre de soporte de Tet-On vectores inducibles. Trypsinize las células y resuspender en medio completo que contenía 50% de Matrigel. Coloque los ratones desnudos sobre una almohadilla de calentamiento (30 ° C) y se inyectan 200 l de las células (1-10 x 10 ^6, dependiendo de la malignidad de las células) en los ratones con 1-2 puntos de inyección por ratón. Usar jeringas con 25.5 agujas de calibre para inyecciones subcutáneas, y las agujas para las inyecciones de calibre 28-30 ortotópico.
3. Para constitutivos vectores ARNhc, utilizar 2 grupos de ratones inyectados con las células que expresan el gen diana ARNhc y un revuelto ARNhc. Para Tet-On vectores shRNA inducibles, utilizar 4 grupos de ratones inyectados con células que portan el gen diana ARNhc y un revuelto ARNhc, suministrado con agua normal y Dox (1,5 mg / ml) que contenía agua (2 x 2 shRNAs tratamientos = 4 grupos) . Cambie el agua Dox que contiene dos veces por semana.
4. Supervisar la longitud y la anchura de los tumores semanales o quincenales por un calibrador digital vernier y calcular los volúmenes tumorales (V) por la fórmula V = 1/2 (longitud x anchura ^{2) 10.} Asegurarse de que el volumen del tumor no exceda de las directrices de la ACUC institucionales (tales como, el 10% del peso corporal). La eutanasia de un ratón con un protocolo aprobado por la ACUC institucional si muestra algún signo de ulceración o necrosis extensa, Infectio obvian, la hemorragia no controlada o una enfermedad en fase terminal.
5. El crecimiento tumoral y la metástasis se puede controlar para las células tumorales que expresan un inoculadas bioluminiscente marcador ^11, tal como luciferasa de luciérnaga. Limpie todas las superficies para la anestesia del ratón y la imagen en un 70% de etanol para prevenir la infección de ratones. Se anestesia a los ratones como se describe en el paso 4,1. Inyectar luciferina (150 mg / kg) por vía intraperitoneal. Coloque los ratones en una cámara de imágenes desinfectadas de un sistema de imagen comercial, como un sistema de IVIS Imaging (Caliper Life Sciences, Inc.). Girar en la palanca de anestesia para mantener la anestesia por 1% de isoflurano se mezcla con el oxígeno. Realizar este paso en una habitación con una excelente ventilación.
6. Tomar la primera imagen mediante la exposición de 5 minutos y comprobar su intensidad de señal. Ajustar el tiempo de exposición para obtener imágenes con una señal óptima en comparación con el fondo. Determinar la imagen en tiempo empíricamente, que es generalmente 1-5 min para tumores subcutáneos.
7. Eutanasiar los ratones por un protocolo aprobadopor la ACUC institucional cuando el tamaño del tumor llegar a cerca de 1.000 mm ^3, o como se especifica en las directrices de ACUC. Tumores especiales, el xenoinjerto, pesarlos y tomar fotos. Procesar las muestras tumorales de diferentes estudios, tales como los análisis patológicos para determinar la morfología de las células del tumor y el Western blot y estudios en tiempo real PCR para poner a prueba la expresión génica.

5. Los resultados representativos

Este protocolo se utilizó para estudiar los efectos de YY1 caída en la formación de xenoinjerto de tumor de la luciferasa de luciérnaga-que expresan las células MDA-MB-231 células (células humanas de adenocarcinoma de mama; Caliper Life Sciences) en ratones atímicos. La secuencia diana shRNA de YY1 humano "GGG AGC AGC AGG AGA AGA TGC T". Una secuencia revueltos "GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T" también fue creado para un control (cont.) shRNA, que no contaba con una importante similitud con cualquier transcripción conocido. Los oligonucleótidos utilizados para hacer Tet-On construcciones shRNA inducibles, con YY1 como un ejemplo, Se muestran en la Tabla 1. Como resultado, los dos vectores lentivirus, PLU-Puro-Indu-YY1 siRNA y shRNA plu-Puro-Indu-CONT, se construyeron y que fueron utilizados para producir los lentivirus. Se han utilizado estos lentivirus para infectar de forma individual dos MDA-MB-231 clones de células (clones 1 y 3) que expresan tanto el regulador tetraciclina (tetR) y luciferasa de luciérnaga. Poblaciones policlonales de células se obtuvieron después de la selección puromicina. Figura 3A muestra Dox inducida YY1 caída en estos MDA-MB-231 células infectadas por el plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. A continuación, utiliza las células policlonales de clon 3 infectados de forma individual por estos inducible YY1 shRNA y lentivirus shRNA cont y observó que el agotamiento de YY1 reduce la invasividad de las células MDA-MB-231 células (Figura 3B). Análisis de Western blot confirmó Dox inducida YY1 silenciamiento en MDA-MB-231 células con el shRNA indu-YY1, mientras que las células que contienen indu-cont shRNA no muestran este efecto (Figura 3C). A continuación, utiliza estas células para el estudio en ratones modelo de xenoinjerto. En comparación con los grupos de control, los ratones implantados por las células MDA-MB-231 con indu-YY1 ARNhc y se suministra con Dox que contiene agua mostró formación reducida del tumor, cuando se visualizó por bioluminiscencia (Figura 4A) y se determina por los pesos tumorales (Figura 4B ). YY1 silenciamiento de estos xenoinjertos de tumores fue confirmada por los estudios de Western blot se muestran en la Figura 4C.

Figura 1. Diagrama esquemático para la generación de un constructo ARNhc y transcripción ARNhc. El P1 a P6 cebadores se muestran (véase la Tabla 1 para las secuencias de ejemplo). Pol III: la ARN polimerasa III (d):. Final digerido. El dibujo no está a escala. Haga clic aquí para ampliar la imagen .

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Figura 2. Diagramas esquemáticos de (A) un vector lentiviral y (B) el mecanismo de la Tet-On promotor inducible H1 utilizado para el silenciamiento de genes. El vector lentiviral fue reconstruido sobre la base de pLL3.7 ^14. H1-Pr: H1 promotor, UBC-Pr: promotor de la ubiquitina C Humanos; Puro: puromicina; TRE: elemento sensible tetraciclina, Dox: doxiciclina. TetR: regulador de la tetraciclina. 5'LTR, 3'SIN-LTR y WRE son componentes esenciales de un vector lentiviral ^14.

Figura 3. Dox inducida YY1 silenciamiento y su efecto sobre la invasión de MDA-MB-231 células. A. YY1 niveles en dos poblaciones de células policlonales derivados de TetR-expresión de los clones 1 y 3 infectados por plu-Puro-Indu-YY1 ARNhc lentivirus y se cultivaron en ausencia y presencia de Dox. B. Boyden cámara de ensayo de la MDA-MB-231 células con shRNAs inducibles. (* P <00,05 en comparación con otros tres grupos). C. Representante occidentales manchas de YY1 expresión en estas poblaciones de células cuatro.

Figura 4. Efectos de la inducida por YY1 silenciamiento en la formación de tumores xenoinjerto por la MDA-MB-231 células. A. Diagrama esquemático de la implantación de células (izquierda) y representativas imágenes bioluminiscentes capturados por el sistema de imágenes IVIS a las 4 semanas (derecha) después de la inoculación de células. B. xenoinjertos tumorales pesos a las 4 semanas. * P ≤ 0,05. C. Western blot de YY1 y β-actina de expresión en xenoinjertos de MDA-MB-231 células con indu-YY1 shRNA en ausencia y presencia de Dox. Las etiquetas en la parte superior son los nombres de los ratones individuales.

Oligonucleótidos	Secuencia (5 '- 3')	El uso y la ubicación
P1 (Tet-On H1)	CAGT GGATCC CGA ACG ACG CTG TCA TCA ACC C	PCR; en el extremo 5 'del promotor H1
P1 (U6)	CAGT GGATCC GAC GCC ATC TCT AGG	PCR; en el extremo 5 'del promotor U6
P2 (para YY1 con Tet-On H1)	CAGC AAGCTT GAA atc TGC TGC TTC según TCC TGC C GGG ATC TCT ACT ATC GAT GAA AGG C	PCR; en el extremo 3 'del promotor inducible Tet-On H1
P2 (para YY1 con U6)	CAGC AAGCTT GAA atc TGC TGC TTC según TCC TGC c AAA CAA GGC TTT TCT CCA AGG un gat	PCR; en el extremo 3 'del promotor U6
P3 (para YY1)	AGC tt atc TGC TGC TTC según TCC TGC c ttttt g	Para ser recocida con P4
P4 (por YY1)	aattc aaaaa ggg AGC AGC AGG AGA AGA ta TGC	Para ser recocida con P3
P5 (por pLL3.7)	ggg ggg tac AGT GCA gaa aga ata g	Para la detección de PCR, que se utiliza con P6
P6 (por Tet-On H1)	GAT TTC GAA CCA CAC ATA GCG CA	Para la detección de PCR, que se utiliza con P5
P6 (por U6)	AGG GTG AGT TTC CTT TGC TTG TG	Para la detección de PCR, que se utiliza con P5

Tabla 1. Oligonucleótidos sintetizados utilizados en la generación de construcciones shRNA. P1 y P6 para las secuencias de la U6 ratón y Tet-On promotores inducibles humanos H1 se proporcionan. Humano YY1 se utiliza como un ejemplo con una secuencia diana de ARNhc GGG AGC CAG AGG AGA AGA TGC T. Las secuencias específicas para YY1 se destacan. Dos secuencias de P2 YY1 están diseñados para los dos promotores, respectivamente. El constitutiva U6 / YY1 shRNA fue descrito previamente ^15, mientras que el Tet-On H1/YY1 se utilizó en este protocolo. P5 es el vector específico y la secuencia para pLL3.7 ¹⁴ se muestra. Las secuencias de las enzimas de restricción están subrayados, mientras que las secuencias para recocer a los promotores durante la amplificación por PCR en cursiva están.

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Discusión

Este protocolo describe un método para derribar un gen utilizando ARNhc y visualizar su efecto biológico usando imágenes bioluminiscente de crecimiento de células tumorales in vivo. El sitio de destino de un ARNhc no debe contener cualquiera de los tres sitios de restricción (BamHI, HindIII y EcoRI) utilizado para la subclonación. En un escenario raro cuando cualquiera de estos sitios está presente, una enzima de restricción adicional puede ser utilizado en su lugar en la generación de la construcción...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo
Seguridad de la Biotecnología adecuado para la contención de Bioseguridad Nivel 2 del Gabinete
PCR termociclador
Ultracentrífuga
La anestesia de inducción de la cámara con captadores de isoflurano
Digital vernier
IVIS Imaging System
Altamente competentes E. coli DH5a
EcoRI, BamHI, HindIII y enzimas de restricción
T4 ADN ligasa
La tercera generación de embalaje plásmidos lentivirus VSV-G, pRSV Rev y pMDLg / pRRE