Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Resumen

La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.

Resumen

Modelos de animales pequeños tales como ratones se han utilizado ampliamente para estudiar las enfermedades humanas y para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas. A pesar de la riqueza de la información obtenida de estos estudios, las características únicas de la inmunidad ratón, así como la especificidad de especie de las enfermedades virales tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) condujo al desarrollo de modelos de ratones humanizados. Los modelos anteriores implicaban el uso de C. B 17 scid / scid ratones y el trasplante de timo fetal humano y el hígado fetal denominadas tu / liv (SCID-hu) ^{1, 2} o la transferencia adoptiva de leucocitos de sangre periférica humanos (SCID-huPBL ) ^3. Ambos modelos se utilizaron principalmente para el estudio de la infección por VIH.

Una de las principales limitaciones de estos dos modelos es la falta de reconstitución estable de las células inmunes humanas en la periferia para que sean un modelo fisiológicamente más relevantes para estudiar la enfermedad del VIH. Con este fin, el zumbido BLTmodelo de ratón anized fue desarrollado. BLT es sinónimo de médula ósea / hígado / timo. En este modelo, de 6 a 8 semanas de edad NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratones inmunocomprometidos recibir el implante tu / liv como en el modelo de ratón SCID-hu sólo para ser seguido por un segundo humana trasplante de células madre hematopoyéticas ^4. La ventaja de este sistema es la reconstitución completa del sistema inmunológico humano en la periferia. Este modelo ha sido utilizado para estudiar la infección por VIH y la latencia de ^5-8.

Hemos generado una versión modificada de este modelo en el que usamos modificado genéticamente las células madre hematopoyéticas (HHSC) para construir el implante de tu / liv seguida de la inyección de transducidas autólogas HHSC ^{7, 9.} Este enfoque resulta en la generación de linajes genéticamente modificados. Más importante aún, este sistema adaptado para examinar el potencial de generar células funcionales T citotóxicos (CTL) que expresan un receptor específico de melanoma de células T. Utilizando este modelo hemos sido capaces de evaluar la funcionalidad de nuestro CTL transgénico utilizando emisión en directo positrones (PET) para determinar la regresión del tumor (9).

El objetivo de este protocolo es para describir el proceso de la generación de estos ratones transgénicos y evaluación de la eficacia in vivo usando imágenes de PET en vivo. Como nota, ya que utilizamos los tejidos humanos y vectores lentiviral, nuestras instalaciones se ajustan a las directrices del CDC NIH para el Nivel de Bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales (BSL2 +). Además, los ratones sin garantía soberana están severamente inmunocomprometidos por lo tanto, su vivienda y mantenimiento deben cumplir con los más altos estándares de salud ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocolo

A. Generación de ratones BLT

La generación de ratones BLT se divide en tres (3) partes: (1) de procesamiento de tejido fetal y preparación de células CD34 humanos madre hematopoyéticas, (2) el trasplante de tejido humano, y (3) trasplante secundario. Para todos los protocolos, hemos proporcionado la Tabla 1 con información reactivo.

1. Procesamiento de tejidos y aislamiento de células troncales humanas CD34 hematopoyéticas

Tejido fresco o tejido fetal enviado durante la noche en hielo de varias agencias de obtención de órganos pueden ser utilizados. A menudo el tejido fetal no es estéril, como se evidencia por la producción de 1.000 colonias de bacterias en agar sangre por mililitro de medio circundante. Rutinariamente lave el tejido en dos ocasiones en 40 ml de PBS estéril. Si bien esto no elimina todas las bacterias, puede hacer la diferencia entre una serie trasplante exitoso y un resultado en el que la mayoría de los ratones receptores sucumben a las bacterias eninfección. Como un paso adicional, además de desinfectar el tejido, que la cultura de la suspensión de células en presencia de antibióticos.

1.1 Procesamiento de tejido tímico fetal

1. Lavar timo vertiendo el medio en un vaso de precipitados de cloro y el uso de bisturí para evitar que el tejido se deslice en la lejía. Llenar el tubo con PBS. Cierre e invierta varias veces para lavar el timo. Decantar el sobrenadante en lejía. Repetir.
2. Coloque el tejido del timo en 8 ml de RPMI + 10% de suero de ternera fetal en una placa de 60-mm y cortante en piezas de 1,5 a 2 mm con dos escalpelos. Shearing con escalpelos minimiza roturas y daños en los bits de tejidos. El tejido dañado tiende a hincharse, pegajoso y difícil de extraer en la aguja de implante. El número de bits obtenidos es el límite superior primero en ratones trasplantables.
3. Transferir los bits de suspensión con una pipeta de 25 ml (para minimizar el daño del tejido) en un matraz T25. Añadir 70 l de piptazo (Zosyn) al matraz y cultivo durante la noche, a 37 ° C, 5% de CO _2. Esto reduce considerablemente las bacterias contaminantes. Si desea hacer cualquier tipo de tejido u otros ensayos fenotípicos, sacar 1 ml de células.

1,2 Procesamiento de tejido de hígado fetal

1. Lavar el hígado como en el paso 1.1.1.
2. Añadir 10 ml de todo medio de Iscove y se decanta en un 100 mm placa de Petri.
3. Con dos escalpelos, dado el hígado en pequeños (~ 3 mm) piezas. Si se encuentra tejido conjuntivo blanco, raspar el hígado de ella y tírela a la lejía.
4. Homogeneizar el tejido por succión en una jeringa de 12 ml equipado con una aguja de punta roma de calibre 16 3 o 4 veces y transferir a un tubo de 50 ml.
5. Preparar las enzimas para la digestión de los tejidos de la siguiente manera: A 10 ml de Iscove en un tubo de 50 ml, añadir 200 l de cada una: la colagenasa tipo IV (1 mg / ml), hialuronidasa (1 mg / ml), DNasa I (2 U / ml).
6. Dibujar enzimas en una jeringa de 12 ml y montarlo con un filtro de 0,22 μ. Filtrar la enzime / medio directamente en la suspensión celular.
7. Tapan y se sellan las células con Parafilm. Girar a 37 º C durante 90 min.
8. Establecer un tubo de 50 ml con un colador μ 100 células. Pipetear la célula digerir a través de este filtro.
9. Añadir PBS a las células para llevar el volumen hasta 50 ml. Dividirla en dos tubos de 25 ml.
10. Underlay las células con 10 ml de Ficoll. Haz girar a 2.400 rpm durante 20 minutos sin freno.
11. La interfaz debe ser espesa. Suck it con una pipeta de 5 ml y transferir a otro tubo. Usted debe tener dos tubos de interfaz. Añadir 50 ml de PBS a cada y giran a 1.200 rpm durante 10 min.
12. Combinar gránulos en un tubo y lavar tres veces más con PBS que contenía 2% de FCS.
13. Finalmente suspender en 50 ml de RPMI + 10% de FCS y cuentan las células usando azul de tripano. Dependiendo del tamaño del tejido, se puede obtener a partir de 08 ^{10-septiembre} 10 hepatocitos totales.
14. Transferir las células a un matraz T150 y añadir 30 ml de RPMI + 10% de FCS y 0,8 ml de piptazo.
15. Incubar durante 1 a 1,5 horas a 37 ° C para eliminar las células adherentes.

1.3 Selección y Transducción de células madre hematopoyéticas CD34

1. Después de la unión de células en la etapa 1.2.15, agitar el matraz suavemente adelante y atrás durante un minuto para desalojar las células sueltas. Habrá una gran cantidad de fibroblastos y pegado tal a la superficie.
2. Contar de nuevo utilizando una dilución de 1 a 20 y registrar el número total de células. Guardar unas pocas décimas de un ml para su posterior tinción. Usted debe tener aproximadamente 30% de células menos de su conteo de células iniciales (paso 1.2.13).
3. Decantar y lavar dos veces con 40 ml de tampón de MACS.
4. Células CD34 se ordenan utilizando CD34 Kit Direct Miltenyi Biotech. Nosotros seguimos exactamente el protocolo del fabricante utilizando columnas LS proporcionados por la misma empresa.
5. Células recuperadas serán en 5 ml. Contar y calcular el total de células. Su rendimiento de células CD34 + deben ser 3-5% de los recuentos de células totales. Esto varía con the edad del hígado fetal. Los más pequeños hígados fetales tienden a dar un mayor rendimiento de las células CD34 +.
6. Se divide el número de células por 1x10 ^6. Esto da el límite superior en la segunda ratones trasplantables.
7. Contar el CD34-fracción (flujo a través y lavados) y reserva de 6 x 10 ⁶ por ratón para ser trasplantadas. Cultura estas células durante la noche en 50 a 80 ml de RPMI + 10% de suero fetal de ternera + 1% piptazo.
8. Transducir las células CD34 + durante la noche con el vector lentiviral. Usamos retronectina por Takara siguiendo exactamente las instrucciones del fabricante.
9. El día siguiente, la cosecha de las células CD34-, CD34 + transfectadas las células y contar.
10. Dividir las células CD34 + por la mitad: la Parte A y la Parte B.
11. Decantar la Parte A las células CD34 + transducidas y suspender en 4 a 6 ml de medio de congelación (RPMI + 10% FCS + 10% de DMSO, 0,22 μ filtrada estéril). Poner partes alícuotas de 1 ml en viales de congelación y la etiqueta con "huFetalCD34", el número de células en el vial, la fecha, y sus iniciales.
12. Para cada ratón mezclar 0.5x10 ⁶ Parte B CD34 + células transducidas y 4.5x10 ⁶ células CD34-en un tubo de microcentrífuga estéril de tapa de rosca, pellet y mantener en hielo. También descongelar un tubo de Matrigel (BD Biosciences) en hielo. Todos estos tubos deben mantenerse en hielo hasta su uso (vea el apartado 2.10).

2. Trasplante de tejido

El objetivo de este paso es trasplantar un timo fetal humano / organoides hígado bajo la cápsula renal ratón NSG. Esta organoide mejor imita el proceso de selección de células T humanas y procesos de maduración como las células madre hematopoyéticas humanas usará el timo humano y no el ratón como el sitio para su diferenciación a células T diferentes y otros linajes linfoides. El uso de células CD34-en el proceso de trasplante es para volver a generar el estroma de hígado fetal y permitiendo una mejor trasplante y el crecimiento del implante. La edad de los ratones utilizados GSN es de 6-8 semanas de edad.

1. Preparación de medicamentos para SUrgery:
   1. El isoflurano: Enrolle una gasa de 2 pulgadas y meterlo en un tubo de centrífuga de 15 ml con tapón de rosca. Verter en aproximadamente 1 ml de isoflurano directamente de la botella.
   2. La ketamina / zylazine: Añadir 0,52 ml de ketamina (Ketaset) (100 mg / ml) y 0,52 ml de xilazina (Anased) (100 mg / ml) a un vial de 20 ml de solución salina para inyección. Etiqueta con la fecha de vencimiento de la primera componente de expirar y mantener congelado a -20 ° C hasta que se necesite.
   3. Carprofeno (Rimadyl). Diluir esta justo antes de un procedimiento quirúrgico. Diluir 1:100 mediante la retirada de 0,1 o 0,2 ml del vial con una jeringa de 1 ml y una aguja 25G. Inyectar en un 10 o 20 ml de solución salina para inyección. Sello y fecha. Mantener en la nevera durante un único día. Cargar en jeringas de 3 ml con aguja 25G.
2. Prepare la mesa para las cirugías. Cúbralo con almohadillas estériles azules, y una toalla estéril para cada cirujano. Cada cirujano obtiene de su caja de instrumentos esterilizados: 4 "tijeras, pinzas curvas contundentes, necesitanle-nariz pinzas hemostáticas, 16G, trocar romo y aplicador del clip de la herida. Además, se necesita una aguja de sutura curvado-Vicryl, una pila de isopropanol limpiar paquetes, una placa de Petri de 35 mm de PBS, y una jeringa de 1 ml llena con PBS.
3. Situado en el centro de la mesa un frasco de vidrio de Coplin con 2 cm de Betadine y 2 hisopos de algodón. Vierta los bits del timo en una placa de Petri de 60 mm.
4. La anestesia se realizó en una mesa separada o en una campana de cubierta con almohadillas estériles azules. La creación de dos bastidores pequeños y una balanza electrónica con un vaso para contener los ratones. Utilice un bastidor para sostener 0,5 ml jeringas X 28G insulina cargada con ketamina / xilazina y la otra para sujetar las jeringas de 3 ml de carprofeno. También mueve el envase para peligros biológicos cerca para mantener la piel afeitada.
5. Pesar todos los ratones (6-8 semanas de edad) en una jaula para conseguir el peso medio y jeringas de carga con una dosis de 15 l / g de ketamina / xilazina. Inyectar todos los ratones de la jaula.
6. Después de que los ratones se hacen lentos afeitarse el left lateral de la cadera al hombro entre el centro de la espalda y el vientre con una cortadora Oster con cuchilla N º 40. Registre su peso y perforar los oídos de numeración.
7. Inyectar 0,3 ml por vía subcutánea carprofeno sobre el hombro.
8. Compruebe el nivel de anestesia del ratón apretando una pata. Si los flinches ratón, administrar isoflurano partir de un tubo de aproximadamente 12 sec. A continuación, intente la contracción pata otra vez. Siga dando golpes cortos de isoflurano hasta la pata reflejo desaparece. Coloque el ratón sobre su lado derecho hacia la izquierda.
9. Una aguja de calibre 16-cáncer de implante, con la punta redonda presentada se utiliza para insertar el tejido. Lave el trocar unas cuantas veces en el plato de PBS. Sostener en posición horizontal con la barra justo en la punta. Agregue un pedazo de timo con las pinzas de punta fina y chupar pulg
10. Un ayudante añade 5 l de Matrigel frío a un tubo de células (paso 1.3.12) con una pipeta de desplazamiento positivo Eppendorf, y se mezcla por agitación suave. El cirujano holds el trocar horizontalmente y tira de la varilla hacia atrás lentamente mientras el ayudante Pipetas la mezcla Matrigel en el trocar. La mezcla se gelifica a la temperatura ambiente.
11. Limpie la piel desnuda con Betadine. Luego, limpie esto adelante con un trapo isopropanol. Repetir.
12. Localizar el bazo debajo de la piel. Es el punto más oscuro. Riñón del ratón está localizado aproximadamente 5 mm dorsal al bazo, lo que puede ser visto a través de la piel afeitada.
13. Recoger la piel sobre este lugar con las pinzas romas y hacer un corte paralelo al bazo aproximadamente 15 mm de largo. Haga un corte similar en la capa muscular debajo del peritoneo. En los hombres, el riñón debe ser directamente visible y sólo tiene que apretar el abdomen para que salte. En las mujeres, puede que tenga que recoger el ovario con la pinza hemostática y arrastre el riñón. Esto puede ayudar a retener el riñón fuera del cuerpo. Para los hombres, usted tendrá que mantener cierta presión sobre el abdomen con la mano izquierda para mantener el riñón expuesto.
14. Arranca un pequeño agujero en la posterior extremo de la cápsula renal. Es posible que sangre un poco.
15. Deslizar el trocar en este orificio y a lo largo del riñón hasta que el orificio del trocar está completamente cubierto por la cápsula renal. Luego, utilizando el dedo meñique de la mano derecha, se inyecta el tejido.
16. Empuje el riñón de nuevo suavemente con la pinza hemostática cerrada. Pon una puntada en el peritoneo atado con un know doble. Apriete la piel como un bolso y echó dos clips de la herida.
17. Ponga una gota de PBS en cada ojo y poner el ratón sobre su lado en la cama jaula. Asegúrese de que todos los ratones han vuelto a sentar en sus vientres antes de salir de ellos.
18. Al día siguiente, dar a cada ratón otra oportunidad de carprofeno.

3. Trasplante de Secundaria

El objetivo de este paso en la generación de ratones BLT es poblar la médula ósea mueca con células madre hematopoyéticas humanas. El implante trasplantado de procedimiento (2) no es suficiente para apoyar la reconstitución completa de the del sistema inmune humano en estos ratones. Durante el trasplante secundario, sub-letalmente irradiar los ratones para agotar células de médula ósea murinas generando así un "espacio" para la implantación de las células CD34 + humanas.

1. De cuatro a seis semanas después irradiar a los ratones con 2,7 Gy. Los ratones son inyectados el mismo día de la Parte A con células CD34 + transducidas. El plazo se basa en la creación y el crecimiento de los implantes tu / liv trasplantado en el paso 2. Por lo general, durante este tiempo el implante ha crecido de manera significativa lo que nos permite continuar con los pasos siguientes.
2. Descongelar la Parte A de células CD34 + transducidas, lavar y suspender en medio a una concentración de 5x10 ⁶ / ml.
3. Cargar 0,5 ml jeringas X 28G insulina con 0,1 ml de células (10 ⁵ a 5x10 ⁵ células por 0,1 ml por ratón) durante una jaula de ratones (cada jaula contiene un máximo de 5 ratones) y las ponen en un estante de espaldas.
4. Anestesie un ratón con un tubo de isoflurano Scruffing por ella y la celebración de sunariz en los tubos de aproximadamente 20 sec. Contar para realizar un seguimiento del tiempo.
5. A continuación, se enfrentan a la derecha, y tire de la piel alrededor de su cuello apretado con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda. Pulse debajo de su mandíbula con su buscador de tercera para que su ojo derecho bombea hacia fuera. Sosteniendo la jeringa paralela al eje largo de la cabeza del ratón, el deslizamiento de la aguja por detrás del ojo y deslice suavemente hasta que se detenga. No presione más lejos, pero inyectar la carga durante aproximadamente 2 segundos.
6. Dos a tres meses después los ratones se sangraron retroorbitalmente utilizando pipetas de vidrio recubiertas con EDTA. Usted sólo puede tener un máximo de 200 l de sangre por mes por ratón. 50-100 l de sangre debe ser suficiente para el análisis FACS. Otras estrategias incluyen sangrado sangra y sangra venas faciales vena de la cola. Este último le dará muy pequeños volúmenes de sangre que pueden no ser suficientes para los ensayos múltiples.
7. Las muestras de sangre se tiñeron para la expresión del marcador CD45 de linfocitos humanos para evaluar la reconstitución. Blood muestras se añaden a 1 ml de tampón de lisis de células rojas de la sangre (160 mM NH ₄ Cl, 100 mM de KHCO _3, 0,01 mM EDTA) y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Lavar las células en tampón de lisis, 5 min a 1.200 rpm, y repetir si es necesario.
9. Centrifugar las células como en 3,8 y lavar en PBS suplementado con 3% de suero fetal de ternero (FACS-PBS).
10. Retirar el sobrenadante y volver a suspender pellets en 100 l FACS-PBS.
11. Añadir anticuerpos para evaluar la reconstitución de linfocitos humanos. Nos típicamente incluyen las siguientes CD45 (marcador de linfocitos humanos), CD8, CD4, CD14 y CD16 para los macrófagos y monocitos, CD19 de las células B y CD56 para las células NK.
12. Incubar a 4 º C durante 30 min.
13. Lavar como en el paso 3,9 y volver a suspender las células en paraformaldehído al 2% para el análisis FACS.
14. Si los ratones se reconstituye, se procede con inyecciones tumorales. Los niveles de reconstitución de linfocitos humanos varían, desde menos de 1% a 40% de las células sanguíneas totales. Los niveles y tipos de lymphoclinajes YTE son comparables a lo que cabría esperar a partir de donantes de sangre humana. Sin embargo, sí esperamos que las fluctuaciones en el número de linajes de células no T. Si los números no son aceptables en el plazo de 12 semanas se puede repetir el procedimiento de trasplante de secundaria desde el paso 3.1.
15. Las líneas celulares tumorales se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante o de laboratorio. Las células se cosecharon, se lavaron y se resuspendieron en matrigel en una proporción de 1:1 (50 l células/50 l de Matrigel). Las muestras se mantuvieron en hielo en todo momento.
16. Los ratones son anestesiados y se afeitó en la zona de inyección. El área se esteriliza utilizando una almohadilla de isopropanol. A las cargas auxiliares suspensiones de células en pre enfriado 23G jeringas de 1 ml. Las células tumorales se inyectan por vía subcutánea. Tratar el sitio de la inyección con pomada antibiótica. Los tumores deben establecer y comenzar a crecer en 4 semanas.

B. En vivo Tomografía por Emisión de Positrones (PET)

En nuestros estudios hemos examenla captación de glucosa ine ^([18 F]-FDG ^([18 F] FDG) así ratones se mantienen en ayunas 4-6 horas antes de la proyección de imágenes. MicroPET / TC se realiza mediante el microPET Inveon escáner (Siemens Soluciones preclínicos) y MicroCATII CT escáner ( PreclinicalSolutions Siemens). análisis de imagen se realiza utilizando OsiriX (Pixmeo, Suiza) de software. El objetivo es medir la actividad metabólica del tumor y en última instancia a usar imágenes de PET como una alternativa a medir físicamente la regresión del tumor. Como se ve en la Figura 2, se han encontrado que los tumores basados ​​en la apariencia física y el tamaño no están orientados pero las imágenes de PET en vivo revelaron necrosis tisular extensa. Esta metodología puede servir como un indicador más sensible y exacta de la regresión del tumor.

1. Designe a una cámara para anestesiar (2% isofluorano) los ratones, y una cámara como la captación de FDG 60 min antes de PET ("espera cámara"). Coloque almohadillas azules en ambas cámaras.
2. Como los animales son Anesthetized durante largos periodos, que se debe mantener caliente a 30 ° C mediante el uso de guantes llenos de agua que se calientan en un horno de microondas y colocando las jaulas en las almohadillas de calor.
3. Gire el flujo isoflurano para esta cámara en. Permitir que el isoflurano para llenar la cámara anestesiante para aproximadamente 5-10 min antes de colocar ningún ratón en la cámara. Asegúrese de que la tapa está cerrada y bien cerrada para evitar fugas de isoflurano.
4. Coloque el ratón por primera vez en la cámara anestésica y cerrar la tapa herméticamente. Permitir 5-10 minutos o hasta que el ratón está inconsciente.
5. Quite el ratón desde la cámara anestésica, la etiqueta de la cola del ratón (color diferente por jaula) y se inyecta por vía intraperitoneal al ratón con ^[18 F] FDG (80 Ci). Tome nota del tiempo se inyectó el ratón. El ratón se anestesió de nuevo a 50 minutos de este punto de tiempo, lo que permite 10 minutos de configurar para PET (para el total de 60 min ^[18 F] FDG captación antes de PET).
6. Coloque el ratón inyectado en la cámara de espera, permitiendo ^[18 F] FDG captación durante 1 hora antes de la PET. No cierre la tapa. Deje la tapa floja para permitir la circulación de aire.
7. Colocar inmediatamente el ratón al lado de inyección de FDG en la cámara anestésica. Ratones inyecciones subsiguientes deben estar espaciados 10 min aparte, debido a que el proceso de la PET es 10 min. Inmediatamente después de que un ratón es escaneada, la captación de FDG 60 min para el ratón junto a escanear estará listo exactamente 10 minutos aparte.
8. Continuar inyectando ratones anestesiar y como se indica en los pasos 7-9.
9. Después de 50 min desde el punto de tiempo de ratón primera inyección, colocar el primer ratón inyectado en la cámara anestésica de nuevo (mientras todavía continúa para anestesiar e inyectar ratones).
10. Conecte el ratón a la cama oxígeno y las líneas de isoflurano y gire el flujo del isoflurano en la cama. Coloque una almohadilla de color azul en la cama.
11. Coloque el ratón listo para la PET en la cama, estirando los brazos ypiernas y sosteniendo esta posición con cinta adhesiva. Coloque lubricante sobre los ojos. Esta etapa es la más crucial ya que la posición del animal puede afectar a la calidad de su imagen.
12. Desconecte las líneas de isoflurano y oxígeno, y montar rápidamente el lecho en la máquina de escaneo PET. Coloque las líneas de isoflurano y oxígeno. Asegúrese de que el flujo de isoflurano es para que la máquina PET. Conecte el cable de la PET y comenzar la exploración.
13. Una vez que el PET es completa luego pasar al animal al escáner CT. A raíz de esta exploración mover al animal a su jaula correspondiente.

Resultados

Un diagrama de flujo del proceso de trasplante se muestra en la Figura 1A. Una imagen del implante tu / liv se muestra en la Figura 1B. El tejido del timo se desarrolla normalmente y tiene una distribución fisiológica de CD4 humano y las células T CD8. Tras la reconstitución, los animales llevan un sistema inmunitario humano con distribución normal de CD4, CD8 células T y otros linajes celulares inmunes.

La discrepancia entre el tamaño del tumor y el ...

Discusión

El modelo de ratón humanizado modificado BLT junto con in vivo PET son herramientas poderosas para estudiar enfermedades humanas crónicas. Este sistema toma el modelo de ratón BLT y lo hace avanzar más allá de las limitadas posibilidades de investigación del VIH. Además, es un gran sistema en el que puede examinar diversos protocolos de terapia génica, así como técnicas de diagnóstico antes de que puedan alcanzar el entorno clínico. Esto último, junto con el bajo coste de la utilización de ratones...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove		12440061
Suero de ternero fetal		16000085
La colagenasa tipo IV	Sigma Aldrich	C5138
Hialuronidasa		H3506
DNAsa I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacilina / tazobactam combinación
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	Véanse los comentarios	MACS tampón: PBS suplementado con suero fetal bovino al 0,5% y 2 mM de citrato de dextrosa fórmula-A
CD34 microperla Kit		130-046-702
Columnas LS		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorano	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofeno (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx