Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Resumen

Mediante la combinación de un pulido y reforzado delgada cráneo (puertos) craneal ventana y glioblastoma (GBM) la inyección de células, se puede observar la iniciación glioma y el crecimiento de las células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo longitudinalmente.

Resumen

El glioma es el de las formas más letales de cáncer humano. La terapia del glioma más eficaz hasta la fecha de la cirugía seguida de radiación con el tratamiento ofrece al paciente modestos beneficios, como la mayoría de los pacientes no sobreviven más de cinco años después del diagnóstico debido a glioma ^1,2 recaída. El descubrimiento de las células madre del cáncer en los tumores cerebrales humanos promete tener un impacto enorme en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el glioma ^3. Las células madre cancerosas se definen por su capacidad tanto de auto-renovación y diferenciar a, y se cree que son las únicas células en un tumor que tiene la capacidad de iniciar nuevos tumores ^4. Glioma terapia de recaída después de la radiación se cree que surgen de la resistencia de las células madre de glioma (GSCS) a la terapia ^5-10. In vivo, GSCS se muestran a residir en un nicho perivascular que es importante para mantener sus madre similares a células características ^11-14 . Central a la organizaciónción del nicho GSC son las células endoteliales vasculares ^12. La evidencia actual sugiere que GSCS y su interacción con las células endoteliales vasculares son importantes para el desarrollo del tumor, e identificar GSCS y su interacción con las células endoteliales como importantes dianas terapéuticas para el glioma. La presencia de GSCS se determina experimentalmente mediante su capacidad de iniciar nuevos tumores en trasplante ortotópico ^15. Esto se consigue normalmente mediante la inyección de un número específico de células aisladas de tumores GBM humanos en los cerebros de severamente inmuno-ratones deficientes, o de células de ratón de GBM en los cerebros de los ratones receptores congénicos. Los ensayos para el crecimiento del tumor se realiza entonces después de un tiempo suficiente para permitir GSCS entre las células inyectadas GBM para dar lugar a nuevos tumores-típicamente de varias semanas o meses. Por lo tanto, los ensayos existentes no permiten examinar el importante proceso patológico de la iniciación del tumor de GSCS solteras en vivo. Por consiguiente, es esencial quensights en las funciones específicas de GSCS y su interacción con las células endoteliales vasculares en las primeras etapas de la iniciación del tumor se carece. Estas ideas son fundamentales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el glioma, y ​​tendrá grandes implicaciones para la prevención de recaídas en pacientes con glioma. Aquí se han adaptado los puertos procedimiento de ventana craneal ¹⁶ e in vivo de dos fotones microscopía para permitir la visualización de la iniciación del tumor a partir de células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo. Nuestra técnica allanará el camino para los futuros esfuerzos por esclarecer los mecanismos clave de señalización entre GSCS y células endoteliales vasculares durante el inicio del glioma.

Protocolo

1. Protocolo

1. Se anestesia el ratón con ketamina y xilazina a dosis de ketamina 0,1 mg y 0,01 mg de xilazina por 1 g de peso corporal. Carprofeno (0,005 mg por 1 g de peso corporal) se utiliza para la analgesia y se administra antes de la cirugía.
2. Todas las herramientas quirúrgicas, como la broca dental, son esterilizados con vapor en un autoclave. Si cirugías lotes se van a realizar, las puntas de los instrumentos quirúrgicos deben ser re-esterilizado con un esterilizador de cuentas de vidrio (Fine Ciencia Herramientas FST 250) antes de cada cirugía posterior.
3. Una vez que el ratón se ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, evaluada por la ausencia de una respuesta a una pizca dedo del pie, que se coloca sobre una almohadilla de algodón que se coloca a continuación en una almohadilla de calefacción para mantener una temperatura corporal de ~ 37 ° C. La profundidad de la anestesia se monitoriza con frecuencia durante la cirugía.
4. Fur se retira de la cabeza de dorsal en un área aproximadamente triangular ~ 3 mm caudal a los orificios nasales y se extiende caudalmente a la cervical vértebras. Pomada oftálmica se aplica a los ojos para protegerlos de la deshidratación y la irritación.
5. El ratón se coloca en recumbancy ventral y la piel se desinfecta con yodo quirúrgica, 70% de etanol, y torundas estériles. D 0,8 x 1,0 cm colgajo de piel que cubre la cara dorsal de los huesos frontal y parietal del cráneo se retira con unas tijeras finas.
6. Un analgésico tópico, 0,5% de lidocaína, se aplica localmente en el periostio y los tejidos expuestos en la periferia de la herida. El periostio se quita raspando suavemente el cráneo con una hoja de bisturí, esto ayudará a que el pegamento de cianoacrilato para adherirse al hueso.
7. El área cortical de interés se resume en el cráneo con un marcador. El área de interés no deberían estar situados sobre las líneas de sutura del cráneo, para evitar daños a los buques grandes subyacentes.
8. Una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato se aplica a los bordes de la herida, para evitar la filtración del fluido serosanguinolento, y en el cráneo, excepto enel área de interés.
9. Activado por la luz cemento dental se utiliza en el protocolo para el sellado de la calavera. Antes de la aplicación de cemento dental, todo el cráneo expuesto a excepción de la zona prevista para el adelgazamiento se trata con los cebadores y posteriormente con el agente de unión del kit de cemento dental activado por luz. Una vez que el agente de unión se secó, el cemento dental activado por luz se aplica para cubrir el cráneo. Para estabilizar la cabeza del ratón para la cirugía posterior y formación de imágenes, un estéril # 00-90 tuerca hexagonal está incrustado en el cemento dental a una distancia de la zona a ser adelgazada. El uso de luz activado por cemento dental nos permite preparar el cráneo sin tener que apresurarse para terminar el procedimiento. Una vez que la preparación del cemento dental en el cráneo se ha completado, el cemento dental se cura con luz visible.
10. Después de que el cemento dental se cura, un soporte de pieza de cabeza desde el dispositivo estereotáctico está montado en la tuerca hexagonal en la cabeza del ratón utilizando un tornillo # 00-90.
11. A drop de la temperatura ambiente, 0,9% de solución salina estéril se aplica a la zona del cráneo a ser adelgazada. Con la ayuda de un estereomicroscopio, una alta velocidad de micro-perforación se utiliza para adelgazar un área circular del cráneo (normalmente ~ 4-5 mm de diámetro) sobre la región de interés. Perforación y la aplicación de la solución salina al área perforada se realizan de forma intermitente durante el procedimiento de adelgazamiento para evitar la lesión térmica al tejido cerebral subyacente. Saline absorbe el calor y también ayuda a suavizar el hueso.
12. El cráneo de ratón comprende dos capas delgadas de hueso compacto, intercalando una capa gruesa de hueso esponjoso. La capa externa de hueso compacto y la mayoría del hueso esponjoso se eliminan utilizando el taladro.
13. Después de que la mayoría del hueso esponjoso se retira, las cavidades que quedan dentro del hueso esponjoso puede ser visto bajo un microscopio de disección, lo que indica que la perforación se acerca a la capa interna de hueso compacto. En esta etapa, el espesor del cráneo todavía debe ser más de 50 micras. Cráneo adelgazamiento debe sersiguió cuidadosamente para obtener una preparación muy delgada (~ 20 m) y suave.
14. Una vez que el grosor deseado de cráneo se consigue (~ 20 m), el cráneo es primero pule con un látigo de silicona a medida con pasta de diamante (6-15 micras) durante aproximadamente 10 min. El pulido de diamantes pasta sirve para dos propósitos. En primer lugar, además adelgaza el cráneo sin la aplicación de presión en el cráneo adelgazada, evitando así el daño accidental al tejido cerebral subyacente. En segundo lugar, sirve como un paso de pulido inicial para el cráneo antes de diluir el óxido de estaño de grano fino se utiliza para el pulido cráneo adicional.
15. Tras el pulido de diamantes de pasta, el cráneo adelgazada se pule con óxido de estaño de aproximadamente 10 min. Una vez que el cráneo es pulido, el óxido de estaño es arrastrada con solución salina hasta que el cráneo adelgazado vea limpia.
16. En este paso, si la ventana craneal se va a utilizar para longitudinal de imágenes in vivo, el área limpiada cráneo delgado se seca. Una pequeña gota de claropegamento de cianoacrilato se aplica para sellar la ventana craneal. La capa de pegamento de cianoacrilato entre el cráneo adelgazada y el cubreobjetos debe ser tan delgado como sea posible.
17. Si la inyección se debe realizar después de la creación de una ventana craneal puertos, en este paso, una aguja de jeringa de calibre 26-se utiliza para crear una pequeña abertura en un lado de la pulida delgada cráneo ventana. Esta abertura se utiliza para la inyección de células de glioblastoma multiforme.
18. Una pipeta de vidrio estéril con punta de abrir unas 50 micras de diámetro se tira con un extractor pipeta. Esta pipeta se utilizan para la inyección de células GBM, y se carga en un micromanipulador. La pipeta se carga en un ángulo de 30-grados para que el sitio de la célula de inyección GBM estará lejos del sitio de formación de imágenes final. La punta de la pipeta se retira bajo un microscopio de disección. La suspensión de células GBM es de carga frontal en la pipeta por succión con una bomba de jeringa.
19. Una vez que la pipeta de inyección se carga con células GBM, el ratón se mueve de nuevo bajo the microscopio. La pipeta de inyección se baja hacia la pequeña abertura en la ventana craneal y, finalmente, se inserta en el cerebro a través de la abertura utilizando un micromanipulador. 1 l de una suspensión de células GBM se inyecta en el cerebro 100-200 micras desde la superficie del cerebro (velocidad: 0,1 l / min, duración: 10 min).
20. El cráneo se seca, una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato transparente se aplica al cráneo seco, y una pieza de 3-mm de tamaño # 1 cubreobjetos se adhiere a la superficie del cráneo delgado y pulido. El espacio entre el cubreobjetos y cemento dental adyacente está sellado con pegamento de cianoacrilato.
21. Después de la cirugía, el ratón se inyecta por vía subcutánea con 1 ml de solución salina estéril caliente y provisto de calor suplementario para mantener la temperatura del cuerpo hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
22. Para las imágenes, los ratones son anestesiados con ketamina y xilazina a dosis de ketamina 0,1 mg y 0,01 mg de xilazina por 1 g de peso corporal. Los ratones se inmovilizan utilizando un marco estereotáctico costumbrebajo el microscopio. Si repetitiva de imágenes in vivo se realiza en forma diaria, isofluorano será una mejor opción, ya que los ratones se muestran signos de dependencia con el uso repetitivo de la ketamina.

2. Los resultados representativos

Una cirugía exitosa puertos ventana craneal permite que la ventana craneal a quedar claro por semanas o meses. Figura 1 muestra la vasculatura debajo de una ventana Puertos craneal como visualizó con luz retrodispersada. Estas imágenes de la vasculatura fueron utilizados como puntos de referencia para la localización de las mismas áreas del cerebro para imágenes repetitivas. Para visualizar tanto las células endoteliales y las células de la vasculatura GBM, cruzamos el B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J ratones, que las etiquetas de las células endoteliales vasculares con el B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato ) Hze} / J del ratón, y los ratones generados con las células endoteliales vasculares marcadas con el tdTomato proteína fluorescente roja. A continuación, realiza el procedimiento de craneotomía en estos puertos millasce, y se inyectaron células marcadas con GFP GBM en sus cerebros a través de una pequeña abertura en el lado de una ventana craneal. A continuación, realiza in vivo de dos fotones de imágenes longitudinalmente en los ratones inyectados. La longitud de onda de excitación del láser se fijó en 910 nm, lo que resultó en la excitación tanto de GFP y tdTomato. Dos fotones de imágenes se realizó en una costumbre-construido de dos fotones láser de barrido microscopio con dos detectores para la detección de capacidad simultánea verde / rojo de fluorescencia. Figura 2 muestra un ejemplo en vivo de iniciación glioma de células GBM inyecta cerca de la vasculatura. La ventana Puertos craneal es también una excelente opción para la crónica time-lapse de imágenes in vivo. Figura 3 muestra la tinción GFAP secciones de la corteza de un ratón sin necesidad de cirugía puertos, un ratón de 7 días después de la cirugía de los puertos, y un ratón de 7 días después de la cirugía y Puertos inyección de solución salina. Es evidente a partir de las imágenes que el ratón sin necesidad de cirugía y el ratón con PoRCirugía TS no tienen gliosis, mientras que tras la inyección de solución salina, gliosis se observa en el tejido cerebral del ratón, debido a pipetear la penetración y la inyección de solución salina en el cerebro. Este resultado demuestra que gliosis no se produce en la ventana de puertos craneal, proporcionando validación independiente de que los puertos ventana craneal descritos aquí no conduce a la gliosis que se asocia típicamente con un "cráneo abierto" crónica ventana craneal. Figura 4 muestra de alta resolución imágenes de las espinas dendríticas de ratón del mismo en el día de la cirugía (día 0) y 32 días después de la creación de la ventana Puertos (día 32), lo que demuestra que la ventana de puertos es también una excelente opción para la alta resolución de imágenes in vivo.

Figura 1. Visualización de la vasculatura debajo de una ventana cráneo pulido y reforzado adelgazado craneal con luz retrodispersada. Días representar t que el número de días después de la cirugía; imágenes fueron tomadas a partir del día de la cirugía inmediatamente después de la finalización de la inyección de células GBM. Barra de escala:. 0,5 mm Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2. Visualización de las células inyectadas GBM y la vasculatura in vivo. Los ratones que llevan tanto Tek-Cre y ROSA26 CAG-tdTomato fueron utilizados para la inyección de células de glioblastoma multiforme. Las células endoteliales vasculares se marcaron con tdTomato (rojo), y las células se marcaron con GBM GFP (verde). Las imágenes fueron adquiridas a partir de 24 horas después de la inyección de células GBM. Un total de 10-12 campos adyacentes de vista fueron tomadas y se montaron una junto a otra, con las células inyectadas GBM identificados en el centro del campo total, para producir las imágenes finales. Días representan el número de días después de la cirugía. Barra de escala: 100 m.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Figura 3. Gliosis no se produce después de la cirugía puertos ventana craneal. Paneles superiores: Sección coronal de cerebro de ratón bajo condiciones de baja magnificación. Panel izquierdo: un ratón sin ninguna cirugía ventana craneal; no activación GFAP se observa en el tejido cerebral. Medio panel: un ratón con una ventana craneal puertos generado en el lado derecho del cerebro; no activación GFAP se observa en el tejido cerebral. Panel derecho: un ratón con una ventana craneal puertos e inyección de solución salina desde el lado de la ventana Puertos. Activación GFAP se observa en el lado de la ventana de puertos, pero no en el lado del tejido del cerebro intacto. Barra de escala: 1 mm. Panel inferior: de mayor potencia imágenes de los tejidos del cerebro en las áreas que se indican en el cuadro blanco de las imágenes de pantalla superior. Barra de escala: 100 m. Haga clic aquí para ampliar la figura.

Figura 4. Alta resolución de imagen de las espinas dendríticas de ratones Thy-1 YFPH. Las imágenes fueron adquiridas en el día de la cirugía de los puertos, y 32 días después de la cirugía de los puertos. En efecto, de las imágenes que la mayoría de las espinas presentan en el día 0 son claramente visibles 32 días después de la cirugía puertos. Barra de escala: 2 micras.

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Discusión

La clave de una ventana craneal puertos exitoso es el adelgazamiento y pulido. Mientras que el adelgazamiento inicial puede ser realizada rápidamente, se debe tener cuidado para asegurar homogénea adelgazamiento del cráneo sobre un área grande. Nos típicamente aplicar una capa delgada de solución salina al cráneo, y luego delgada del cráneo una pasada a la vez, tal que la solución salina se evapora poco después de la microtaladro ha pasado sobre el cráneo una vez. Esto nos permite lenta pero más homogénea d...

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Materiales

Nombre de reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
DMEM/F12 (1:1) con piruvato de sodio	Thermo Sci Hyclone	SH3026101
B-27 Suplemento libre de suero (50x)	Invitrogen	17504-044
GlutaMax-1 Supplement	Invitrogen	35050061
Solución de penicilina-estreptomicina	Thermo Sci Hyclone	SV30010
Accutase-enzima Tono Medio Desprendimiento	eBiosciences	00-4555-56
T25 frascos de ventilación tapa verde	SARSTEDT	83.1810.502
70% de alcohol	JAX LAHS
10% solución de povidona yodada tópica	JAX LAHS
La ketamina HCl	Mayordomo Animal Health Supply	NDC # 11695-0550-1
Xilazina	Akorn, Inc.	NADA # 139-236
Carprofen	JAX LAHS
De pomada oftálmica	Dechra veterinarios	17033-211-38
0,5% de lidocaína HCl	REGENT, Inc.	NDC 0517-0625-25
Pegamento de cianoacrilato	Henkel Corp.	46551
Los hisopos estériles	Fisher Scientific	23-400-114
Diamond pasta	Widget de suministro	BBE60
Óxido de estaño	LORTONE, Inc.	591-038
Liner Bond 2V	Kuraray Medical Inc.	1921-KA
Clearfil AP-X	Kuraray Medical Inc.	1721-KA
Salina	JAX LAHS
Cubierta de vidrio	Warner Instruments	64-0720
Tuerca hexagonal	Small Parts, Inc.	HNX-0090-C
Syringe Pump	Syringepump.com	NE-1000
Two-Photon Imaging System	Hecha a la medida (Cualquier sistema comercial seríatrabajar)