Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Resumen

Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.

Resumen

La proteína quinasa C (PKC), la familia de isoenzimas está implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros datos recientes demuestran que la PKC regula la función mitocondrial y estado de energía celular. Numerosos informes demuestran que la activación de la PKC-a y PKC-ε mejora la función mitocondrial en el corazón isquémico y media la cardioprotección. En contraste, se ha demostrado que la PKC-α y PKC ε-están implicados en nephrotoxicant inducida por disfunción mitocondrial y la muerte celular en células de riñón. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo in vitro de células renales que mantienen activas las funciones mitocondriales en los que las isoenzimas PKC podría ser selectivamente activados o inhibidos para determinar su papel en la regulación de la fosforilación oxidativa y la supervivencia celular. Los cultivos primarios de células renales tubulares proximales (POCT) se cultivaron en condiciones mejoradas resultantes en la respiración mitocondrial y la actividad de Mitoenzimas mitocondriales similares a los de POCT in vivo. Debido a las técnicas tradicionales de transfección (Lipofectamine, electroporación) son ineficientes en cultivos primarios y tienen efectos adversos sobre la función mitocondrial, PKC-ε ADNc mutantes fueron entregados a través de POCT vectores adenovirales. Este enfoque implica la transfección de más del 90% RPTC culto.

A continuación, se presentan los métodos para evaluar el papel de la PKC-ε en: 1. regulación de la morfología mitocondrial y funciones asociadas con la síntesis de ATP, y 2. supervivencia de POCT en cultivo primario. PKC-ε es activada por la sobreexpresión constitutivamente activa PKC-ε mutante. PKC-ε es inhibida por la sobreexpresión del mutante inactivo de la PKC-ε. La función mitocondrial se evalúa mediante el examen de la respiración, la integridad de la cadena respiratoria, actividades de complejos respiratorios y F ₀ F _1-ATPasa, la tasa de producción de ATP, y el contenido de ATP. La respiración es unssessed en digitonina-permeabilizadas POCT como el estado 3 (respiración máxima en presencia de exceso de sustratos y ADP) y las respiraciones no acoplados. Integridad de la cadena respiratoria se evaluó midiendo las actividades de los cuatro complejos de la cadena respiratoria en las mitocondrias aisladas. Capacidad de la fosforilación oxidativa se evalúa midiendo el potencial de membrana mitocondrial, la tasa de producción de ATP, y la actividad de F ₀ F _1-ATPasa. El estado de energía de POCT se evalúa mediante la determinación del contenido intracelular de ATP. Morfología mitocondrial en células vivas se visualizaron usando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente que se acumula específicamente en las mitocondrias, y las monocapas en vivo se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Viabilidad RPTC se evalúa utilizando anexina V / yoduro de propidio tinción seguido por citometría de flujo para determinar la apoptosis y oncosis.

Estos métodos permiten una activación selectiva / inhibición de las isoenzimas PKC individuopara evaluar su papel en las funciones celulares en una variedad de condiciones fisiológicas y patológicas que pueden ser reproducidos en in vitro.

Protocolo

1. El aislamiento de los túbulos renales proximales de cultivos primarios

1. Se anestesia el conejo, especial ambos riñones y colocarlos en una placa de Petri llena con tampón de preparación estéril (medio DMEM/F12) en una campana de flujo laminar.
2. Perfundir cada riñón con 50 ml de tampón de preparación seguido por 50 ml de agua estéril tamponada con fosfato salino, pH 7,4 (PBS), y PBS-hierro solución de óxido de (45 ml + 5 ml). De-capsulados riñones y transferirlos al búfer de preparación que contiene deferoxamina.
3. Cosecha de la corteza de cada riñón.
4. Homogeneizar el tejido usando un homogeneizador Dounce de 15 ml. Vierta el homogeneizado tamiz de malla de 2 estériles (85 m en la parte inferior y 235 micras en la parte superior) se coloca sobre un vaso de precipitados estéril L 1. Enjuague los tamices con deferoxamina que contiene buffer.
5. Recoger cualquier tejido remanente en el tamiz de 85 micras en un tubo de centrífuga cónico estéril llena con 35-40 ml de tampón que contiene deferoxamina. Mezclar suavemente la suspensión celular.
6. Coloque una fuerte mAgnet exterior del tubo para eliminar el hierro lleno de glomérulos y dejar que la suspensión se asiente. Aspirar el hierro del imán utilizando una pipeta Pasteur. Repita este proceso.
7. Preparar 1 ml de medio de digestión que contiene 2,400-2,500 unidades de colagenasa I y 0,6 mg de inhibidor de tripsina de soja disuelta en el tampón que contiene la deferoxamina. Filtrar a esterilizar el medio digestión.
8. Ajustar el volumen de la suspensión celular a 40 ml, y añadir 1 ml de medio de digestión. Incubar a temperatura ambiente durante 17 min mezclando suavemente la suspensión, centrifugar a 50 x g durante 2 min a 4 ° C, se aspira el medio, y añadir tampón de deferoxamina fresco.
9. Repetir el procedimiento de eliminación de hierro con el imán varias veces, girar la suspensión de nuevo, aspirar el medio, y añadir 46 ml de medio que no contiene glucosa.
10. Mezclar suavemente y medir 500 l de la suspensión en dos pesadas previamente tubos Eppendorf. Haga girar celdas hacia abajo a 10.000 xg durante 1 min, aspirar los medios de comunicación, y pesar el pellet. Calcular el rendimiento total de la masa húmeda y proteína.
11. Las células en placas estériles de 35 mm cultura platos a la densidad de la proteína de 1 mg / cápsula, utilizando la glucosa libre DMEM/F12 medio. Células de cultivo en 2 ml de glucosa en un medio libre de DMEM/F12 siempre en un agitador orbital en la incubadora a 37 ° C (95% de aire / 5% CO ₂₎ ^1,2.

2. Túbulo proximal renal cultivo celular

1. El medio de cultivo es una mezcla 50:50 de DMEM y Ham F-12 de mezcla de nutrientes sin rojo fenol, piruvato, y glucosa, suplementado con 15 mM NaHCO _3, 15 mM de HEPES, y 6 mM de lactato (pH 7,4, 295 mOsm / KGH ₂ O). Los medios se suplementan con L-ascórbico-2-fosfato (50 mM), insulina bovina (10 nM), transferrina humana (5 mg / ml), hidrocortisona (50 nM), y selenio (5 ng / ml) inmediatamente antes medios de cambio diario.
2. Aspirar los viejos medios de platos utilizando una técnica estéril. Añadir 2 ml de medio caliente, fresco a cada placa usando una técnica estéril. Renales células tubulares proximales (POCT) llegan a la confluencia en aproximadamente 5-6 días después de la siembra ^1,2.

3. Infección adenoviral de POCT

1. Infección adenoviral se lleva a cabo en cultivos confluentes, en reposo de POCT después del cambio de medio cada día. Dominante negativo PKC-ε mutante (dnPKC-ε) se construyó mediante la sustitución de: 1) lisina por arginina en la posición 436 del sitio de unión a ATP y 2) alanina con glutamato en la posición 159 del dominio pseudosustrato. Estas mutaciones destruyó la actividad del constructo de quinasa sin cambiar la conformación activa de la PKC-ε. ³ PKC-ε se hizo constitutivamente activa por deleción de los residuos 154-163 de su dominio pseudosustrato inhibidora. ⁴
2. Añadir la solución de reserva de adenovirus que porta caPKC-ε ADNc o ADNc dnPKC-ε a cada placa para obtener multiplicidad deseado de infección (MOI) que resulta en un incremento significativo en la PKC-& epsilen; niveles de proteína. Incubar POCT con adenovirus durante 24 horas. Cambio de medio y células de cultivo de otras 24 horas. Aumentado significativamente los niveles de fosforilados y total ε PKC-proteínas se pueden obtener utilizando 25-50 MOI de vector adenoviral codificante caPKC-ε. Mayores resultados MOI en incrementos aún mayores en los niveles de PKC-ε activo, pero no se recomienda en RPTC debido a la rápida muerte celular y la pérdida. Niveles significativamente aumentados de la inactiva PKC-ε proteína se puede obtener utilizando 50-100 MOI en POCT sin producir efectos adversos. ⁵
3. A las 48 h después de la infección, los medios de aspirado, se lavan las monocapas con PBS, y recoger las células para análisis de inmunotransferencia para determinar los niveles de proteína de la PKC-ε. ⁵

4. Medición de la respiración POCT

1. Preparar un tampón de ensayo para medir el estado 3 respiración (120 mM KCl, 5 mM KH ₂ PO _4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO _4, y 2 mM EGTA, pH 7,4). Para medir el complejo I-acoplado estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con 5 mM de glutamato, 5 mM malato y 0,1 digitonina mg / ml. Para el complejo II-coupled estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con succinato 10 mM, 0,1 mM rotenona, y 0,1 digitonina mg / ml. Para el complejo IV-coupled estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con ascorbato 1 mM, 1 mM de N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD), y 0,1 digitonina mg / ml. Coloque las soluciones en un baño de agua a 37 ° C.
2. Aspirar los medios de comunicación a partir de una placa de cultivo que contiene monocapa POCT, añadir 2 ml de un tampón de respiración estado caliente 3, raspar suavemente las células de la cápsula, utilizando una goma de policía, y transferir la suspensión a la cámara de consumo de oxígeno equipado con un electrodo de tipo Clark.
3. Medida de estado 2 respiración (en ausencia de ADP). Iniciar estado 3 respiración mediante la adición de ADP a una concentración final de 0,4 mM. Inicie el estado 4 respiración añadiendo oligomicina a una concentr definitivoción de 0,5 g / ml. Respiración desacoplada se mide mediante la adición de FCCP 0,5 M a las células que respiran en el estado 3. ^6,7
4. Recoger la suspensión celular de la cámara, precipitar la proteína usando ácido perclórico, y girar hacia abajo el precipitado. Determinar la concentración de proteínas en el pellet celular.

5. Análisis del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

1. Preparar 0,5 mM JC-1 en la solución de medio de cultivo estéril.
2. Añadir lentamente 20 l de solución de JC-1 a cada placa para obtener una concentración final de 5 mM. Agite el plato para mezclar el tinte a fondo. Devolver las placas en la estufa durante 30 min.
3. Ponga los platos en el hielo, los medios de aspirado y lavado monocapas dos veces con helado de PBS. Aspirar el PBS, añadir 1 ml de PBS fresco, raspar las células de la placa y transferir a un tubo Eppendorf. Romper monocapas en células individuales mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
4. Girar hacia abajo la suspensión a 1.000 xg durante 2 min, aspirate el sobrenadante, añadir 1 ml de PBS al sedimento y volver a suspender, para recibir una suspensión de células individuales. Repita este paso de nuevo si es necesario.
5. Girar las células hacia abajo a 1.000 xg durante 2 min, aspirar el sobrenadante, añadir 0,5 ml de PBS, y volver a suspender el sedimento. Analizar fluorescencia por citometría de flujo usando la excitación por un 488-nm láser de ion argón. Leer la emisión en dos canales separados, FL1 a 525 nm y FL2 a 590 nm. Potencial de membrana mitocondrial se expresa como FL2/FL1 proporción de fluorescencia. ⁶

6. Aislamiento de mitocondrias

1. Preparar tampones de aislamiento: tampón A (10 mM HEPES, 225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), tampón B (tampón A que contienen inhibidores de la proteasa, 1 mM Na ₃ VO _4, 1 mM NaF), y el Tampón C (10 mM HEPES, 395 mM de sacarosa, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Realice todos los pasos en el hielo.
2. Lávese las monocapas POCT dos veces con helado de PBS. Raspar monocapas en tubos Eppendorf y centrifugar losa 500 xg durante 5 min. Lavar el sedimento en 1 ml de tampón A.
3. Se resuspende el sedimento en 1 ml de tampón B, y transferir la suspensión a un homogeneizador de 2 ml Dounce.
4. Homogeneizar las células en el homogeneizador Dounce hasta que la mayoría de las células en el homogeneizado se rompen cuando inspeccionado bajo el microscopio.
5. Se centrifuga el homogeneizado a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y se lo hace girar hacia abajo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet crudo que contiene mitocondrias en 1 ml de tampón C. girar los sobrenadantes abajo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita el lavado del pellet dos veces más. ⁵
7. Para medir la actividad de los complejos respiratorios, volver a suspender el pellet en mitocondrial 50-100 l de tampón de ensayo y la congelación en nitrógeno líquido. Descongelar las muestras lentamente en hielo.

7. Medición de la actividad de NADH-ubiquinona oxidorreductasa (complejo I)

1. Prepare el tampón de ensayo: 10 mM KH ₂ PO _4, 5 mM MgCl _2, pH 7,2. Añadir ácido graso libre de BSA y NADH para obtener concentraciones finales de 0,25% y 0,25 mm, respectivamente. Añadir 2 l de solución de antimicina A (1 mg / ml) a una concentración final de 2 mg / ml.
2. Ejecutar las muestras en una placa transparente 48-y. Incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 500 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
3. Se inicia la reacción mediante la adición de 10 l de ubiquinona 3,25 mM a cada pocillo. Leer la absorbancia (340 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 5 l de solución de rotenona (1 mg / ml) a cada pocillo y la absorbancia durante 2 min. Cálculo de actividad del complejo I como la rotenona sensible a la oxidación de NADH. ⁷

8. Medición de la actividad de oxidorreductasa succinato-ubiquinona (complejo II)

1. Preparar el tampón de ensayo que contenía 0,25% de ácido graso libre BSA, 20 mM de succinato de potasio, 0,25 mM 2,6-dicloroindofenol, 2 g / ml de antimicina A, y 10 g / ml de rotenona.
2. Ejecutar las muestras por duplicado en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 500 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 2 min.
3. Se inicia la reacción mediante la adición de 10 l de ubiquinona 3,25 mM a cada pocillo. Leer la absorbancia (595 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Cálculo de la actividad del complejo II, siguiendo la reducción de 2,6-dicloroindofenol. ⁷

9. Medición de la actividad de ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa (complejo III)

1. Preparar el tampón de ensayo que contenía 0,1% de ácido graso libre de BSA, 80 mM de succinato de potasio, rotenona 10 g / ml, y 0,24 mM de potasio cianuro.
2. Ejecutar las muestraspor duplicado en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 291 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
3. Se inicia la reacción mediante la adición de 3 l de 6 mM oxidada del citocromo c a cada pocillo. Leer la absorbancia (550 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 5 l de solución antimicina A (1 mg / ml) a cada pocillo y la absorbancia durante 2 min. Cálculo de la actividad del complejo III como la antimicina A-sensible reducción del citocromo c. ⁷

10. Medición de la actividad de la citocromo oxidasa (complejo IV)

1. Preparar citocromo c reducido mediante la adición de ascorbato de sodio a la solución mM 9 de citocromo c y dializar la solución durante la noche a 4 ° C en 1 L de tampón fosfato (10 mM KH ₂ PO _4, pH 7,2) que contenía 5 mM de MgCl _2. Preparar el tampón de ensayo que contiene0,1% de ácido graso libre de BSA y antimicina A (2 ug / ml).
2. Ejecutar las muestras en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 233 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
3. Se inicia la reacción mediante la adición de citocromo c reducido (90 mM concentración final). Leer la absorbancia (550 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 2 l de solución de KCN (8 ug / ml) a cada pocillo y la absorbancia para otro min 2. Cálculo de la actividad del complejo IV como la oxidación KCN-sensible citocromo c. ⁷

11. Medición de la actividad de F ₀ F _1-ATPasa (ATP sintasa)

1. Preparar F ₀ F _1-ATPasa tampón de ensayo (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM de MgCl _2, pH 8,2). Vuelva a suspender el pellet en el mitocondrial tampón de ensayo, congelar las muestras mitocondriales en liquid nitrógeno y descongelar las muestras lentamente en hielo.
2. Ejecutar las muestras por triplicado en una placa transparente 48-y. Para cada grupo de tratamiento, 2 pozos se ejecuta para medir la actividad ATPasa total de (275 l de tampón de ensayo, 5 l de suspensión mitocondrial, y 5 l de 95% de etanol) y 1 pocillo para medir oligomicina insensible actividad ATPasa (275 l de el tampón de ensayo, 5 l de suspensión mitocondrial, y 5 l de 1 mg / ml de solución oligomicina en 95% de etanol).
3. Incubar las muestras a 31 º C durante 10 min con agitación constante. Añadir 16 l de 100 mM de solución de ATP (pH 7,0) y se incuba a 31 ° C durante 5 min con agitación constante.
4. Transferir 200 l de la mezcla de incubación a un tubo que contiene 50 l de 3 M TCA. Incubar las muestras en hielo durante 10 min y girar hacia abajo a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Use sobrenadantes y pellets para determinar fosfato y el contenido de proteína, respectivamente.
5. Determine el contenido de fosfato en los sobrenadantes utilizando elensayo de fosfato inorgánico. Preparar 100 ml de reactivo de Sumner mediante la adición de 0,88 g FeSO ₄ a 10 ml de 3,75 MH ₂ SO ₄ y ajustar a 90 ml con H ₂ O. Añadir 10 ml de solución de molibdato de amonio (0,66 g/10 ml de H ₂ O) a la solución _de FeSO4 en H ₂ SO _4. Proteger de la luz.
6. Carga placa de 96 pocillos con 50 l de cada estándar con fosfato (0 - 1.000 mM KH ₂ PO ₄₎ y 50 l de cada sobrenadante en los duplicados. Añadir 250 l de reactivo de Sumner a cada pocillo y se incuba la placa a 30 ° C durante 15 min con agitación constante.
7. Leer la absorbancia a 595 nm a temperatura ambiente. F ₀ F _1-ATPasa actividad se determina midiendo la oligomicina sensible a la liberación de P _i a partir de ATP como hemos descrito anteriormente. ^7,8 Calcular total y oligomicina insensibles F ₀ F _1-ATPasa actividades. Para calcular el oligomicina-ATPasa sensible actividad, restar oligomicina insensible a la actividad de la ATPasa total de ^8,9.

12. Medición del contenido intracelular de ATP

1. Coloque los platos de cultivo que contienen monocapas POCT en hielo, medio aspirado y se lavan las monocapas dos veces con tampón PBS frío hielo. Añadir 1 ml de PBS a cada monocapa, raspar cada monocapa en PBS, y recoger la suspensión de células en un tubo Eppendorf. Girar los tubos Eppendorf en la microcentrífuga durante 5 seg.
2. Determinar el contenido de ATP en cada muestra por el método POCT luciferasa usando el ATP bioluminiscencia Kit de ensayo de HS II (Roche) y el protocolo del fabricante. Determinar la concentración de proteína en cada muestra y se calcula la concentración de ATP por mg de proteína. ⁸

13. Observación de morfología mitocondrial

1. Cambie medios de cultivo. Añadir 2 l de solución de 100 mM de MitoTracker Red 580 a cada placa (conc. final. 100 nM) y devolver los platos a la incubator durante 30 min.
2. Examine las monocapas en vivo bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de inmersión en agua. ⁵

14. Análisis de la viabilidad celular

1. A las 24 h antes de comenzar el ensayo de preparar una solución de 50 mM de cisplatino para el tratamiento de las células que servirán como control positivo para la apoptosis (anexina V de células positivas). Además, preparar una solución 500 mM de terc-butilo para tratar las células que sirven como controles positivos para oncosis (propidio positivos con yoduro de células).
2. Tratar 2 platos con 2 l de cisplatino 50 mM y 2 platos con 2 l de 500 mM de terc-butilo. Dedicar un plato para un control sin mancha.
3. A las 24 h después del tratamiento con cisplatino y TBHP, preparar el tampón de unión (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl _2, 1,8 mM CaCl ₂₎ y una solución de yoduro de propidio (PI) (50 ug / ml) en el tampón de unión.
4. Lávese las monocapas de una vez con la ventaja de la unióner. Añadir 1 ml de tampón enfriado con hielo y 50 l de solución de PI para cada plato, excepto para los no-tinción de anexina V y de células positivas. Cubrir los platos y se incuba en hielo durante 15 min con agitación orbital suave.
5. Lavar las monocapas con el tampón de unión (10 min) y se añade 1 ml del tampón de unión y 2 l de anexina V-FITC solución a cada placa, excepto para las células no-manchas y PI-positivo. Cubrir los platos y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min con agitación orbital suave.
6. Aspirar el tampón y se lavan las monocapas con 1 ml del tampón de unión enfriado con hielo en hielo durante 10 min con agitación orbital suave. Repetir el paso de lavado.
7. Aspirar el tampón de unión y añadir 500 l de tampón de unión a cada plato. Raspar suavemente las células utilizando una goma de policía y transferir las células a tubos de citometría de flujo. Dispersar las células en una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo de las muestras. Romper las agrupaciones de células.
8. Cuantificar PI y anexina V-FITC fluorescencia inmediatamente por flow usando citometría de excitación a 488 nm y emisión a 590 y 530 nm para FITC y PI, respectivamente. Cuente 10.000 eventos en cada muestra.
9. Ponga la fluorescencia FITC en el eje X y la fluorescencia PI en el eje Y de las figuras de citometría de flujo gráfico de puntos. Las células positivas para anexina V y negativas para PI se consideran apoptótica. Las células positivas para el PI y negativa para anexina V se consideran oncótica ^10,11.

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Resultados

La Figura 1 muestra que la entrega adenoviral de ADNc que codifica los constitutivamente activos (caPKC-ε) e inactiva (dnPKC-ε) mutantes de resultados PKC-ε en los niveles de proteína significativamente mayores de PKC-ε en POCT y en las mitocondrias. Las células infectadas con el vector de ADNc que lleva caPKC-ε sobreexpresa el fosforilada (activa) forma de PKC-ε mientras que las células infectadas con el ADNc que codifica dnPKC-ε overexpressed PKC-ε que era inactivo (no fosforilado) ...

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Discusión

El enfoque aquí presentado permite la sobreexpresión de isoenzimas individuales de la PKC en el cultivo primario de las células tubulares renales proximales. Hay varias ventajas de este enfoque: 1. Permite la investigación de los mecanismos de regulación en una población homogénea de células (células tubulares renales proximales) que son el objetivo principal de diversos insultos (isquemia, hipoxia, estrés oxidativo), drogas y nephrotoxicants dentro del riñón. 2. Funciones mitocondriales en este mod...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Campana de flujo laminar	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 ml y 15 ml Dounce molinillo de tejido	WHEATON	989-24607, 357544
85 y 235 micras de malla de nylon	Piezas pequeñas	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 ml tubo de centrífuga estéril	Biologix	BCT-P 50BS
1,5 ml micro tubo	Sarstedt	72.690.001
35 x 10 mm platos de cultivo estériles	Corning	430165
Jouan Centrífugas	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotores: Jouan T40
Ajustable micro-centrífuga	SIGMA	Modelo 1 a 15
Monitor de Oxígeno Biológico	YSI Incorporated	YSI Modelo 5300A
Monocameral Micro sistema de oxígeno	YSI Incorporated	5356S
La sonda de oxígeno	YSI Incorporated	5331A
Baño Recirculador	YSI Incorporated	5310
KCl y Kit de membrana estándar	YSI Incorporated	5775
Agitador magnético	YSI Incorporated	5222
Grabadora de cama plana	Kipp & Zonen	BD 11E
48-y 96-y placas transparentes	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Eppendorf	5355 21919
Agitador orbital MaxQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
FLUOR Spectra Plus (absorbancia / fluorescencia / luminiscencia lector)	Tecan	F129005
Con camisa de agua EE.UU. Autoflow automática incubadora de CO 2	Nuaire	NU 4850
12x75 mm de poliestireno tubos de cultivo de ensayo de citometría de flujo	Marca Fisher	14-961-20
Axioskop Objetivo de inmersión en agua 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99-830 - PB
DMEM / Ham F12	Sigma	D 2906 - 1L
Deferoxamina mesilato	Hospira	D110
Colagenasa de tipo I	Worthington	4196
Inhibidor de tripsina	Sigma	T 6522 - 500mg
5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Red	Invitrogen	M22425
ATP bioluminiscencia Kit de ensayo HS II	Roche	11 699 709 001
Anexina V - FITC	BioVision	1001 - 200
Citómetro de flujo	BD Biosciences	BD FACSCalibur