Síntesis de nanoemulsiones de cambio de fase con distribuciones de tamaño estrechas para la vaporización Droplet acústica y Bubble mejorada ablación por ultrasonidos mediada

Resumen

Cambio de fase (nanoemulsiones PSNE) puede ser vaporizado mediante ultrasonidos focalizados de alta intensidad para mejorar la calefacción localizada y mejorar la ablación térmica en los tumores. En este informe, la preparación de PSNE estable con una distribución de tamaño estrecha se describe. Además, el impacto de PSNE vaporizado en ablación por ultrasonidos mediada se demuestra en fantasmas que imitan tejidos.

Resumen

Ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU) se utiliza clínicamente para seccionan térmicamente los tumores. Para mejorar el calentamiento localizado y mejorar la ablación térmica de tumores, lípidos recubiertos con gotitas de perfluorocarbono se han desarrollado que puede ser vaporizado por HIFU. La vasculatura en muchos tumores es anormalmente permeable debido a su rápido crecimiento, y las nanopartículas son capaces de penetrar las fenestraciones y por pasiva se acumulan en los tumores. Por lo tanto, el control del tamaño de las gotitas puede resultar en una mejor acumulación dentro de los tumores. En este informe, la preparación de gotitas estables en una nanoemulsión de cambio de fase (PSNE) con una distribución de tamaño estrecha se describe. PSNE fueron sintetizados por sonicación de una solución de lípidos en presencia de perfluorocarbono líquido. Una distribución de tamaño estrecha se obtiene por extrusión de las veces PSNE múltiples utilizando filtros con tamaños de poro de 100 o 200 nm. La distribución del tamaño se midió durante un período de 7 días usando dispersión de luz dinámica. Polyachidrogeles que contienen rylamide PSNE se prepararon para los experimentos in vitro. Gotitas PSNE en los hidrogeles se vaporiza con ultrasonido y las burbujas resultantes mejoradas calentamiento localizado. Vaporizado PSNE permite un calentamiento más rápido y también reduce la intensidad de ultrasonido necesario para la ablación térmica. Así, PSNE se espera mejorar la ablación térmica de tumores, potencialmente mejorar los resultados terapéuticos de HIFU mediadas por tratamientos de ablación térmica.

Protocolo

1. Preparación de Nanoemulsión Phase-shift (PSNE)

1. Disolver 11 mg de DPPC y 1,68 mg de DSPE-PEG2000 en cloroformo
2. Se evapora el disolvente orgánico para formar una película seca de lípido en un vaso matraz de fondo redondo
3. Desecar la película lipídica durante la noche
4. Rehidratar la película lipídica con 5,5 ml de salina tamponada con fosfato (PBS)
5. Solución Calentar en un baño de agua de 45 ° C hasta que se disuelve película lipídica, agitando periódicamente
6. Transfiera la solución de lípidos en el vial de 7 ml
7. Sonicar solución de lípidos durante 2 min a 20% de la amplitud
8. Divida la solución en dos viales de 2,5 ml cada una (descartar restante 0,5 ml)
9. Añadir 2,5 ml de PBS a cada vial
10. Colocar el vial en un 0 ° C baño de agua helada
11. Añadir 50 DDFP l a cada vial
12. Sonicar cada vial en el baño de hielo-agua usando la siguiente configuración: 25% de la amplitud, el modo pulsado (10 segundos encendido, apagado 50 seg), 60 seg en total de tiempo
13. Transfer PSNE soluciones a viales de centelleo de 20 ml
14. Añadir 5 ml de PBS a cada vial, lo que resulta en 10 ml de volumen final,
15. Ensamble direcciones extrusora establecidos por el fabricante
    1. Enjuague cada parte con agua desionizada
    2. Coloque el disco de soporte de acero inoxidable en el centro de la base de soporte de filtro
    3. Coloque la malla de acero inoxidable en la parte superior del disco de soporte de acero inoxidable
    4. Utilizando pinzas, coloque un drenaje extrusora membrana disco (el lado brillante hacia arriba) en la malla de acero inoxidable
    5. Usando pinzas, colocar el filtro extrusora (hasta el lado brillante) en la membrana del disco de drenaje
    6. Coloque con cuidado la pequeña junta tórica en el filtro y coloque la parte superior del extrusor thermobarrel y por encima de la base de apoyo
    7. Apriete parcialmente cada tuerca de mariposa, luego apriete completamente las tuercas de alas a mano de forma alterna
    8. Conectar la extrusora auna línea de gas nitrógeno
    9. Para cebar la extrusora, una pipeta 10 ml de agua desionizada en el puerto de muestreo superior, tapar la abertura y apriete la válvula de ventilación
    10. Lentamente abrir la línea de gas nitrógeno para aumentar la presión, forzando a la muestra a través de las membranas, y recoger la muestra de la tubería de salida
    11. Después de su uso, desmonte en orden inverso, enjuague las piezas de extrusión con agua desionizada, y deseche el filtro de membrana y el disco de membrana de drenaje
16. Por 100 nm sólo gotas, pre-condición PSNE por extrusión de 10 veces a través de 200 nm filtro
17. Extrusión PSNE 16 veces a través de 100 nm o 200 nm filtro para obtener la distribución de tamaño estrecha

2. Preparación de hidrogel de poliacrilamida que contiene PSNE

1. Preparar 24% de solución de BSA por dilución de 1,2 g de BSA en polvo en 5 ml de agua desionizada
2. Preparar solución al 10% diluida por APS polvo 0,1 g de APS en 1 ml desionizada water
3. En el siguiente orden, mezclar 2,1 ml solución de acrilamida, 1,2 ml de tampón Tris, 0,1 ml de APS 10%, 4,5 ml 24% de solución de BSA, y 3,6 ml de agua desionizada en la cámara de plástico
4. Calentar a 40 ° C y se coloca bajo vacío durante 1 hr
5. Añadir 480 l de PSNE y mezcle girando suavemente la cámara de plástico.
6. Añadir 12 l de TEMED y colocar la cámara en un baño de agua 12 ° C durante 2 hr

3. Los resultados representativos

Un esquema de la instalación para los experimentos de ultrasonido con fantasmas de hidrogel que imitan el tejido se muestra en la figura 1. Este protocolo da como resultado gotitas de perfluorocarbono lípidos recubiertos con una estrecha distribución de tamaño que son estables en solución durante al menos una semana. La distribución del tamaño medido con dispersión de luz dinámica (partículas 90Plus Analizador de Tamaño, Instrumentos Brookhaven, Holtsville, NY) se muestra en la Figura 2 para PSNE extruyó usando 100 y 200filtros nm. El diámetro PSNE eficaz en el tiempo, medido mediante dispersión dinámica de luz, se enumeran en la Tabla 1, lo que demuestra que PSNE son estables por lo menos durante una semana. Modo B de PSNE antes y después de la vaporización en un hidrogel de poliacrilamida se muestran en la Figura 3. También, una lesión formada por 15 seg de HIFU mediada por calentamiento en un hidrogel de poliacrilamida que contiene albúmina y PSNE se muestra en la Figura 4. La forma asimétrica de la lesión es el resultado de calefacción prefocal que se produce debido a la presencia de la nube de burbujas en la trayectoria de ultrasonido. Es importante tener en cuenta que el calentamiento prefocal y formación de la lesión debido a la dispersión de burbujas puede minimizarse mediante la reducción de la potencia acústica transmitida.

Figura 1. Esquema del montaje experimental para experimentos con tejido de ultrasonido-mimIcking hidrogeles.

Figura 2. Distribución de tallas de PSNE extruido a través de 100 nm o 200 nm filtros, medida mediante dispersión de luz dinámica. Las unidades de los ejes de ordenadas se basan en la intensidad de la luz dispersada de partículas de un tamaño determinado con respecto a la intensidad total de la luz dispersada por la muestra.

Figura 3. Modo B (a) antes y después (b) vaporización PSNE en un hidrogel de poliacrilamida. La flecha indica la región central donde se formó una nube de burbujas por vaporización PSNE.

Figura 4. Imágenes de polyacrilamida hidrogel que contiene albúmina y PSNE (a) antes y después (b) vaporización y sonicación con HIFU, lo que demuestra la formación de lesiones como resultado de la ecografía inducida por calentamiento. La frecuencia central ultrasonido fue de 3,3 MHz. La señal de ultrasonido inicial consistió en un ciclo de 30-, 6,4 W pulso para vaporizar PSNE, inmediatamente seguido de 15 segundos de ultrasonido continuo a 0,77 W.

Días después de la extrusión	Extruido con filtro de 200 nm		Extruido con 100 nm filtro
	La media de Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)	La media de Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)
1	182,9	4,9	118,0	0,9
7	177,7	2,5	124,8	3,1

Tabla 1. El diámetro medio y la desviación estándar de PSNE en uno y siete días después de la extrusión con 100 nm y 200 nm filtros.

Discusión

Ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU) se utiliza clínicamente para ablación térmica de tumores. ¹ Para mejorar el calentamiento localizado y mejorar la ablación térmica de tumores, lípidos recubiertos con gotitas de perfluorocarbono se han desarrollado que puede ser vaporizado por HIFU. La vasculatura en muchos tumores es anormalmente permeable debido a su rápido crecimiento. ² Por lo tanto, las nanopartículas son capaces de penetrar en las fenestraciones y una acumulación pasiva ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre común	Fabricante	Cat. Número	Nombre completo / Descripción
DPPC	Avanti Lípidos, Alabaster, AL, USA	850355P	1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DSPE-PEG2000	Avanti Lípidos, Alabaster, AL, USA	880120P	1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietilenglicol) -2000] (sal de amonio)
DDFP	Fluoromed, Round Rock, TX, EE.UU.	CAS: 138495-42-8	Dodecafluoropentano (C 5 F 12)
PBS	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	P2194	Salina tamponada con fosfato
Cloroformo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.	372978	Cloroformo
La acrilamida	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	A9926	40% 19:1 acrilamida / bis-acrilamida
Tampón Tris	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	T2694	1 M, pH 8, hidrocloruro de Trizma y de base Trizma
BSA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	A3059	Albúmina de suero bovino
APS	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	A3678	Solución de persulfato de amonio
TEMED	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.	87689	N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina
			Equipo
Sonicator (3 punta mm)	Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, EE.UU.	Vibra-Cell
Baño de agua	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.	Neslab EX-7
Extrusora	Los lípidos del Norte, Burnaby, BC, Canadá	LIPEX
Extrusora Filtros	Whatman, Piscataway, NJ, EE.UU.	Nuclepore # 110605 y # 110606
Extrusora drenaje Disc	Sterlitech Corporation, Kent, WA, EE.UU.	# PETEDD25100
Cámara de plástico	EE.UU. Plastic Corporation, Lima, OH, EE.UU.	# 55288, 1 3/16 "x 1 3/16" x 2 7/16 "