Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Resumen

Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido utilizando Streptococcus sanguinis Como un organismo modelo. Este método se logra a través de PCR recombinante de alto rendimiento y transformaciones.

Resumen

Mutagénesis de transposones y deleción de un solo gen son dos métodos aplicados en knockout de genes en todo el genoma en ^1,2 bacterias. Aunque mutagénesis de transposones consume menos tiempo, menos costoso, y no requiere la información completa del genoma, hay dos puntos débiles en este método: (1) la posibilidad de una mutantes dispares en la biblioteca mixta mutante que contra-selecciona mutantes con competencia disminuido; y (2) la posibilidad de la inactivación parcial del gen mediante el cual los genes no totalmente perder su función después de la inserción de un transposón. De un solo gen análisis de deleción puede compensar los inconvenientes asociados con la mutagénesis de transposones. Para mejorar la eficiencia de todo el genoma deleción del gen individual, tratamos de establecer una técnica de alto rendimiento para todo el genoma deleción del gen único usando Streptococcus sanguinis como organismo modelo. Cada supresión construcción génica en S. sanguinis genoma está diseñado para comprender 1-Kb aguas arriba del gen diana, el gen aphA-3, proteína que codifica resistencia a la kanamicina, y 1-kb aguas abajo del gen diana. Tres conjuntos de cebadores F1/R1, F2/R2, y F3/R3, respectivamente, se diseñaron y sintetizaron en un formato de placa de 96 pocillos para PCR-amplificaciones de los tres componentes de cada construcción de deleción. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias que son complementarias a las regiones del gen aphA-3 en su extremo 5 '. A gran escala amplificación por PCR del gen aphA-3 se realiza una vez para crear todas las construcciones de deleción de un solo gen. El promotor del gen aphA-3 está inicialmente excluidos para minimizar el potencial efecto polar de casete de kanamicina. Para crear las construcciones de deleción de genes, de alto rendimiento de la amplificación por PCR y la purificación se realizan en un formato de placa de 96 pocillos. Un amplicón de PCR recombinante lineal para cada gen de supresión se hace a través de cuatro reacciones de PCR de alta fidelidad utilizando ADN polimerasa. El expon inicialfase de crecimiento preferencial de S. sanguinis cultivadas en caldo Todd Hewitt suplementado con 2,5% de suero de caballo inactivado se utiliza para aumentar la competencia para la transformación de la PCR recombinante construcciones. Bajo esta condición, hasta el 20% de S. células sanguinis se puede transformar usando ~ 50 ng de ADN. Sobre la base de este enfoque, 2048 mutantes con deleción de un solo gen se obtuvieron en última instancia de los 2.270 genes en S. sanguinis excluyendo cuatro ORFs de genes contenida enteramente dentro de otros ORFs en S. sanguinis SK36 y 218 genes esenciales potenciales. La técnica en la creación de construcciones de genes de deleción es de alto rendimiento y podría ser fácil de usar en todo el genoma deleciones de genes individuales para cualquier bacteria transformables.

Protocolo

1. Primer Diseño

1. Los cebadores se diseñan utilizando en los guiones de las casas basado en el S. sanguinis SK36 secuencia del genoma. Tres conjuntos de cebadores, F1/R1, F2/R2, y F3/R3 están diseñados para la amplificación de la 1-kb secuencia arriba del gen diana, la aphA-3 gen que codifica la resistencia a la kanamicina (Km ^r) proteína ³ y 1 el -kb aguas abajo secuencia del gen diana, respectivamente (Figura 1). Entre estos cebadores, F1 y R3 están diseñados usando ePrimer3 en la suite de programas de EMBOSS ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) para amplificar las regiones flanqueantes aguas arriba o aguas abajo de la diana gen. Cebadores específicos de genes, R1 y F3, se han diseñado basándose en el 5 'y 3' secuencias del gen diana. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias de adaptador en su extremo 5 'que son complementarias a la aphA-3gen. Las temperaturas de fusión de cada cebador fueron diseñados para ser lo más cercano posible a 60 ° C para permitir el uso de una temperatura de recocido uniforme para todas las reacciones de PCR en 96-y formato.
2. F1, R1, R3 F3 y cebadores se sintetizan en placas de 96 pocillos con base en una orden de genes. Cada placa contiene un tipo de cebadores en el orden mismo gen. Diluir los cebadores en 96-y la placa de cebador de trabajo a una concentración final de 10 mM para la amplificación por PCR utilizando una pipeta multicanal.

2. De alto rendimiento PCR amplificación y purificación

1. Para alto rendimiento amplificar 1-kb aguas arriba o aguas abajo de la diana S. genes sanguinis, montar una mezcla de cóctel PCR en hielo en un tubo cónico de 15-ml que contiene 1640 l ddH ₂ O, 250 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 l de 10 mM de mezcla dNTP, 100 l de 50 mM MgSO _4, 100 l de 10 ng / l S. sanguinis SK36 de ADN genómico y 10 l Platinum Taq ADN polymerase alta fidelidad y la transferencia de 23 l de la mezcla en cada pocillo en placas de 96 pocillos PCR usando una pipeta multicanal. Transferir 1 l de cada F1 y R1 (o F3 y R3) a partir de los 10 mM de trabajo placas de cebadores para la placa de PCR usando una pipeta multicanal. Sellar la placa de PCR y realizar la amplificación a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1,5 min.
2. Preparar un 1% en gel de agarosa que contengan bromuro de etidio con 48 pozos de ajuste de carga pipeta multicanal. Mezclar 4 l producto de PCR con 1 l de tampón de carga 5xDNA en placa de 96 pocillos y cargar las muestras en un gel de agarosa utilizando una pipeta multicanal 10-l. Ejecutar la electroforesis a 135 V durante 30 min. Examine la banda en el gel bajo UVP documentación y sistema de análisis.
3. Purificar los productos de PCR por PureLink 96 kit de purificación de PCR usando centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eluir el ADN, añadir 40 l estéril ddH ₂ O para el bienestar de la bncontrar plato.
4. Escoger al azar varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN utilizando espectrofotómetro NanoDrop. Ajustar la concentración de los amplicones en la placa a ~ 10 ng / ul.
5. Un plásmido que contiene kilometros casete ^r es digerido usando EcoR I como molde de PCR. El plásmido digerido se purificó por kit de purificación de PCR QIAquick y el ADN del plásmido lineal se ajusta a la concentración de ADN final de 10 ng / ul. Ensamble mezcla 25 l para amplicón kilometros casete ^r incluyendo 16.4 l O ddH _2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO _4, 1 l de 10 mM F2, 1 l de 10 mM R2, 1 l de ADN plásmido lineal y 0,1 l de platino Taq ADN polimerasa de alta fidelidad. Realizar la amplificación de PCR a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1 min. Examine el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Poola mayor parte de la amplificación de casete de 10 kilometros ^r individuo PCR purificado con el kit de purificación de PCR QIAquick. Ajustar la concentración de amplicón a 10 ng / ul.
6. Para obtener la última lineal amplicón PCR recombinante, tres amplicones de PCR se combinan con cada l 1 (en cantidades casi iguales-molar) en una placa de PCR así como la plantilla para la PCR. Otros componentes de la PCR se añade incluyendo 14.4 l O ddH _2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO _4, 1 l de 10 mM F1, 1 l de 10 R3 mu M, 0,1 l Platinum Taq DNA polimerasa de alta fidelidad. Amplificación por PCR se realizó a 94 º C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min.
7. Examinar los amplicones de PCR en gel de agarosa. Purificar y cuantificar los amplicones de la PCR como se describe anteriormente. Congelar los recombinados amplicones de la PCR a -20 ° C.

3. ComCélulas Preparación competente

1. Caldo Todd Hewitt se preparó, pH ajustado a 7,6 con NaOH 10 N, se calienta a ebullición y después se enfrió a temperatura ambiente y se esterilizó usando poliestireno 0,22 micras filtro ^4. Añadir 300 l caballo inactivado por calor suero (concentración final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt en 15-ml tubo cónico para compensar TH + HS medio. TH alícuota + HS medio a 2 ml y 10 ml en tubos.
2. Inocular 5 l de existencias S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C en 2 ml de medio de TH + HS e incubar el cultivo durante la noche con tapado herméticamente a 37 º C, acompañada de pre-incubación de la 10 ml-TH + tubo HS.
3. Después de toda la noche, transferir 50 cultura l en 10 ml TH + HS y se incuba el tubo a 37 º C durante 3 h (correspondiente a OD ₆₆₀ de 0.07 hasta 0.08), de usar inmediatamente para la transformación.

4. Celular Transformación y selección de antibióticos

1. Añadir 2 l de 70 ng S. sanguinis SK36 competenciatencia péptido estimulante (CSP) y 2 l lineal de amplificación de PCR recombinante (~ 50 ng) a tubos Eppendorf de 96 pocillos bloque y los pre-calentamiento a 37 º C. Transferir 330 l de 3 hr-incubado SK36 cultura en cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. Reemplazar con ADN estéril O ddH ₂ como control.
2. Colocar el bloque de hielo y se extendió en 100 l de cada transformación en infusión de cerebro corazón (BHI) placa de agar con 500 mg / ml de kanamicina. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 días bajo condiciones microaeróbicas.

5. Confirmación mutante y almacenamiento

1. Para cada mutante de reemplazo, escoger al azar hasta 2 colonias individuales, inocular la colonia en 5 ml de BHI que contenía 500 ug / ml de kanamicina y se incuba el inóculo microaerobically durante la noche a 37 ° C. Criopreservar cada cultivo en 30% de glicerol a -80 ° C
2. Para examinar si el mutante que contiene el reemplazo de genes de esperar, realizar la PCR de colonias para cada mutante utilizando F1 y R3cebadores en placas de 96 pocillos PCR. Acerca de 1-l cultivo de una noche de colonia individual se utiliza como el molde de ADN en 25-l PCR-amplificación de la reacción. PCR se realizó a 94 º C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min.
3. Para identificar con precisión doble banda mutantes o contaminante amplificación PCR, examine la amplificación de PCR mediante electroforesis durante 4 horas a> 12 cm de largo 2% en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio. Bajo esta condición, la electroforesis en gel de agarosa, los amplicones con ≥ 100 pb se diferencia claramente identificados. Cuando las bandas resultantes de la amplificación de la casete ^r kilometros y el gen de tipo salvaje se prevé que difieren en <100 pb, se utiliza un cebador T1 interna para determinar si un gen de tipo salvaje puede ser detectada por PCR.
4. Para confirmar aún más la eliminación, los amplicones se purificó por PureLink 96 kit de purificación de PCR y se secuenciaron usando el cebador P1 cualse une a la casete ^r kilometros. Mantener sólo mutantes correctos confirmados por secuenciación.

Resultados

Después de la amplificación por PCR usando los cebadores F1 y R1, R3 y F3 y, aproximadamente 1-kb aguas arriba y aguas abajo de cada S. sanguinis gen se obtuvieron en formato de 96-pocillos, respectivamente (Figura 2A). Bajo nuestras condiciones de PCR y usando cebadores diseñados, un producto específico se amplificó a partir de S. sanguinis de ADN genómico en cada reacción de PCR. Este resultado indica los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de S. sangu...

Discusión

Para minimizar los posibles efectos polares de la sustitución de un gen diana con el gen exógeno antibióticos en los genes vecinos, dos pasos se toman mientras imprimación inicial de diseñar. Para la mayoría de los genes suprimidos, la cebadores R1 y F3 están diseñadas para eliminar la región de codificación de 6 pb después del codón de inicio a 30 pb antes del codón de parada. Los últimos 30 pares de bases se mantienen para proteger potencial sitio de unión ribosómica utilizado por el gen corriente abaj...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer F2	Integrated DNA Tecnologías	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	Ibid	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2P	Ibid	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	Ibid	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	Ibid	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Cebador 5 'end_R1_seq	Ibid	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Cebador 5 'end_F3_seq	Ibid	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Cebador 5 'end_R1p_seq	Ibid	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Secuencia: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
ADN polimerasa	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad
EcoRI	New England Biolabs Inc	Enzima de restricción
Agar	Bioanalytical americano	AB01185
Agarosa	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Infusión de cerebro y corazón
El suero de caballo	Fisher Scientific	SH3007403	El suero de caballo
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamicina
TH caldo	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt caldo
96 PureLink	Invitrogen	K310096	PureLink 96 kit de purificación de PCR
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR purification kit
Filtro	Corning	431117	0,22 micras filtro de poliestireno
Sistema Anoxomat	Mart Microbiología bv	Anoxomat Mark II
Centrífuga de sobremesa	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus rotor para microplacas
Gel Documentación	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubadora	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet de Gel XL	Labnet	E0160	Labnet de Gel XL
Microcentrífuga	Eppendorf	22621408	Microcentrífuga 5415 R
Pipetas multicanal	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR system 9700