La identificación de los compuestos volátiles olfativas utilizando cromatografía de gases-de varias unidades Grabaciones (GCMR) en el lóbulo antenal insectos

Resumen

Señales olfativas mediar muchas conductas diferentes en los insectos, y son a menudo mezclas complejas compuestas de decenas a cientos de compuestos volátiles. Utilizando cromatografía de gases con la grabación de múltiples canales en el lóbulo antenal de insectos, se describe un método para la identificación de compuestos bioactivos.

Resumen

Todos los organismos viven en un mundo lleno de estímulos sensoriales que determinan su respuesta fisiológica y conductual a su entorno. El olfato es especialmente importante en los insectos, que utilizan sus sistemas olfativos para responder y discriminar estímulos entre, olor complejos. Estos olores provocan comportamientos que intervienen en procesos como la reproducción y selección de hábitat ^1-3. Además, los sensores químicos de media en los comportamientos de los insectos que son muy importantes para la agricultura y la salud humana, incluida la polinización ^4-6, herbivoría de ⁷ cultivos alimentarios, y la transmisión de la enfermedad ^8,9. Identificación de las señales olfativas y su papel en el comportamiento de los insectos tanto, es importante para la comprensión de los procesos ecológicos y los recursos humanos de alimentos y el bienestar.

Hasta la fecha, la identificación de las sustancias volátiles que impulsan el comportamiento de insectos ha sido a menudo difícil y tedioso. Las técnicas actuales incluyencromatografía de gases acoplada grabación electroantenograma (GC-EAG) y cromatografía de gases acoplada a un solo grabaciones sensillum (GC-SSR) ^10-12. Estas técnicas ha demostrado ser esencial en la identificación de compuestos bioactivos. Hemos desarrollado un método que utiliza la cromatografía de gases acoplada a varios canales registros electrofisiológicos (denominados 'GCMR') de las neuronas en el lóbulo antenal (AL; del insecto centro olfatorio primario) ^13,14. Esta técnica del estado de la técnica nos permite investigar cómo la información olor se representa en el cerebro de los insectos. Además, debido a las respuestas neurales a los olores de este nivel de procesamiento olfativo son muy sensibles debido al grado de convergencia de las neuronas de la antena del receptor en neuronas AL, AL grabaciones permitirá la detección de los componentes activos de los olores naturales de manera eficiente y con alta sensibilidad. Aquí describimos GCMR y dar un ejemplo de su uso.

Varios pasos generales son INVOLved en la detección de compuestos volátiles bioactivos y la respuesta del insecto. Los volátiles primero necesitan ser recogidos de fuentes de interés (en este ejemplo utilizamos flores del género Mimulus (Phyrmaceae)) y se caracteriza como sea necesario, utilizando estándares de GC-MS técnicas de ^14-16. Los insectos se preparan para su estudio mediante una disección mínima, después de lo cual un electrodo de registro se inserta en el lóbulo antenal y multi-canal de grabación neural comienza. El procesamiento posterior de los datos neurales entonces revela que odorantes particulares provocar importantes respuestas neuronales en el sistema nervioso de los insectos.

Aunque el ejemplo que aquí presentamos es específico para los estudios de polinización, GCMR puede ampliarse a una amplia gama de organismos del estudio y fuentes volátiles. Por ejemplo, este método puede ser utilizado en la identificación de los odorantes atraer o repeler los insectos vectores y plagas de los cultivos. Además, GCMR también se puede utilizar para identificar atrayentes para los insectos beneficiosos, tales como pollinators. La técnica puede ampliarse para no insectos sujetos también.

Protocolo

1. Follection volátil

1. En este ejemplo, utilizamos muestras volátiles de M. lewisii flores - un nativo de flores silvestres alpinas a California. Los volátiles se recogen utilizando métodos dinámicos sorción según Riffell et al. ^14. Brevemente, este método emplea un sistema de circuito cerrado de captura donde las flores están encerrados en una bolsa de teflón. Uso de una bomba de vacío inerte, el aire alrededor de las flores es aspirado a través de una "trampa", compuesto de una pipeta Pasteur llena de Porapak Q de la matriz. El aire de retorno desde la bomba es filtrado por carbón activado. Después de un periodo de tiempo prescrito, que en nuestro caso 24 h, la Porapak Q de la matriz se eluyó con un disolvente no polar, típicamente hexano, para recoger el extracto concentrado. El extracto se almacena entonces en -80 ° C hasta su análisis. Si es necesario, las muestras pueden ser concentradas antes del análisis bajo una corriente de gas nitrógeno. A menos que la muestra ya está bien caracterizada, ejecutar una parte alícuota de la misma a través de uncromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) para identificar los componentes volátiles antes de usar la muestra.

2. Preparación electrofisiológico

1. Cortar aproximadamente 1 cm desde el extremo de una punta de pipeta de 1.000 l. Colocar un abejorro (Bombus impatiens) en la base de la punta de la pipeta y empuje suavemente hacia el extremo opuesto de la punta hasta que sólo la cabeza está expuesta.
2. Derretir la cera dental y moldearla alrededor de la cabeza expuesta, asegurándose de que las adhiere cera sobre los ojos compuestos para la seguridad y para hacer la cabeza de la abeja completamente inmóvil. Asegúrese de que no hay nada cera en la antena de la abeja.
3. Una vez que la cabeza está seguro, haga un cuadrado, ventana-como, incisión en la cápsula de la cabeza con una hoja de afeitar automático o el tamaño adecuado bisturí para cortar la cutícula. Uso de la cuchilla del interruptor, comenzando por la parte dorsal de la cápsula de la cabeza, inmediatamente detrás de la antena y adyacente a uno de los ojos compuestos. Cortaruna línea recta, desde el ojo compuesto de uno al ojo contralateral compuesto. Después de cortar una línea recta para el ojo compuesto contrario, comenzar a hacer una incisión dorsal hasta las curvas de altura de cápsula y termina cerca de su tórax. En este punto, comienzan a cortar hacia el extremo opuesto de la cápsula de la cabeza. Por último, una vez que una línea ha sido cortada en el extremo opuesto, cortar una línea de vuelta a la posición inicial de la incisión inicial. Es importante eliminar la cutícula que es adyacente a la antena, ya que esto impedirá la inserción del electrodo.
4. Una vez que la cutícula se corta, utilizar un par de fórceps para extraer la cutícula abeja, que luego debe exponer cerebro de la abeja y, más importante, los lóbulos antenales. Inmediatamente comience superfusión el cerebro con solución salina insecto, de modo que el cerebro no se convierta en desecado. Después de que el cerebro está expuesto, cuidadosamente utilizar un par de pinzas muy finas para retirar la vaina perineural inmediatamente por encima de los lóbulos antenales. Tenga mucho cuidado de nopunción cerebro de la abeja con las pinzas.

3. Cromatografía de gases con grabación multicanal

1. La abeja "preparación" - fijado en un tubo con su cerebro expuesto - está ahora listo para el registro electrofisiológico. Coloque la abeja en una abrazadera, fijado a una base magnética que se encuentra en una mesa de aire.
2. Organizar una bolsa IV, controlador de flujo, y el tubo (lleno de solución salina insecto) de modo que la solución salina continuamente superfuses el cerebro.
3. El uso de un micromanipulador, electrodo insertareference, hecho de alambre de tungsteno, en el ojo de la abeja.
4. El uso de un micromanipulador separado, insertar el electrodo multicanal, tal como un tetrodo alambre en espiral, o de silicio multi-canal de electrodo (Tecnologías NeuroNexus), en los lóbulos antenales de la abeja. Este electrodo está conectado a un pre-amplificador, tales como S-3 el sistema de TDT serie Z al procesador BioAmp Z-bus del sistema de TDT. La salida de la Chro Gasdetector matogram mediante un cable BNC apantallado se puede interconectar con el sistema de adquisición de datos y amplificador de tal manera que tanto la señal neural y GC está sincronizado.
5. Espere unos 30-60 minutos para las grabaciones neuronales se estabilicen. Una vez que la actividad espontánea y la forma de onda de las unidades en los canales de grabación se han convertido consistente, utilizar una jeringa de olor para estimular la abeja y observar la respuesta de los canales de grabación al olor.
6. Registrar picos extracelulares de neuronas por auto-umbralización los canales de grabación por 3,5 a 5 sigma de la señal en los canales de grabación individuales. Umbralización manual puede ser necesario para algunos canales para evitar la contaminación de ruido eléctrico. Los potenciales de acción de las neuronas aparecerán como picos de tensión en el canal de grabación. Cuando el voltaje del canal supera el umbral, el sistema de tampones y guarda los pocos milisegundos antes y después del cruce del umbral, de tal modo takinga instantánea de la forma de onda, o pico.
7. Inmediatamente al lado de la mesa de aire es la GC. Antes de inyectar el extracto floral en el GC, asegurarse de que el método para la rampa de temperatura de la ejecución de GC es correcta. En nuestro ejemplo, se utiliza un método de la temperatura a partir de 50 ° C durante 4 minutos seguido por un aumento de temperatura a una velocidad de 10 ° C / min. a 220 ° C, momento en el que mantener el GC para un adicional de 6 min. Usamos una columna DB-5 GC (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.), con helio como el gas portador. La entrada es splitless, con una temperatura fijada a 200 ° C. La ionización de llama temperatura del detector se fija a 230 ° C.
8. Inyectar la muestra de extracto floral en el espacio superior del puerto de inyección calentada del GC para liberar los volátiles adsorbidos en la columna GC. El efluente de la columna se divide 1:1 entre el detector de ionización de llama (FID) y la antena de abeja usando un vaso conector "Y" (J & W Scientific). Comience recording desde el electrodo, tal como se inyecta una muestra en el GC.
9. Después de la ejecución GC ha terminado, que el resto preparación durante 5 a 15 min. Entonces, o inyectar otra muestra en el GC o estimular la preparación usando compuestos volátiles individuales o mezclas de compuestos. En este último método de estimulación de la preparación, los pulsos de aire a partir de una corriente de aire constante se desvían a través de una jeringa de vidrio que contiene un trozo de papel de filtro en el que los compuestos se han depositado. El estímulo de olor se pulsó por medio de una válvula de solenoide activada por controlado por el software.
10. Si la actividad de la unidad se detiene de repente o cambios, verifique el goteo de solución salina y dejar que el resto preparación durante 15 minutos. Si la actividad espontánea no recupera su nivel anterior a continuación, la preparación debe ser desechado y utilizado otra abeja si están disponibles.
11. Después del experimento, se fija el cerebro con 5% de formalina durante 20 min con la sonda todavía está en el tejido. A continuación, cortar el cerebroy colocarlo en glutaraldehído al 2% durante 4 horas, y posteriormente hacer una serie de etanol graduada deshidratación y despeja el cerebro con salicilato de metilo. En base a la fijación y la limpieza de los tejidos, las ubicaciones en la AL en donde los electrodos perfora el tejido debe ser claramente discernibles por microscopía confocal.

4. Análisis de Datos

1. Analizar los datos recogidos después del experimento para separar e identificar las unidades neurales grabados. Utilice los programas típicos de software (Clasificador de conexión, MCLUST y SClust) para las formas de onda por separado, o "picos", basado en formas pico, como pico o valle amplitud pico de ancho medio, etc, o medidas reducidas (componentes principales) ^{17 , 18} (Figura 2). Usar sólo los grupos de espigas que separadas en el espacio tridimensional (PC1-PC3) y son estadísticamente diferentes uno de otro (multivariable ANOVA, p <0,05) (Figura 2) para su posterior análisis. Por favor, consultecita # s 17-19 para una descripción completa de la grabación tetrodo y metodologías punta-clasificación.
2. Sello de tiempo los picos de cada grupo, y exportar estos datos para su análisis utilizando MATLAB o Neuroexplorer (Tecnologías de Nex, Winston-Salem, Carolina del Norte) para crear gráficos de trama y respuestas de la frecuencia de disparo (Figuras 2 y 3 A).
3. Identificar los tiempos de retención de compuestos volátiles utilizando los datos registrados simultáneamente GC. Usa los tiempos de retención de los compuestos volátiles, determinados por el vértice del pico del cromatograma, para examinar las respuestas de la unidad en los puntos de tiempo.
4. Para examinar las respuestas individuales a través de la ejecución de la unidad GC, BIN el número de espigas en intervalos de 100 ms y examinar el curso del tiempo de cocción respuestas de la frecuencia con respecto al tiempo de retención de elución volátiles. La agrupación de picos en intervalos de 100 ms proporciona suficiente detalle, o señal, sobre el curso temporal de la respuesta neuronal a un odorante de elución de la GC.
5. Para examinar las respuestas de la población a los volátiles liberadores diferentes, integrar las respuestas de la frecuencia de disparo de las unidades individuales sobre una ventana de muestreo de 3 segundos, 1,5 segundos antes de, y después de 1,5 segundos, el tiempo de retención de la volátil (Figura 3). Este período de tiempo es típico de la duración de una elución volátil de la GC. Nos muestran respuestas de la frecuencia de disparo de las unidades de codificación de color ellos (el rojo es una respuesta de la tasa de disparo de alta; azul es una respuesta baja) y disponiéndolos como una matriz de actividad que cada fila representa la respuesta de conjunto para el efluente GC (columnas) ( la Figura 3).

Resultados

En el ensayo de GCMR usando el M. aroma floral lewisii, inyectamos 3 l de extracto en la GC. El número total de volátiles de elución a través de la GC es típicamente 60-70 volátiles. El olor de la M. lewisii está compuesto predominantemente de monoterpenoides, incluyendo β-mirceno (acíclico) y α-pineno, con el resto del compuesto de aroma volátiles seis átomos de carbono, tales como 2-hexanol, y sesquiterpenoides que comprenden <1% del espacio de cabeza.

Discusión

Insectos olfativo mediada comportamientos manejar muchos procesos diferentes, incluyendo la reproducción, la selección anfitriona del hotel, y la identificación de los recursos alimenticios adecuados. El estudio de estos procesos requiere la capacidad de identificar los compuestos volátiles emitidos desde la fuente, así como la capacidad de identificar los compuestos que se median los comportamientos. Complica el asunto es que los olores se componen de decenas a cientos de compuestos individuales que juntos crean u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del elemento	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
Porapak Tipo Q 80-100 mesh	Waters	WAT027060
Reynolds Bolsas Horno	Reynolds
GC	Agilent	7820A
GC columna	J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.	DB-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 mM)
Analítica helio gas portador	Praxair	HE K	1 cc / min
16-canal de silicio electrodo	NeuroNexus Techngías	a4x4-3mm50-177
NiCr alambre fino, 0,012 mm de diámetro)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	Para hacer tetrodos personalizados y stereotrodes
Pre-amplificador	Tucker-Davis System	PZ-2
Amplificador	Tucker-Davis System	RZ-2
Sistema de adquisición de datos - OpenEx privado	Tucker-Davis System
Online pico de clasificación de software - SpikePac	Tucker-Davis System
Desconectado pico de clasificación de software - MCLUST Spike-clasificación caja de herramientas	David Redish, Departamento de Neurociencias de la Universidadde Minnesota	Descarga gratuita en http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB caja de herramientas