RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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Resumen

Este protocolo presenta un procedimiento completo y detallado de aplicar RNA-seq, una potente tecnología de próxima generación de secuenciación de ADN, a transcriptomes perfil en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo es generalizable a diversas células o tejidos afectados por diferentes reactivos o estados de enfermedad.

Resumen

La caracterización de la expresión génica en las células a través de la medición de los niveles de mRNA es una herramienta útil en la determinación de cómo la maquinaria transcripcional de la célula se ve afectado por señales externas (por ejemplo, tratamiento de drogas), o cómo difieren entre las células un estado saludable y un estado de enfermedad. Con el advenimiento y refinamiento continuo de la tecnología de ADN secuenciación de próxima generación, ARN-secuenciación (RNA-seq) se ha convertido en un método cada vez más popular de análisis del transcriptoma para catalogar todas las especies de transcripciones, para determinar la estructura de la transcripción de todos los genes expresados y cuantificar los cambios en los niveles de expresión de la serie total de transcripciones en un ^1,2 dado célula, tejido u organismo. RNA-seq está reemplazando gradualmente microarrays de ADN como un método preferido para el análisis de transcriptoma porque tiene las ventajas de un perfil de un transcriptoma completa, proporcionando un dato de tipo digital (número de copias de cualquier transcripción) y no depender de cualquier secuencial genómico conocidoce ^3.

A continuación, presentamos un protocolo completo y detallado para aplicar RNA-seq para transcriptomes perfil pulmonares humanas en células endoteliales microvasculares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo se basa en el estudio recientemente publicado titulado "RNA-seq revela Transcriptome novela de genes y sus isoformas en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares tratadas con trombina," ⁴ en el que realizó con éxito el primer análisis completo de transcriptoma humano pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina utilizando ARN-seq. Cedió recursos sin precedentes para nuevos experimentos para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la trombina mediada por disfunción endotelial en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias, cáncer, diabetes y enfermedad cardiaca coronaria, y proporciona nuevas pistas para posibles dianas terapéuticas para estas enfermedades.

El texto descriptivo de este protocolose divide en cuatro partes. La primera parte se describe el tratamiento de humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares con trombina y el aislamiento de ARN, análisis de la calidad y la cuantificación. La segunda parte describe la construcción de bibliotecas y la secuenciación. La tercera parte se describe el análisis de datos. La cuarta describe un ensayo de validación de RT-PCR. Los resultados representativos de varios pasos claves se muestran. Consejos útiles y precauciones para impulsar el éxito en los pasos claves se proporcionan en la sección de debate. Aunque este protocolo utiliza humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina, que se pueden generalizar a transcriptomes perfil tanto en células de mamíferos y no mamíferos y en los tejidos tratados con diferentes estímulos o inhibidores, o para comparar transcriptomes en células o tejidos entre un estado saludable y un estado de enfermedad.

Protocolo

Un diagrama de flujo delinear este protocolo se muestra en la figura 1.

1. El tratamiento de células con trombina, Aislamiento de ARN, Evaluación de la Calidad y cuantificación de ARN

Cultivar células endoteliales microvasculares de pulmón (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluencia en placas de 6 pocillos en medio EGM-2 con 5% de SFB, factores de crecimiento y antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
Cambiar el medio a los medios de inanición (0% FBS) 30 min antes del tratamiento con trombina.
Se tratan las células con 0,05 U / ml de trombina o dejar sin tratar como control durante 6 horas a 37 ° C y 5% CO _2.
Aislar el ARN total de las células tratadas y de control utilizando el Ambion mir Vana kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Evaluar la calidad del ARN con un chip de Experion Eukaryotic StdSense ARN de acuerdo con el protocolo estándar en la estación de Electroforesis Experion automatizada (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Cuantificar el ARN utilizando un método espectrofotométrico estándar.

2. Biblioteca de la construcción y secuenciación

Usar 1 mg de ARN de alta calidad total por muestra como material de partida.
Para construir la biblioteca, siga el procedimiento estándar de Illumina (protocolo # 15008136 Rev. A). En este protocolo, dos rondas de poli (A) que contienen selecciones de ARNm se realiza para eliminar rRNA para minimizar la secuenciación de ARNr.
Evaluar la calidad de las bibliotecas utilizando un chip de ADN Experion 1K de acuerdo con el protocolo estándar en la estación de Electroforesis Experion automatizada ( www.bio-rad.com ).
Cuantificar la biblioteca mediante qPCR: utilizar una biblioteca que ha sido previamente secuenciados como una curva estándar y cebadores específicos para los adaptadores ligados. Utilizar una serie de diluciones de las bibliotecas desconocidos (es decir, 1:100, 1:500 y 1:1000). Ejecute el acco qPCRrding con el protocolo SyberGreen MM y calcular la concentración de la población original de cada biblioteca.
Diluir los fondos de las bibliotecas a 10 nM y se almacena a -20 ° C hasta el momento de clúster de una célula de flujo.
Cuando esté listo para clúster de una celda de flujo, descongele la placa reactivo CBOT en un baño de agua. CBOT es un instrumento utilizado Illumina para agilizar el proceso de generación de cluster.
Lave el instrumento CBOT.
Desnaturalizar las bibliotecas: Combinar 13 l TE 1x y 6 l 10 mM biblioteca y, al lado del tubo, añadir 1 l 1 N NaOH (proporcionado por Illumina). Vortex, girar hacia abajo, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y colocar las librerías desnaturalizadas en hielo.
Diluir las bibliotecas: Diluir las bibliotecas desnaturalizadas con tampón de hibridación pre-enfriada (HT1, proporcionado por Illumina) mediante la combinación de 996 l HT1 y 4 desnaturalizado biblioteca l para una concentración final de 12 pM. Coloque las bibliotecas desnaturalizados y diluido en hielo.
Invertir cada fila de tubos de la placa de CBOT,asegurar que todos los reactivos se descongelan. Girar hacia abajo la placa, elimine / perforar los sellos de aluminio y cargar en el CBOT.
Alícuota de 120 l de las bibliotecas diluidos, desnaturalizadas a un tubo de tira, etiquetados 1-8. Añadir 1,2 l biblioteca diluida, desnaturalizado control de PhiX (de iluminación) en cada tubo como una espiga en los de control. Vortex y centrifugar los tubos y los carga en el CBOT en la orientación correcta (tubo n º 1 a la derecha).
Cargue una celda de flujo y colector en el CBOT.
Completar el flujo de comprobar y comenzar el largo agrupación.
Después de la ejecución haya finalizado, compruebe la entrega de reactivos en todos los carriles. Tome nota de cualquier anomalía. Cualquiera de iniciar la ejecución de la secuencia inmediatamente o almacenar la celda de flujo en el tubo provisto a 4 ° C.
Descongelar la secuenciación por síntesis (SBS, Illumina) reactivos.
Cargue los reactivos a los lugares adecuados en las bandejas de reactivos, asegurándose de no tocar los otros reactivos después de tocar la mezcla de escisión.
El uso de un non-secuenciación de flujo de células (es decir, que fue secuenciado previamente), las líneas principales de reactivos en dos ocasiones.
Limpiar a fondo la celda de flujo de secuenciación con EtOH al 70% y Kimwipes, seguido por 70% de EtOH y papel para lentes. Inspeccione la celda de flujo para las rayas. Vuelva a limpiar si es necesario.
Cargar la celda de flujo en el secuenciador y realizar un flujo de comprobar para asegurarse de que el sello entre los colectores y la celda de flujo es ajustado.
Inicie la carrera de secuenciación.
Evaluar los indicadores de calidad (por ejemplo, la densidad de cluster, racimos pasan filtro, Q30, intensidad) a medida que estén disponibles durante el funcionamiento.
Monitorear intensidad a lo largo de la carrera.
Después de 101 ciclos se han completado, realizar la química de respuesta para completar la segunda lectura: Descongelar los reactivos extremos apareados y el búfer de lectura Incorporación segundo (ICB, un componente de los reactivos de SBS, Illumina) y cargar los reactivos.
Continúa la carrera de secuenciación, la evaluación 2 ^ª lectura intensidad, Q30 unand métricas de calidad de otros como los avances de ejecución.

3. Análisis de Datos

Utilice la última versión de yuca (Illumina, actualmente 1.8.2) para convertir los archivos de llamadas bases (. Bcl) archivos para archivos. Fastq, estableciendo fastq-cluster-conteo a 0 para garantizar la creación de un archivo fastq único para cada muestra . Descomprimir los archivos fastq para el análisis de aguas abajo.
Realice la alineación final emparejado con las últimas versiones de TopHat (1.4.1) ^5, que se alinea RNA-seq lee a los mamíferos del tamaño de los genomas utilizando el ultra alto rendimiento a corto alineador de lectura (Bowtie, 0.12.7) ⁶ y SAMtools (0,1. 17) ^7. SAMtools implementa varias utilidades para las alineaciones de post-procesamiento en el formato SAM. El transcriptoma humano de referencia se pueden descargar desde iGenomes ( www.illumina.com ). Al correr TopHat, hemos utilizado todos los parámetros por defecto, incluyendo la opción de tipo de biblioteca como fr-unstranded (por defecto).
NosotrosCIÓN DEL CuffDiff programa, parte de los gemelos (1.3.0) ⁸ paquete de software, comparar las células tratadas con trombina en las células controles para detectar a las transcripciones de genes expresados diferencialmente en la antigua base de referencia el transcriptoma humano. Esta comparación detecta la expresión diferencial de las transcripciones conocidas. Utilice Microsoft Excel para visualizar el resultado en forma de tabla. Al correr el programa Gemelos, hemos utilizado todos los parámetros por defecto. Las transcripciones de genes con FPKM <0,05 yp <0,05 se filtran.
Para detectar isoformas novela, ejecute Gemelos sin transcriptoma de referencia. Comparar los archivos de transcripción de ejemplo en el genoma de referencia utilizando Cuffcompare y probar la expresión diferencial con Cuffdiff utilizando los archivos de trombina combinados de transcripción como el genoma de referencia para un análisis, y los archivos de control combinados de transcripción como el genoma de referencia para un segundo análisis. Utilice Microsoft Excel para visualizar el resultado en formato tabular. Una vez más, thostranscripciones gen E con FPKM <0,05 y p> 0,05 se filtran. Después de este paso, los investigadores pueden optar por subir una lista de las transcripciones recientemente denunciados a la página web del genoma UCSC ( http://genome.ucsc.edu/ ) para verificar su validez mediante una inspección manual.
Enviar las listas de genes expresados diferencialmente a Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) para la caracterización de los genes y las vías afectadas por el tratamiento de la trombina. En este paso, los investigadores pueden optar por usar faja ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un paquete de R que está diseñado para ayudar y simplificar la tarea de analizar Gemelos RNA-seq salida, para ayudar a administrar, visualizar e integrar todos los datos producidos por un análisis Cuffdiff.

4. La validación de los resultados de la RNA-seq por cuantitativa en tiempo real de Po-lymerase reacción en cadena (QRT-PCR)

Realice aislamiento de ARN total de control y tratados con trombina HMVEC-LBL células, el ARN de calidad de evaluación y cuantificación del ARN se describe en los pasos 1.4 a 1.6.
Generar ADN complementario a partir del ARN 1 microgramos totales de cada muestra con SuperScript III First-Strand Synthesis Kits sistema RT, siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 18080-051).
Realizar análisis de QRT-PCR en un Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System usando TaqMan ensayo-on-Demand oligonucleótidos diseñados para la detección de CUGBP, elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -factor asociado 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), y β actina-(ACTB, Hs99999903_m1). Cada muestra tenía una plantilla equivalente a 5 ng de ARN total. Medir utilizando el método de cuantificación DDCT y normalizar para β-actina. Cada ensayo se realizó a través de al menos tres repeticiones biológica.