Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

Resumen

Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.

Resumen

5-metilcitosina (5-mC) constituye ~ 2-8% de las citosinas en el total de ADN genómico humano y afecta a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión génica, el mantenimiento de la integridad del genoma, impronta parental, inactivación del cromosoma X, la regulación de desarrollo, el envejecimiento y el cáncer ^1. Recientemente, la presencia de un oxidó 5-MC, 5-hidroximetilcitosina (HMC-5), fue descubierto en células de mamífero, en particular en madre embrionarias (ES) de células y células neuronales ^2-4. 5-HMC es generada por la oxidación de 5-mC catalizada por TET familia del hierro (II) / α-cetoglutarato dependiente de dioxigenasas ^{2, 3.} 5-HMC es propuesto para que participen en el mantenimiento de la madre embrionarias (ES) de células, la hematopoyesis normal y tumores malignos, y cigoto desarrollo ^{2, 5-10.} Para comprender mejor la función de 5-HMC, un sistema de secuenciación fiable y sencilla es esencial. Secuenciación de bisulfito tradicionales no pueden distinguir 5 HMC de 5-MC ¹¹ 12.

Aquí se describe un sencillo procedimiento en dos etapas para el etiquetado de productos químicos selectivos de 5-HMC. En la primera etapa de etiquetado, 5-HMC en el ADN genómico se marca con un catalizada 6-azida-glucosa por β-GT, una glucosiltransferasa a partir del bacteriófago T4, de una manera que transfiere el 6-azida-glucosa al 5-HMC de la modificado cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). En la segunda etapa de biotinilación,, un enlazador disulfuro de biotina se une al grupo azida por la química clic. Ambas etapas son altamente específicos y eficiente, llevando a completar el etiquetado independientemente de la abundancia de la 5-HMC en regiones genómicas y dando fondo extremadamente bajo. Después de biotinilación de 5-HMC, los fragmentos de ADN de 5 HMC que contienen son entonces selectivamente capturadoutilizando perlas de estreptavidina de una manera independiente de la densidad. El resultante 5-HMC enriquecidos con fragmentos de ADN se podría utilizar para los análisis posteriores, incluyendo secuenciación de próxima generación.

Nuestra etiquetado selectivo y protocolo de captura confiere una alta sensibilidad, aplicable a cualquier fuente de ADN genómico con variables / diversa 5-HMC abundancias. Aunque el propósito principal de este protocolo es su aplicación aguas abajo (es decir., Secuenciación de próxima generación para mapear la distribución de 5-HMC en el genoma), es compatible con una sola molécula, en tiempo real SMRT (ADN) secuenciación, que es capaz de ofrecer una sola base de secuenciación resolución de 5-HMC.

Protocolo

1. Fragmentación de ADN genómico

El fragmento de ADN genómico utilizando sonicación a un intervalo de tamaño deseado adecuado para la plataforma de secuenciación de todo el genoma. (Por lo general, sonicar a ~ 300 pb.) Verificar la distribución del tamaño del ADN genómico fragmentado en 1% de gel de agarosa (Figura 1).

2. Preparación de ADN

Determinar las cantidades de ADN de partida basado en la abundancia de la 5-HMC en el ADN genómico. Dado que los niveles de 5-HMC varían significativamente en diferentes tipos de tejidos, a partir cantidades de ADN dependen de los niveles de 5-HMC de las muestras. Por favor, consulte la Tabla 1 para ver ejemplos.

3. β-GT reacción catalizada (reacción de glucosa Transfer)

1. Mezclar pipeteando la mezcla como se detalla en la Tabla 2 y se incuba en un baño a 37 ° C durante 1 hr.
2. Después de la incubación, limpiar la reacción con el kit QIAquick eliminación de nucleótidos, usando 10 g de ADN porcolumna. Se eluye con 30 l de agua por columna y combinar.

4. Biotinilación Reacción (Instrucciones Química)

1. Añadir DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado solución de trabajo (1 mM) en la solución de ADN eluido (de la etapa 3) a una concentración final de 150 mM (es decir, 5 l de solución de trabajo por solución de ADN 30 l).
2. Mezclar mediante pipeteo y se incuba en un baño a 37 ° C durante 2 horas.
3. Limpie la reacción con el kit QIAquick eliminación de nucleótidos. El volumen ideal de elución total es de 100 l.
4. Cuantificar la cantidad de ADN recuperado mediante espectrofotómetro microlitro escala (por ejemplo., NanoDrop).

5. Captura de la 5-HMC que contienen ADN

1. Lavar 50 l de Dynabeads MyOne estreptavidina C1 3 veces con 1 ml de 1X tampón B & W de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se separan las perlas con un soporte magnético.
2. Añadir un volumen igual de 2X tampón B & W al recuperado D biotiniladoNA (100 ul) a las perlas lavadas.
3. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente con rotación suave, en un rotador.
4. Se separan las perlas con un soporte magnético y lavar las perlas 3 veces con 1 ml de 1X tampón B & W.
5. Eluir el ADN incubando las perlas en 100 l de DTT 50 mM recién preparado durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación suave, en un rotador.
6. Se separan las perlas con un soporte magnético. Aspirar el eluyente y se carga en un Micro Bio-Spin 6 columna de acuerdo con la instrucción de fabricación para eliminar el DTT. El ADN diana se encuentra en la solución ahora.
7. Se purifica el ADN eluido de la etapa anterior por Qiagen kit de purificación de PCR MinElute y el ADN se eluye en 10 l de tampón EB. Cuantificar el ADN utilizando fluorómetro Qubit, o NanoDrop si la concentración es superior a 20 ng / ul. El ADN está listo para aguas abajo en todo el genoma preparación de bibliotecas de secuenciación.

6. Los resultados representativos

Si la calidad of ADN genómico es alto, los rendimientos típicos de recuperación después de la β-GT y reacciones biotinilación son ~ 60-70%. Sin embargo, la eficiencia de la captura variar significativamente con tipos de tejidos diferentes en función de los niveles de 5-MCS de las muestras. Típicamente, la eficiencia de la captura de ADN genómico cerebro es de ~ 4.9%, y en algunos casos extremos, la eficiencia puede llegar hasta 12%. Para células madre embrionarias, la eficiencia de la captura promedio es de ~ 2-4%, en contraste con ~ 0,5% para las células madre neurales. La menor eficiencia visto hasta ahora era para el ADN genómico de las células cancerosas. Todo el ADN enriquecido está listo para el estándar de la próxima generación de protocolos de preparación de la biblioteca. Además, el ADN capturado también puede ser utilizado como molde para la PCR en tiempo real para detectar el enriquecimiento de algunos fragmentos en comparación con el ADN de entrada, si los cebadores relacionados están disponibles.

Figura 1. Sonicadas humanos fragmentos de ADN genómico en1% en gel de agarosa. 10 g de ADN genómico aislado de células iPS humanas en 120 l de tampón TE 1X se sometió a ultrasonidos usando un dispositivo de sonicación (Covaris). Después de la sonicación, 2 l de la ADN sonicado se cargó en agarosa al 1% en gel utilizando 100 pb del marcador de ADN para comparar los tamaños de los fragmentos de ADN sometidos a ultrasonidos.

Componente	Volumen	Concentración final
Agua	_ L
10 X β-GT Reaction Buffer	2 l	1 X
Hasta 10 g de ADN genómico	_ L	Hasta 500 ng / l
UDP-6-N-3 Glc (3 mM)	0,67 l	100 mM
β-GT (40 mM)	1 l	2 uM
Volumen total	20 l

i) Para el ADN genómico de tejido (mayor de 5 HMC contenido> 0,1%)

Componente	Volumen	Concentración final
Agua	_ L
10 X β-GT Reaction Buffer	10 l	1 X
Hasta 20 g de ADN genómico	_ L	Hasta 500 ng / l
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	1,33 l	100 mM
β-GT (40 mM)	2 l	2 uM
Volumen total	40 l

ii) Para el ADN genómico de células madre (mediana 5 HMC contenido ~ 0,05%)

Componente	Volumen	Concentración final
Agua	_ L
10 X β-GT Reaction Buffer	10 l	1 X
Hasta 50 g de ADN genómico	_ L	Hasta 500 ng / l
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	3,33 l	100 mM
β-GT (40 mM)	5 l	2 uM
Volumen total	100 l

iii) En el caso del ADN genómico de las células cancerosas (de menos de 5 HMC contenido de ~ 0,01%)

Tabla 1. Ejemplos de cantidades de ADN de entrada y etiquetado reacciones utilizando las muestras con diferentes niveles de 5-HMC por el método de etiquetado químico selectivo.

Muestra	5 HMC nivel	ADN de partida (g)	La recuperación después de etiquetado (entrada a las perlas) (g)	Recuperación de rendimiento	Tire hacia abajo del ADN (ng)	Pull-down producir
Cerebelo de ratón adulto	0,4%	10	7,5	75%	236	3,1%
Día 7 postnatal ratón cerebelo	0,1%	11	9	82%	140	1,6%
Ratón de células ES E14	0,05%	60	42	70%	350	0,8%

Tabla 2. Los resultados representativos de los tejidos del cerebro de ratón y células ES.

Discusión

5-hidroximetilcitosina (HMC-5) es un presente identificado recientemente modificación epigenética en cantidades sustanciales en ciertos tipos de células de mamíferos. El método presentado aquí es para determinar la distribución en todo el genoma de la 5-HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glucosiltransferasa para transferir un resto de glucosa de ingeniería que contiene un grupo azida en el grupo hidroxilo de la 5-HMC. El grupo azida se pueden modificar químicamente con biotina para la detección, enriquecimiento d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Catálogo	Comentario
			Reactivos
El cloruro de sodio 5 M (NaCl)	Promega	V4221
0,5 M pH 8,0 ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Promega	V4231
Trizma base 1 M (Tris), pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1 M, pH 7,4	Invitrogen	15630
Cloruro de magnesio (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530g
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-biotina-conjugado PEG3	Haga clic en Herramientas Química	A112P3
1,4-ditiotreitol, ultrapura (TDT) superpuro	Invitrogen	15508-013
QIAquick Kit de eliminación de nucleótidos	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Columna	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Estreptavidina C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure agarosa	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glucosa	Active Motif	55013
			Enzima
β-glucosiltransferasa (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipo
La sonicación dispositivo	Covaris
Escritorio centrífuga
Baño de agua	Fisher Scientific
Gel corriendo aparato	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Soporte Separación Magnética	Promega	Z5342
Qubit 2,0 Fluorómetro	Invitrogen
			Reactivo de configuración 10 X β-GT de tampón de reacción (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X Encuadernación y lavado (B & W) tampón (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M de NaCl, 0,02% Tween 20) .