Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Resumen

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre ( Ambystoma tigrinum) Y explicamos cómo usamos estos sectores para estudiar la actividad sináptica de la retina mediante la obtención de dos grabaciones de fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden.

Resumen

Una de las tareas centrales de la neurociencia retina es entender los circuitos de neuronas de la retina y cómo esas conexiones son responsables de la formación de las señales transmitidas al cerebro. Los fotones se detectan en la retina por conos y bastones fotorreceptores, que convierten esa energía en una señal eléctrica, la transmisión a otras neuronas de la retina, donde se procesa y se comunica a los objetivos centrales en el cerebro a través del nervio óptico. Importantes primeros conocimientos sobre circuitos de retina y el procesamiento visual vinieron de los estudios histológicos de ^1,2 Cajal y, más tarde, a partir de los registros electrofisiológicos de la actividad adición de células ganglionares de la retina - las células de salida de la retina ^3,4.

Una comprensión detallada de procesamiento visual en la retina requiere una comprensión de la señalización en cada paso en la vía de fotorreceptores a células ganglionares de la retina. Sin embargo, muchos tipos de células retinianas son fresaied profunda en el tejido y por lo tanto relativamente inaccesible para el registro electrofisiológico. Esta limitación se puede superar mediante el trabajo con las rebanadas verticales, en el que las células que residen dentro de cada una de las capas de la retina son claramente visible y accesible para el registro electrofisiológico.

Aquí se describe un método para la fabricación de secciones verticales de retinas de larvas salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Mientras que esta preparación fue desarrollado originalmente para grabaciones con microelectrodos afilados ^5,6, se describe un método para grabaciones de doble fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden en el que manipulamos potencial de membrana del fotorreceptor durante la grabación simultánea de post- las respuestas sinápticas en células horizontales o bipolar. Los fotorreceptores de la salamandra tigre son considerablemente más grandes que los de las especies de mamíferos, haciendo de ésta una preparación ideal en el que para llevar a cabo tsu enfoque experimental técnicamente difícil. Estos experimentos se describen con miras a sondear las propiedades de señalización de la cinta sináptica - una estructura sináptica especializada que se encuentra en un sólo un puñado de neuronas, incluyendo bastones y conos fotorreceptores, que es muy adecuado para el mantenimiento de una alta tasa de liberación de neurotransmisores tonic ^{7 , 8} - y cómo contribuye a las propiedades únicas de señalización de esta primera sinapsis retina.

Protocolo

1. Rebanadas de retina Preparación

1. Monte la cámara (diseño ilustrado en la Figura 1). Se colocan dos gotas de grasa de vacío, espaciados ~ 8-10 mm aparte, a través de la cámara de grabación para formar un canal para superfusate y en el que se incorporará las rodajas de la retina. Añadir una segunda gota de grasa de unos pocos milímetros más lejos hacia fuera más allá de cada uno de estos dos gotas de grasa para actuar como un dique y el límite de desbordamiento. Colocar una pequeña pieza triangular de KIMWIPE en el extremo de la cámara para asegurar el contacto de fluido con el electrodo de referencia.
2. Pulse una pieza de membrana de nitrocelulosa (~ 5 x 10 mm; 0,8 poros micras) plana contra el portaobjetos de vidrio en dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Evitar poner grasa directamente debajo del centro de la membrana de nitrocelulosa, ya que esto puede evitar que se adhiera la retina.
3. Para preparar la máquina de cortar el tejido, romper una hoja de afeitar de doble filo en 4 trozos y coloque uno en el brazo de corte. Corte una rebanada delgada de nitrocellulmembrana ose para asegurar que el borde de corte de la cuchilla de afeitar quede plana contra la cámara de registro y por lo tanto corta limpiamente a través de la membrana de nitrocelulosa.
4. Mantenga un pequeño vaso de precipitados de solución salina anfibio (Tabla 1) en el hielo en la estación de disección.
5. La eutanasia salamandra por decapitación. Hemisect sagital de la cabeza y la médula a través de la médula espinal. Coloque la mitad de la cabeza en un trozo de algodón humedecido con solución salina anfibio sobre un bloque de linóleo. La otra mitad de la cabeza puede ser envuelto con una toalla de papel húmeda y se almacenó a 4 ° C para su uso posterior en el día.
6. Enucleación del ojo. Usando Vannas pequeñas tijeras, cortar la piel que conecta el ojo con la órbita alrededor. Después de la liberación de la parte frontal del ojo a partir del tejido circundante orbital, tire el ojo hacia afuera y deslice las tijeras bajo el ojo para cortar a través de los músculos del ojo y del nervio óptico, liberando el ojo de la órbita.
7. Coloque el ojo enucleado en una cama de algodón en elbloque de linóleo. Deseche la mitad de la cabeza. Quite la grasa orbital superior de la parte posterior del ojo.
8. Hacer una pequeña incisión en el centro de la córnea con una cuchilla quirúrgica agudo. Retire la córnea por deslizamiento Vannas tijeras finas en la incisión y se extiende el corte radialmente hacia fuera hacia la ora serrata. Cortar circunferencialmente alrededor de la ora serrata mediante la rotación del bloque de linóleo o el algodón entre los cortes.
9. Después de cortar todo el camino alrededor de los ojos, eliminar la córnea y la lente tirando de ellos fuera del lado de la ojera. Mueva el ocular resultante sobre una superficie dura del bloque de linóleo humedecido con solución salina anfibio. Cortar en tres partes con una hoja de afeitar afilada, con un movimiento de sierra fina para asegurar que haya cortado todo el camino a través de la esclerótica.
10. Coloque una o dos piezas de ocular en la membrana de nitrocelulosa con la superficie de la retina hacia abajo. Sumerja las piezas restantes con solución salina adicional y colocarlos en el refrigerador a 4 ° C. ~
11. Gently presione la pieza de ocular contra la membrana de nitrocelulosa con unas pinzas finas. Sumergir la membrana de nitrocelulosa y la pieza ocular con varias gotas de solución salina fría y anfibios blot en los bordes con KIMWIPE para ayudar a la retina a que se adhieran. Una vez más, sumergir la copa ocular y la membrana de nitrocelulosa con varias gotas de solución salina anfibio frío y se desprenden de la esclerótica / coroides / epitelio pigmentario de la retina para aislar la retina (que puede aparecer de color rosa debido a la presencia de la rodopsina sin blanquear). Si es necesario, cortar el nervio óptico para liberar la retina.
12. Si la retina no está conforme con fuerza, drenar la solución salina con una KIMWIPE para tirar de la retina más firmemente hacia abajo sobre la membrana de nitrocelulosa. Reemplace la solución salina. Repetir, si es necesario.
13. Llenar la cámara con solución salina anfibio frío y la transferencia a la etapa de la máquina de cortar tejido. Cortar la retina y la membrana de nitrocelulosa en tiras finas, de trabajo de un extremo al otro girando el micrómetro a vernieren incrementos de 125 m. Presione la hoja de afeitar suavemente pero con firmeza a través de la retina y la membrana de nitrocelulosa.
14. Transfiera las rebanadas de retina moviendo tiras de membrana de nitrocelulosa para el canal principal de la cámara de grabación. Levante una tira de membrana de forma gratuita y luego mantenerlo en su lugar mientras se mueve la cámara por debajo de él, asegurándose de mantener los cortes sumergidos. Insertar los bordes de la membrana de nitrocelulosa en las tiras de grasa de vacío, girarlos 90 grados para acceder a las capas de la retina.
15. Pulse la membrana de nitrocelulosa plana contra la superficie del vidrio. Incluso si no hay retina en cada pieza, colocar tiras de membrana de nitrocelulosa a intervalos regulares (~ 1 mm de diferencia) a lo largo de toda la longitud del canal de perfusión para ayudar a romper la tensión superficial y mejorar el flujo de fluido.

2. Pares de células enteras grabaciones

1. Después de todas las rebanadas se han transferido, mover la cámara de registro a la etapa de una posición vertical, fijomicroscopio de fase y conecte el cable del electrodo de referencia. Se centran en las rebanadas con una distancia larga de trabajo, inmersión en agua, 40-60X objetivo. El microscopio debe ser colocado sobre una mesa de aire para amortiguar las vibraciones y encerrado en una jaula de Faraday para reducir la interferencia eléctrica.
2. Superfuse las rebanadas continuamente a una velocidad de 1 ml / min con solución salina anfibio burbujeado con 100% de O _2. Conectar la aspiración, asegurándose de que la entrada y salida están equilibrados. Caudal de salida se puede regular girando el extremo biselado de la aguja de aspiración o moviendo el KIMWIPE en el extremo de la cámara más cerca o más lejos de la aguja de flujo de salida. La preparación puede conservarse a temperatura ambiente o se enfría con un dispositivo Peltier o, simplemente definiendo un paquete de hielo en la platina del microscopio.
3. Examine las rebanadas con poca luz o infrarrojos e identificar un par de células - un fotorreceptor (varilla o cono) y células horizontales o bipolar cerca - a la meta para la grabación de células enteras. Rods pueden ser identified por sus cuerpos celulares grandes y varilla-como los segmentos externos de prominentes (Figura 2A). Los conos son más pequeñas que las barras y tienen pequeños segmentos exteriores cónicas. Célula bipolar y somas celulares horizontales están en la fila más exterior de los cuerpos celulares en la capa nuclear interna (INL; Figuras 2B y 2C).
4. Antes de preparar las rebanadas, utilizar un extractor de pipeta para la fabricación de pipetas de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,2 mm, 0,95 mm de diámetro interior con un filamento de vidrio). La punta de cada micropipeta debe ser ~ 1-2 micras de diámetro.
5. Usando una aguja de relleno no metálico (por ejemplo, uno fabricado a partir de una jeringa de 1 cc o un Microfil), llenar pipetas con la solución intracelular (Tabla 1) y se unen a el soporte del electrodo.
6. Eleve el objetivo del microscopio ligeramente. Coloque la pipeta fotorreceptor debajo del objetivo y luego bajar de modo que la punta se coloca justo por encima de las rebanadas. Repita con tlo segundo pipeta.
7. Ajuste cualquier desplazamiento en el actual nivel de referencia en el amplificador. Comprobar la resistencia de pipeta con un 5-10 mV pulso despolarizante. Por lo general utilizan pipetas que van desde 10 hasta 15 mW, el resultado de la larga conicidad de la baja osmolaridad de las soluciones de eje de pipeta y anfibios. Con las soluciones de osmolaridad mamíferos superiores, estas mismas pipetas presentan valores de resistencia de ~ 8-12 mW. Si bien hemos utilizado diámetros de punta más grandes con valores de resistencia de 3-4 mW en soluciones de anfibios, las ventajas proporcionadas por una resistencia inferior de acceso se compensan con una mayor dificultad en el sellado en las membranas celulares y una más rápida resumen de las corrientes de calcio y otros segundos mensajeros sensibles a las respuestas.
8. Mientras aplica presión leve, posición positiva la pipeta post-sináptica de manera que hace contacto con el cuerpo celular horizontal o bipolar. A continuación, coloque la pipeta presináptica de manera que entra en contacto con el cuerpo de la célula de un fotorreceptor varilla o cono. Grabaciones appear a ser más estable cuando las puntas de pipeta en contacto con el segmento interno en lugar de el soma, especialmente en los conos.
9. Mientras que el control de la resistencia, liberar la presión positiva en la pipeta post-sináptica. A veces, la liberación de la presión positiva es suficiente para formar un sello gigaohmio. Si no es así, aplicar succión suave con una jeringa de 1 ml o por vía oral. Después de la resistencia punta ha crecido hasta> 100 M, aplicar un potencial de mantenimiento de -60 mV. Después de obtener un sello gigaohmio, nulo a cualquier transitorio capacitancia pipeta y repita el procedimiento de sellado para el fotorreceptor pipeta, la aplicación de un potencial de mantenimiento de -70 mV.
10. La rotura del parche con la boca o una jeringa para aplicar succión a cada célula a su vez. Rods, conos y células bipolares se suelen romper con una suave succión. Obtención de configuración de célula con una célula horizontal puede requerir una mayor succión (es decir, con una jeringa de 3 cc) en combinación con fuertes pulsos de voltaje rápidos entregados con el f "zap"eature del amplificador de patch clamp. La rotura de la membrana y el establecimiento de la configuración de célula completa será evidente por la aparición de los transitorios de capacitancia de células enteras.
11. Confirmar la identidad de la célula post-sináptica fisiológicamente mediante la aplicación de un destello de luz y la entrega de una serie de pasos de voltaje de -120 a 40 mV en incrementos de 20 mV (Figuras 3 y 4).
12. Para evaluar si el par de células están conectadas sinápticamente, entregar un breve (25-100 ms), 60 mV paso despolarización del fotorreceptor (a -10 mV, cerca del pico de la corriente de calcio tipo L dependientes de voltaje) y mirar para las corrientes post-sinápticas en la segunda neurona orden (Figura 5). Un fuerte paso despolarizante debe evocar una, transitorios de corriente hacia el interior de post-sináptica rápida en la celda horizontal o APAGADO post-sináptica bipolar causado por una explosión de liberación de vesículas desde el cono (Figura 5).

Resultados

Rastros representativos de respuestas de la luz de las neuronas en rodajas verticales de salamandra retina se muestran en la Figura 3. El cono, célula horizontal, y OFF células bipolares todas muestran una corriente hacia el exterior en respuesta a la aparición de la luz. El destacado corriente de entrada después de la luz del flash en las grabaciones de células horizontales y bipolar es causado por el aumento de la liberación de glutamato de los fotorreceptores como despolarizan en el desplazamiento de luz. El EN célula bipolar responde con una corriente de entrada al inicio de la luz como resultado de una metabotrópicos signo inversora receptor de glutamato cascada de señalización y activación de TRPM1 canales ^9. Células horizontales y células bipolares se pueden distinguir una de otra por su relaciones IV (Figura 4). Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada lineal o dentro rectificar IV y bajo (<500 mW; Figura 4A) mientras que las células bipolares tienen una alta resistencia de entrada(0,5-2 GΩ) y hacia el exterior-rectificar I - V (Figura 4B) Figura 5 muestra resultados representativos de grabaciones de un par de células de cono horizontal (Figura 5A) y el par de células bipolares cono-apagado (Figura 5B).. En cada uno, el cono despolarizante a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV evocó una corriente en el cono y la EPSC rápida hacia el interior en la celda horizontal o bipolar de calcio dependiente de voltaje. Esta fuerte estímulo es suficiente para vaciar la piscina fácilmente liberable de vesículas ~ 20 de cada cinta sináptica, lo que resulta en una EPSC de ~ 47 pA / de la cinta ^10. El EPSC celular horizontal en la Figura 5A fue de 232 pA, lo que sugiere que recibió 5 contactos planos de la cono presináptica. Una estimación similar del 178 pA EPSC en la célula bipolar off (Figura 5B) sugiere que recibió 4 contactos planos del cono presináptica.

	Anfibios salina	Pipeta presináptica	Pipeta Postsináptica
NaCl	116 mM	3,5 mM	3,5 mM
KCl	2,5 mM
CaCl2	1,8 mM	1 mM	1 mM
MgCl 2	0,5 mM	1 mM	1 mM
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM
Glucosa	5 mM
Cs-glutamato *		40 mM
Cs-gluconato **		50 mM	90 mM
Cloruro de tetraetilamonio		10 mM	10 mM
ATP-Mg		9 mM	9 mM
GTP		0,5 mM	0,5 mM
EGTA		5 mM	5 mM
pH ***	7.8	7.2	7.2
Osmolaridad ****	245 mOsm	240 mOsm	240 mOsm

* Cs-glutamato se hace mediante la neutralización mM de ácido L-glutámico 40 con 40 mM de CsOH en la solución de la pipeta. ** Una de stock 1 M de Cs-gluconato se hace mediante la neutralización de una solución de CsOH con ácido D-glucónico 45-50%. *** El pH debe ser ajustado con NaOH para la solución extracelular y CsOH para las soluciones de pipeta. **** Mantener la osmolaridad de las soluciones de pipeta justo por debajo de la de la solución extracelular impide la hinchazón celular y mejora la longevidad de la grabación.

Tabla1. Componentes y parámetros para las soluciones intracelulares y extracelulares estándar utilizados en este protocolo.

Figura 1. Diseño de la cámara de grabación. (AC) Arriba, al lado, y las vistas de corte de la cámara de registro que muestra las dimensiones. La cámara está fabricada en una pieza de espesor 2 mm de acrílico. (D) cámara de ensamblado. Superfusate entra en la cámara a través de una longitud de 10 cm de un tubo de Teflón (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate se elimina mediante la aplicación de succión leve a un tubo de metal de calibre 20 biselado en el otro lado de la cámara. Adyacente a este tubo de salida es un electrodo de referencia de pellets de Ag / AgCl. La ventaja de este electrodo de referencia está conectado a la entrada de referencia de la headstage. Un pequeño triángulo de KIMWIPEse coloca sobre el electrodo de referencia para mantenerla en contacto con la solución y regular el flujo de la solución en el tubo de flujo de salida. La base de la cámara se forma mediante la colocación de un portaobjetos de microscopio de vidrio en los bordes hendidos de la cámara. La presentación se celebró en el lugar con una gota de grasa de vacío. Las tiras de membrana de nitrocelulosa con rodajas de la retina están incrustados en las gotas de grasa de vacío que forman un canal para la solución de flujo. Antes de hacer las rebanadas, un x 10 mm trozo de membrana de nitrocelulosa 5 se fija a la cámara con dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Un pedazo de la ojera se coloca lado vítreo abajo en esta membrana de nitrocelulosa y se levanta lejos una vez que se adhiere la retina. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. Parejas de células llenas de tinte en verebanada preparación rtical. A) Imágenes de una barra y células horizontal sinápticamente de acoplamiento que se llena de contraste tintes fluorescentes introducidas a través de la pipeta parche durante la grabación simultánea de células enteras. Lucifer amarillo (2 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta varilla (amarillo) y sulfarhodamine B (1 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta celular horizontal (púrpura). Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado con una cámara CCD enfriada (Orca ER) y montado en el microscopio de platina fija (Nikon E600 FN con 60X, 1,0 NA objetivo de inmersión en agua). Estas imágenes fueron superpuestas sobre las imágenes de campo claro de las rebanadas de retina correspondientes usando Adobe Photoshop. B) Imágenes de un cono y sinápticamente acoplados APAGADO célula bipolar. El axón terminal celular bipolar se ramifica en el sublamina exterior (S1) de la capa plexiforme interna cerca de la frontera con la capa nuclear interna. C) Las imágenes de un cono y celular horizontal sinápticamente de acoplamiento. Tenga en cuenta que los terminales de cono son considerablemente más grande que el terminal del axón de la varilla. Aunque las células horizontales se pueden identificar por la forma oblonga de sus cuerpos celulares, los cuerpos celulares de la EN-y las células bipolares de tipo APAGADO en la INL no pueden distinguirse fácilmente antes de la grabación. Sin embargo, uno puede apuntar desplazados cono expulsados ​​de las células bipolares que tienen los cuerpos celulares de las ONL y se pueden distinguir de los conos por la ausencia de segmentos internos y externos. La barra de escala es de 20 micras.

Figura 3. Corrientes registradas bajo la abrazadera de voltaje de cuatro neuronas retinianas diferentes en respuesta a una brillante 500 ms destello de luz blanca de luz evoca. El cono (A), células horizontales (B), y fuera de la célula bipolar (C) todos respondieron a la luz con una corriente hacia el exterior. (D) en la celda bipolar responde a los mismos estímulos de luz con una corriente hacia el interior. El ruido de la línea de base expuesta por la célula bipolar off (C) refleja una liberación continua de las vesículas sinápticas en la oscuridad que disminuye cuando los fotorreceptores hiperpolarizan a la luz. Se obtuvieron respuestas de estos cuatro celdas en las grabaciones separadas utilizando rebanadas preparadas con luz blanca. La intensidad del estímulo luminoso blanco utilizado en estos ejemplos produjo respuestas en las células bipolares y horizontales equivalentes a 580 nm flujo de fotones de 1 x 10 ⁵ fotones / seg / ² micras.

La Figura 4. Relaciones corriente-voltaje (IV) de hcélulas bipolares orizontal y apagado. (A) Panel superior, corrientes de membrana evocadas por una serie de voltaje 150 mseg -120 a 40 mV aplicado en incrementos de 20 mV (panel inferior) a una célula horizontal. Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada baja y relaciones lineales o dentro rectificar IV. (B) relación IV de una célula bipolar fuera en respuesta a una serie de pasos de voltaje. Células bipolares tienen una mayor resistencia de entrada y un IV de rectificación hacia el exterior, debido a la activación de las corrientes de potasio dependientes de voltaje.

Figura 5. Ejemplos de registro de datos apareados. (A) Registro de la corriente de calcio dependientes de voltaje de cono (Cono I _Ca ) en respuesta a una mseg paso 100 a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV (Cono V _m). De fugas y la capacitancia transitorios fueron restados utilizando un protocolo de sustracción de fugas P / 8. Una rápida corriente excitatoria post-sináptica (EPSC; HC PSC) se registró de forma simultánea desde una célula horizontal, que muestra que estos dos células están acoplados sinápticamente (B) Un EPSC se registró en una célula bipolar fuera en respuesta al mismo estímulo en otro. cono.

Discusión

La preparación rebanada retina ha demostrado ser muy útil para el análisis de los circuitos y mecanismos empleados por la retina para procesar la información visual. La capacidad de obtener grabaciones de células enteras simultáneamente de las neuronas pre y post-sináptica ha sido particularmente útil en esta tarea. Grabaciones de células enteras apareadas son mucho más fácil de lograr con las rebanadas que con-montaje plana preparaciones de retina debido a que las diferentes capas de la retina están expuestas. Por otra parte, debido a sus grandes neuronas de la retina, salamandras tienen una larga historia como una preparación de retina, por lo que proporcionan un sistema modelo particularmente bien caracterizados.

Con la práctica, rodajas saludables de salamandra retina se pueden preparar con regularidad. A pocos pasos clave pueden hacer la diferencia entre el éxito y el fracaso. 1) Asegúrese de que la cuchilla se monta en la máquina de cortar el tejido para que quede plana contra la superficie del vidrio y rebanadas limpiamente aunque tanto el tejido y underlyimembrana de nitrocelulosa ng. Si has hecho un corte limpio a través de la membrana de nitrocelulosa, usted debe oír un ligero clic cuando la cuchilla golpea la superficie de la lámina de vidrio. 2) Asegúrese de que la retina se ha adherido a la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, la retina puede flotar fuera de la membrana durante cualquier etapa de los procedimientos. 3) No exponga las rebanadas cortadas al aire, ya que esto puede dañar muchas de las células superficiales. 4) Asegúrese de que las rebanadas y la membrana de nitrocelulosa se acueste contra el portaobjetos de vidrio para que las capas de la retina se observan bajo el microscopio de disección. 5) Equilibrar las tasas de flujo de entrada y flujo de salida superfusate con el fin de evitar que desborda la cámara de grabación. Esto evita que los cambios repentinos en los niveles de solución, que puede causar movimientos bruscos del tejido. 6) Seleccionar un par saludable de las células cercanas el uno al otro. Las células con citoplasma suave son más saludables que las células con citoplasma granular. Las células más profundas en el corte son más propensos a retener con sináptica intactacontactos. 7) Asegúrese de que la punta de la pipeta no se ha roto o rozado otro tejido o escombros en el camino a las células. 8) Compruebe la resistencia pipeta para asegurarse de que no está obstruido con suciedad o una burbuja, los cuales pueden hacer que sea difícil obtener una grabación de células enteras de calidad.

En lugar de fijación de la retina a papel de filtro de nitrocelulosa, algunos investigadores incrustar retinas en un bloque de agar y utilizan un vibratomo para cortar rodajas de la retina. Aunque no hemos probado este enfoque, Kim et al. ^{11 de} discutir las ventajas de ambos enfoques. En su experiencia, el enfoque basado en agar proporciona un rendimiento más consistente de las rebanadas planas con capas retinianas bien delineados pero el enfoque del filtro basado en papel produce fotorreceptores sanos.

Los conos y bastones son responsables de la transducción de la luz en los cambios en el potencial de membrana. Con grabaciones emparejados, el potencial de membrana de varillas o conos puede ser MANIPULATED directamente y por lo tanto la capacidad de generar respuestas de la luz, si bien es útil para la identificación de tipos de células, puede no ser esencial. Por lo tanto, a menudo preparamos rodajas de luz blanca. Sin embargo, incluso si se prepara bajo una iluminación brillante, neuronas de la retina salamandra pueden generar grandes respuestas de la luz como se ilustra por las respuestas en la figura. 3. Esto es en parte debido a la relativamente gran reserva de cromóforo en el gran volumen segmento externo, pero también puede reflejar la capacidad de las células de Müller para regenerar 11-cis-retinal a los conos de ^12. Para obtener respuestas de la luz totalmente adaptados a la oscuridad, se pueden preparar los rebanadas bajo iluminación infrarroja. Para las disecciones bajo luz infrarroja, concedemos GenIII intensificadores de imagen (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para los oculares del microscopio de disección e iluminar el tejido con una linterna LED infrarrojo. Para cortar y otros procedimientos que se lleven a cabo bajo el microscopio de disección, se emplea una ima montado en la cabezaintensificador ge. Para la colocación de las pipetas de parche, visualizamos rebanadas utilizando una cámara CCD sensible a infrarrojos (por ejemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, Nueva York) montado en la posición vertical, microscopio-fase fija. Con estas precauciones, se pueden obtener respuestas barras expositoras sensibilidad única de fotones ^{6, 13.}

Una de las limitaciones de trabajar en rebanadas de retina es que los procesos celulares largo de grandes neuronas retinianas de campo pueden perder muchos de sus dendritas durante el proceso de corte. Rebanada preparativos retina son por lo tanto más útil para el estudio de la fisiología de las células en las que los contactos sinápticos implican procesos cerca del cuerpo celular. Retinas de anfibios y mamíferos comparten muchos de los mismos tipos de células, y utilizan mecanismos fisiológicos similares ^14-16. Mientras salamandra retina es un buen modelo para muchos aspectos de la retina de mamíferos, una diferencia importante parece ser la presencia de una vía de varilla dedicado en mamíferos que invoIves contactos de células especializadas barra bipolares en las células amacrinas AII ^14. Una limitación adicional de la retina salamandra es el pequeño número de herramientas genéticas desarrolladas específicamente para esta especie. Sin embargo, los anticuerpos y reactivos shRNA que se dirigen a regiones bien conservadas en otras especies pueden ser utilizados con éxito en la salamandra, al igual que muchos inhibidores de moléculas pequeñas y reactivos peptídicos. Además, con algunas modificaciones en la técnica, las rebanadas de retina se pueden preparar a partir de otras especies en las que algunas de estas herramientas son más fáciles de obtener.

Más allá de su utilidad para emparejado células enteras de grabación, la preparación rebanada retina salamandra también es susceptible a una variedad de otros enfoques. Como se discutió anteriormente, las rebanadas de retina se pueden utilizar para estudiar respuestas de la luz en combinación con diferentes protocolos de fijación de voltaje ^17. Neuronas de la retina también se pueden cargar con colorantes fluorescentes sensibles a Ca ^{2 +,} Cl ^-, o Na+ Introducida a través de la pipeta de parche o de baño-aplicación ^15,18-20. Un péptido fluorescente que se une a la cinta sináptica ²¹ puede ser introducido a través de la pipeta de parche y se utiliza para obtener imágenes de la cinta ¹⁰ o, cuando se conjugan con fluoresceína, de forma aguda y dañar selectivamente la cinta ^22. También hemos utilizado rebanadas de retina en combinación con los puntos cuánticos para vigilar los movimientos de los canales de calcio individuales en la barra y cono terminales sinápticos ^23. Por lo tanto, la rebanada de la retina vertical es una preparación experimental versátil para el estudio de mecanismos sinápticos básicas y las funciones de procesamiento únicas realizadas en la primera sinapsis en la vía de señalización visual.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue slicer	Stoelting	51425
Double edge razor blades	Ted Pella, Inc	121-6
Nitrocellulose membranes	Millipore	AAWP02500	Type AAWP 0.8 mm pore
Borosilicate glass pipettes	World Precision Instruments	TW120F-4	1.2mm OD 0.95 mm ID
Ag/AgCl pellet	Warner	E206
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 ga. Filling needle, 67 mm long