Biochip Multi-analito (MAB) Basado en electrodos selectivos de iones todo de estado sólido (ASSISE) para la investigación fisiológica

Resumen

Electrodos selectivos de iones todo de estado sólido (Assises) construidos a partir de un (CP) transductor de polímero conductor proporcionan varios meses de vida funcional en medios líquidos. A continuación, se describe el proceso de fabricación y calibración de Assises en un formato de lab-on-a-chip. El ASSISE se demuestra que ha mantenido un perfil de la pendiente casi Nernstiana tras un almacenamiento prolongado en medios biológicos complejos.

Resumen

Aplicaciones Lab-on-a-chip (LOC) en la investigación del medio ambiente, biomedicina, agricultura, biología, y los vuelos espaciales requieren un electrodo selectivo de iones (ISE) que puede soportar un almacenamiento prolongado en medios biológicos complejos ^1-4. Un ion-selectiva-todo-electrodo de estado sólido (ASSISE) es especialmente atractiva para las aplicaciones antes mencionadas. El electrodo debe tener las siguientes características favorables: fácil construcción y de bajo mantenimiento, y (potencial) de miniaturización, lo que permite el procesamiento por lotes. A ASSISE microfabricado destinado a cuantificar H ^+, Ca ^{2 +} y CO ₃ ^{2 -} iones se construyó. Se compone de una capa de metal noble del electrodo (es decir, Pt), una capa de transducción, y una membrana selectiva de iones (ISM) de la capa. Las funciones de la capa de transducción para transducir la concentración dependiente de potencial químico de la membrana selectiva de iones en una señal eléctrica medible.

Tque toda la vida de un ASSISE se encuentra a depender de mantener el potencial en la capa / membrana de interfaz de ^5-7 conductora. Para extender la vida útil de trabajo ASSISE y por lo tanto mantener los potenciales estables en las capas interfaciales, se utilizó el polímero conductor (CP) poli (3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) ^7-9 en lugar de cloruro de plata / plata (Ag / AgCl) como la capa de transductor. Hemos construido la ASSISE en un formato lab-on-a-chip, lo que llamamos el biochip multi-analito (MAB) (Figura 1).

Calibraciones en soluciones de ensayo demostraron que el MAB puede controlar el pH (pH operacional rango 4-9), CO ₃ ^{2 -} (medido rango de 0,01 mM - 1 mM), y Ca ^{2 +} (rango log-lineal de 0,01 mM a 1 mM). El MAB de pH proporciona una respuesta pendiente casi Nernstiana después de casi un mes de almacenamiento en medio de algas. Los biochips de carbonato muestran un perfil potenciométrica similar a la de un electrodo selectivo de iones convencional. Physiological mediciones se emplearon para monitorizar la actividad biológica del sistema modelo, la microalga Chlorella vulgaris.

El MAB transmite una ventaja de tamaño, versatilidad, y multiplexa analito capacidad de detección, por lo que es aplicable a muchas situaciones de monitorización confinados, en la Tierra o en el espacio.

Diseño biochip y Métodos Experimentales

El biochip es 10 x 11 mm de dimensiones y cuenta con 9 Assises designados como electrodos de trabajo (WES) y 5 Ag / AgCl electrodos de referencia (ER). Cada electrodo de trabajo (WE) es de 240 micras de diámetro y está igualmente espaciados a 1,4 mm de la ER, que son 480 micras de diámetro. Estos electrodos están conectados a las almohadillas de contacto eléctrico con una dimensión de 0,5 mm x 0,5 mm. El esquema se muestra en la Figura 2.

Voltametría cíclica (CV) y métodos de deposición galvanostáticas se utilizan para electropolymerize las películas de PEDOT utilizando un Bioanalytical Systems Inc. (BASI) soporte celular C3 (Figura 3). La contra-ion para la película PEDOT se adapta para satisfacer el ion analito de interés. Un PEDOT con poli (estirenosulfonato) contador de iones (PEDOT / PSS) se utiliza para H ⁺ y CO ₃ ^{2 -,} mientras que uno con sulfato (añadido a la solución como CaSO ₄₎ se utiliza para el Ca ^{2 +.} Las propiedades electroquímicas de la PEDOT-revestido NOS se analizaron mediante CV en disolución redox-activo (es decir, 2 mM de ferricianuro de potasio (K ₃ Fe (CN) _6)). Basado en el perfil de CV, se utilizó el análisis Randles-Sevcik para determinar el área de superficie efectiva ^10. Spin-coating a 1.500 rpm se utiliza para emitir ~ 2 micras membranas selectivas de iones gruesas (ISM) en el electrodo de trabajo del MAB (WES).

El MAB está contenido en una cámara de celda de flujo microfluídico lleno con 150 l de un volumen de medio de algas; las almohadillas de contacto están conectados eléctricamente al sistema de BASI (Fig.Ure 4). La actividad fotosintética de Chlorella vulgaris se controla la luz ambiente y la oscuridad.

Protocolo

1. Preparación de poli (3,4-etilendioxitiofeno): Poly (sodio 4-estirenosulfonato) (PEDOT: PSS) Solución Electropolimerización de H ⁺ y CO ₃ ^{2 -} iones

1. Añadir 70 mg de poli (sodio 4-estirenosulfonato) (Na ⁺ PSS ^-) a 10 ml de agua desionizada (DI) y agitar hasta que esté completamente disperso (aproximadamente 10 segundos).
2. Añadir 10,7 l 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) a la solución en 1,1 y agitar hasta que la solución se mezcla completamente.

2. Preparación de poli (3,4-etilendioxitiofeno): Sulfato de calcio (PEDOT: CaSO ₄₎ Solución Electropolimerización de iones ^{Ca2 +}

1. Añadir 136 mg de sulfato de calcio (CaSO ₄₎ a 10 ml de agua DI y vórtice, la solución no se dispersará por completo y aparece lechoso.
2. Añadir 10,7 l EDOT a la solución en 2.1 y agitar hasta que esté completamente mezclado.

3. Electropolimerización de PEDOT-basadoConductores de polímero

1. Un Bioanalytical Systems Inc. (BASI) soporte de la celda C3 (Figura 3) y una CE épsilon potenciostato / galvanostato se utilizan para formar la celda electroquímica para electropolimerización. Coloque el EDOT: solución de electropolimerización PSS en la célula electroquímica y la burbuja de nitrógeno durante 20 min para eliminar el oxígeno disuelto.
2. Ahora cortar un platino gasa en la posición del electrodo opuesto de la celda electroquímica. A continuación, recortar el MAB en la posición del electrodo de trabajo de la célula electroquímica con los electrodos de trabajo se enfrenta el platino-gasa. Ajuste de la profundidad del MAB de manera que sólo los electrodos circulares están sumergidos en el PEDOT: PSS solución de electropolimerización. Evite el contacto de la solución con las almohadillas de contacto eléctrico cuadrados.
3. Coloque un cloruro de plata / plata saturado BASI (Ag / AgCl) electrodo en la posición del electrodo de referencia de la celda electroquímica. Asegúrese de que el electrodo de referencia no se encuentra en entre el trabajador y counteelectrodos r.
4. Para PEDOT: PSS deposición: Burbuja de la celda electroquímica durante 20 minutos, y el uso de la CE epsilon potenciostato / galvanostato para ejecutar una sola voltamograma cíclica de 0 V - 1.1 V con una velocidad de barrido de 20 mV / s sobre una escala de ± 100 μA.
5. Para PEDOT: CaSO ₄ deposición: Burbuja de la celda electroquímica durante 20 minutos, y el uso de la CE epsilon potenciostato / galvanostato correr cronopotenciometría a 814 nA a 30 min.

4. Voltametría cíclica de conjugados polímero PEDOT basadas en K ₃ Fe (CN) ₆

1. Realice los pasos 3.1 hasta 3.3 anterior.
2. Utilice la CE epsilon potenciostato / galvanostato correr voltamogramas ciclos individuales de -653 mV a 853 mV con diferentes velocidades de barrido de (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / s sobre una escala de ± 10 μA .

5. Protocolo de funcionalización de la superficie

1. Depósito polímero conductor conjugado específico para los iones de interés como en el paso 3.
2. Aplicar membrana selectiva de iones como en el paso 6.

6. Aplicación de la membrana selectiva de iones

1. Centro del MAB en el vacío spinner mandril.
2. Depósito de 100 l de membrana en el centro del MAB y correr.
3. Spin-capa de membrana selectiva de iones con una recubridora de rotación a 1500 rpm durante 30 segundos con una rampa de 5 segundos arriba y hacia abajo.
4. Aspirar el MAB mediante revestimiento por centrifugación durante 30 min y hornear el chip en un horno a 70 ° C durante 20 min.

7. Calibración de PEDOT-PSS conductores de polímero conjugado con el pH y carbonato (CO ₃ ^{2 -)} membrana selectiva de iones

1. Condición del MAB durante la noche en 10 mM de bicarbonato de sodio _(NaHCO3) y cloruro de potasio 5 mM (KCl) en los medios de comunicación de algas.
2. Inserte el MAB en el soporte de chip celda de flujo de microfluidos.
3. Inyectar la solución de ensayo de 5 ml con valor de pH o la concentración inicial (por ejemplo, pH 4 o 10 mM para el CO ₃ ^{2 -).} Retire bubbles desde el soporte de chip de celda de flujo.
4. Coloque el soporte de chip de celda de flujo en el aparato eléctrico de célula de flujo.
5. Abra el software epsilon CE y entrar en el modo potencial de circuito abierto (OP). Ajuste el tiempo de 300 minutos, la escala de tensión de ± 1 V, y la frecuencia de corte a 10 kHz, y registrar el valor de cada 2 s.
6. Deje que el MAB estabilice (busque una línea plana) antes de continuar con el proceso de calibración.
7. Una vez que el MAB se estabiliza, enjuague la celda de flujo con la solución de prueba y se inyecta la siguiente concentración que ser calibrado (pH 5 ó 25 mM CO ₃ ^{2 -).} Asegúrese de que no haya burbujas se les permite entrar en la celda de flujo. Repetir los pasos 7.5 y 7.6 para pH 6, 7, 8, y 9 o CO ₃ ^{2 -} concentraciones de 50, 75, 100, 250, 500, 750, y 1000 m.
8. Después de la última concentración se ha ejecutado, retire el MAB y secar con aire nitrógeno.
9. Vuelva a colocar el MAB en la solución de acondicionamiento fresco hasta el próximo uso.

8. Calibración de PEDOT: CaSO ₄ conductores de polímero conjugado en _CaCl2

1. Condición del MAB durante la noche en 7 ml de 0,1 M CaCl ₂ y 10 mM _NaNO3.
2. Siga los pasos similares a 07.02 a 07.10. En la etapa 8.3, sustituir solución de ensayo carbonato con una concentración inicial de 0,01 mM CaCl _2. Repita el procedimiento para las concentraciones de ensayo de solución de 0,05, 0,1, 0,5, 1 y 10 mm.

Resultados

Un ejemplo de un voltamograma (CV) resultado cíclico de PEDOT: PSS y su correspondiente pico de corriente catódica (i _p) frente a la velocidad de barrido (v _1/2) se muestran en las figuras 5a y 5b, respectivamente. PEDOT: CaSO ₄ en diferentes velocidades de barrido y su corriente de pico catódico no se muestran. Utilizando el análisis de Randles-Sevcik ^10, las áreas superficiales efectivas de la PEDOT: PSS contacto...

Discusión

El MAB biochip consiste en assises que se construyen a partir de un mecanismo de apoyo encima de una capa de transducción de conjugado CP PEDOT basado en un electrodo de Pt, la combinación de que transduce la concentración iónica de interés a una señal eléctrica medible. Un potencial de electrodo estable se define por tanto la capa de PP y la capa de ISM. Ambas capas también determinan el curso de la vida de trabajo del MAB y la calidad (ruido, la deriva) de la señal eléctrica medida.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.