Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Resumen

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Resumen

Cromatina immunoprecipitation (CHIP) es un método ampliamente utilizado para la determinación de las interacciones de las diferentes proteínas con el ADN en la cromatina de las células vivas. Los ejemplos incluyen la secuencia específica de unión al ADN, histonas factores de transcripción y sus diferentes estados de modificación, enzimas tales como polimerasas de ARN y factores auxiliares, y los componentes de reparación del ADN. A pesar de su ubicuidad, hay una falta de up-to-date, metodologías detalladas, tanto para la preparación del banco de material y para un análisis preciso permitir mediciones cuantitativas de interacción. Debido a esta falta de información, y también porque, como cualquier inmunoprecipitación, las condiciones deben ser re-optimizado para los nuevos conjuntos de condiciones experimentales, el chip de ensayo es susceptible a resultados imprecisos o mal cuantitativa.

Nuestro protocolo se deriva en última instancia del trabajo seminal en el factor de transcripción: interacciones ADN ^1,2, pero incorpora una serie de mejoras a la sensividad y la reproducibilidad de difíciles a obtener tipos de células. El protocolo se ha utilizado con éxito ^3,4, tanto utilizando qPCR para cuantificar enriquecimiento de ADN, o el uso de una variante semi-cuantitativa de la siguiente protocolo.

Este análisis cuantitativo de material amplificado por PCR se realiza computacionalmente, y representa un factor limitante en el ensayo. Controles y otras consideraciones importantes incluyen el uso de un anticuerpo de isotipo, así como la evaluación de una región de control del ADN genómico, tal como una región intergénica predicho no estar obligado por la proteína en estudio (o no anticipado para mostrar los cambios en virtud las condiciones experimentales). Además, una curva estándar de material de entrada para cada muestra de chip se utiliza para obtener los niveles máximos absolutos de enriquecimiento en el material experimental. El uso de las curvas de calibración ayuda a tener en cuenta las diferencias entre los conjuntos de cebadores, sin importar lo cuidadosamente que están diseñados, así como la eficiencia de diferentescias en todo el rango de concentraciones de la plantilla para un solo grupo de cebadores. Nuestro protocolo es diferente a otros que están disponibles en el ^5-8 que cubrimos ampliamente la fase posterior análisis.

Protocolo

1. Aislamiento de ratón esplénica ingenuo CD4 de células T

1. Sacrificar el ratón de una manera humana en consonancia con los protocolos de uso del Comité (IACUC) Institucional Cuidado de Animales y. Disección del bazo y colóquelo en un plato de Petri que contiene 10 ml de DMEM con 10% de SFB.
2. Machacar el bazo usando extremos helados de dos placas de vidrio para liberar los esplenocitos. Transferir la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml.
3. Recoger las células por centrifugación a 200 xg (~ 1200 rpm para una centrífuga clínica con un diámetro típico del rotor) durante 5 min a 4 ° C.
4. Resuspender las células en 2 ml de tampón ACK para lisar las células rojas de la sangre, 1 min a temperatura ambiente (RT). Detener la reacción mediante la adición de 8 ml de DMEM con FBS al.
5. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
6. Resuspender las células en 5 ml de DMEM que contenía FBS y pasar a través de un filtro de malla de 70 micras (BD Falcon, Cat # 352350). Contar las células y procederpara el aislamiento de células T CD4 + naïve utilizando un kit de aislamiento de CD4 (Miltenyi, Cat # 130-095-248) utilizando las instrucciones del fabricante. Recoger ingenuos células T CD4 por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 10 ml de DMEM con FBS al.

2. Preparación de la cromatina

1. Añadir 37% de formaldehído a una concentración final de 1% a la suspensión celular en DMEM y agite con cuidado a temperatura ambiente (por ejemplo, utilizando un Nutator) durante 15 min para reticular complejos ADN: proteína.
2. Deja de reticulación mediante la adición de 1 M de glicina a una concentración final de 125 mM. Continuar a la roca durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de inhibidores de proteasas que contienen PBS enfriado con hielo. Lavar con inhibidores de la proteasa que contienen helado de PBS 3 veces en total y recoger las células por centrifugación a 4 ° C.
5. Resuspender las células en 1 mltampón de lisis celular de hielo frío que contiene inhibidores de la proteasa. Incubar en hielo durante 15 min. La eficiencia de la lisis de las células se puede determinar mediante la resuspensión de una pequeña alícuota de las células en solución de azul de tripano al 0,4% (Sigma, Cat # T8154) y la observación con un microscopio.
6. Recoger los núcleos por centrifugación a 200 xg (normalmente ~ 1200 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante.
7. Resuspender los núcleos en 500 l de tampón de lisis nuclear que contiene inhibidores de la proteasa. Incubar en hielo durante 15 min.
8. Sonicar las células por medio de un aparato de ultrasonidos Misonix 3000, tamaño de la sonda 1,6 mm: Nivel de salida 4, 15 seg ráfaga, 4 veces en el hielo. Cada muestra debe ser enfriado en hielo durante 1-2 minutos antes de la sonicación de nuevo para evitar el sobrecalentamiento de las muestras. El recalentamiento puede causar la reversión de enlaces cruzados.
9. Centrifugar la cromatina sometida a ultrasonidos a 16.000 xg (~ 13.200 rpm en una microcentrífuga) durante 5 min a 4 ° C.
10. Tomar una alícuota de 20 l supern claraatant, añadir colorante de carga de ADN y comprobar el ADN sonicado por electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% (tamaño ideal de ADN sonicado para la mayoría de aplicaciones es de 200-500 pb).
11. Determinar la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. Cromatina esquilada se puede utilizar inmediatamente para establecer la reacción de inmunoprecipitación de cromatina y se almacenan a -80 ° C. Normalmente se obtiene 7,5-10 g de ADN 2-3 x 10 ⁶ células T CD4 purificadas por ratón.

3. Inmunoprecipitación de cromatina (Todos los pasos deben llevarse a cabo a 0-4 º C)

1. Diluir sonicated cromatina a una concentración de ADN de mg / ml 5-10 (volumen total = 1 ml) en tampón de dilución chip con los inhibidores de la proteasa.
2. Guardar 100 l (10%) como entrada. Almacenar en hielo.
3. Alícuota de 450 l cada uno en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml etiquetados como control de isotipo (IgG de conejo o ratón) y anticuerpo de interés. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo, una sola contr isotipool será suficiente para realizar este análisis. Usted tendrá múltiples controles de isotipo si se utilizan anticuerpos de una fuente animal diferente o isotipo.
4. Añadir 2-5 g de anticuerpo específico, dependiendo de la especificidad del anticuerpo usado, o control de isotipo a los tubos respectivos.
5. Roca los tubos utilizando un Nutator durante la noche a 4 ° C para permitir la formación de complejos de la cromatina-anticuerpo.
6. Añadir 25 l de perlas de proteína G magnéticos (01:01 emulsión de gránulos en suspensión) a la mezcla anterior y permitir a la roca durante al menos 2 horas a 4 ° C. Cuentas de nuestro proveedor se puede utilizar directamente.
7. Coloque los tubos de microcentrífuga en un soporte magnético y permiten que las perlas se recogen en la parte magnetizada.
8. Retire con cuidado la solución por aspiración sin molestar a los granos.
9. Añadir 1 ml de solución de lavado bajas sal y deje mecer suavemente durante 5 min en un Nutator. Recoger las perlas usando un soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez.
10. Añadir 1 ml de solución de lavado de sal y se deja mecer por 5 min en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez.
11. Añadir 1 ml de solución de lavado de cloruro de litio y permitir a la roca durante 5 minutos en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez. El uso de LiCl mejora la eliminación eficaz de las interacciones no específicas de cromatina con las perlas.
12. Añadir 1 ml de solución de TE y se deja mecer por 5 min en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado.
13. Eluir el ADN a partir de las perlas mediante la adición de 250 l de tampón de elución. Roca durante 15 minutos a temperatura ambiente. Pipetear fuera el líquido eluido y guardar este material en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Repetir una vez más y se combinan tanto las elusiones. Deseche las cuentas.
14. Para invertir las reticulaciones añaden 5 M de NaCl a una concentración final de 0,3 M y 1 l de RNasa A (20 m g / ml) al ADN eluido. Añadir 400 l de tampón de elución a las entradas guardadas en la etapa 3.2, para hacer que el volumen de 500 l. Para las entradas de añadir NaCl hasta 0,3 M, 1 l de RNasa A, 10 l de EDTA 0,5 M, 20 l de 1 M Tris-HCl, pH 6,5 y 1 l de proteinasa K (20 mg / ml).
15. Incubar los tubos durante la noche a 65 ° C en un bloque de calentamiento en seco. Para evitar la evaporación de las muestras, sello o colocar un peso en los tubos para evitar que se abra. Un horno de hibridación también se puede utilizar.
16. Deje enfriar los tubos a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de etanol al 100% y se incuba 2 horas-durante la noche a -80 ° C para precipitar el ADN.
17. Centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 15 min para sedimentar el ADN. Lavar el sedimento de ADN una vez con etanol al 70% y secado al aire el sedimento. Resuspender el sedimento de ADN en 100 l de agua destilada tratada en autoclave.
18. Purificar ADN utilizando columnas QIAquick Spin y eluyen en el volumen total de 50 l de tampón de elución. Este ADN está listo para su uso para la PCR.

"> 4. Preparación de la reacción de PCR (Todos los pasos deben llevarse a cabo en el hielo)

1. Recoge todas las muestras de ADN de muestras de entrada y chip correspondiente. También, recoger todos los reactivos y cebadores para la región objeto de PCR, así como una región de control. Use un "hotstart" Taq ADN polimerasa. Vamos a utilizar un ensayo basado en SYBR Green-para cuantificar la amplificación de ADN en este procedimiento, pero los kits qPCR Mastermix se puede utilizar si es necesario.
2. Hacer una dilución en serie de ADN de entrada para generar una curva estándar en el análisis de qPCR: por ejemplo, 10%, 1%, 0,1% y 0,01% en tampón de elución (de las columnas QIAquick Spin en el paso 3,18). El grado de concentración y aumento de la plantilla conjunto curva estándar pueden variar en función de los niveles esperados de enriquecimiento chip, etc dispensación 10 l de muestras de ADN de entrada en los respectivos pocillos de una placa de 96 pocillos (Genemate, cat # T-3182-1 ), por duplicado.
3. Dispensar 10 ml de ADN de chip de control de isotipo, así como anticuerpos específicos en la respectivapozos, por triplicado.
4. Hacer una "mezcla maestra" que contiene cualquiera de los cebadores o cebadores de control de destino (0,1 mM concentración final de cada cebador) y prescindir de 10 l en pocillos respectivos. Por ejemplo, en la plantilla a continuación dispensar maestro de la mezcla que contiene cebadores específicos en los pocillos marcado en verde y dispensar la mezcla principal con cebadores de control en los pocillos marcados en rojo.
5. Cubrir la placa de PCR con película de sellado plástico óptico y centrifugar a 500 xg en una centrífuga clínica (~ 1200 rpm) durante 1 min a temperatura ambiente para recoger todo lo que en la parte inferior del pozo.
6. Inicie la reacción de PCR. Vamos a utilizar el LightCycler 480 II (Roche) que operan LightCycler 480SW 1.5 software para ejecutar la qPCR en este ejemplo.

Pre-incubación: 1 ciclo de: 95 º C / 5 min.

Amplificación: 40 a 45 ciclos de: 94 º C / 5 seg, 60 ° C / 5 seg, 72 ° C/10 seg (temperatura de hibridación debe ser 2-3 º C inferior a la temperatur fusióne de los cebadores).

Curva de fusión: 1 ciclo.

Enfriamiento: 1 ciclo.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

La

10% de entrada

10% de entrada

Isotipo

Específico

B

1% de entrada

1% de entrada

Isotipo

Específico

C

0,1% de entrada

0,1% de entrada

Isotipo

Específico

D

0,01% de entrada

0,01% de entrada

E

10% de entrada

10% de entrada

Isotipo

Específico

F

1% de entrada

1% de entrada

Isotipo

Específico

T

0,1% de entrada

0,1% de entrada

Isotipo

Específico

H

0,01% de entrada

0,01% de entrada

Verde: Use cebadores de la región objetivo.

Rojo: Use cebadores de la región de control.

5. Análisis

1. Programa de software de la qPCR para la cuantificación de la cantidad absoluta de ADN. Es importante destacar que, el uso de una curva estándar para interpolar las cantidades de ADN en las muestras específicas y isotipo desconocidos permite la evaluación y la congruencia de la calidad y la eficiencia de todo el cebador se pone sobre la gama de concentraciones que se encuentran en las muestras. Por otra parte, también proporciona una mortalidade método fiable para convertir los valores Cq (C _t o C _p) a los resultados de enriquecimiento veces en relación finales que los métodos usingΔΔCq y afines.
2. Ir al editor de la muestra y marcar los pocillos que contienen muestras de entrada de varias diluciones (10%, 1%, 0,1% y 0,01%) con sus valores de la curva estándar. También etiquetar los pocillos con muestras de chip desconocidos, tal y como la placa de PCR se presenta. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, designar subconjuntos correspondientes a las reacciones de cada par de cebadores, valor de la curva estándar y la muestra experimental y control de isotipo correspondiente.
3. En el software LightCycler, ir al editor de subconjunto y marcar los subconjuntos incluyendo los pocillos con muestras de entrada, así como las muestras de chip desconocidos. Las muestras desconocidas se cuantificaron utilizando la curva estándar generada a partir de las concentraciones conocidas de muestras de entrada para el análisis. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, designado subconjuntos corresponding a todas las reacciones para cada uno de los pares de cebadores.
4. Después de la amplificación por PCR es completa, realizar el análisis con "Abs Quant/2nd Derivado Max" y seleccionar el subconjunto de análisis y pulse Aceptar. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, convertir el valor Cq a la cantidad de ADN en cada subgrupo.
5. Pulse "Calcular", que va a generar la curva estándar utilizando concentraciones conocidas de las muestras de entrada y mostrará la cantidad absoluta de ADN presente en las muestras desconocidas.
6. Si la calidad del ADN cizallado es buena, y si los cebadores se unen específicamente a la región objetivo, la eficiencia de PCR debe estar cerca de 2.
7. Realizar un análisis de la curva de fusión con "Tm Calling" para el mismo subconjunto, si está disponible. Un único pico indica que sólo un producto específico se amplificó. La amplificación de ADN específico también se puede probar mediante electroforesis del producto de PCR junto con escalera de ADN a través de un gel de agarosa.
8. Exportar datos como por tabuladoresarchivo de texto delimitado, que se puede abrir en Microsoft Excel para su posterior análisis.
9. Utilizando Microsoft Excel, divida la cantidad de ADN para el anticuerpo específico con el control de isotipo de primers específicos. Repita este paso para los cebadores de la región de control. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo para diferentes inmunoprecipitaciones, normalizar cada uno de estos con los valores de la misma control de isotipo. Por otra parte, si se utilizan múltiples pares de cebadores específicos, las cantidades de ADN de un único par de cebadores de control de conjunto se deben utilizar para la normalización de cada objetivo (Figuras 1 y 2). Los valores de salida representan el anticuerpo inmunoprecipitación veces enriquecimiento específico en cada ubicación con respecto a los anticuerpos no específicos fondo inmunoprecipitación.
10. Divida el enriquecimiento veces (al isotipo control) de primers específicos con el enriquecimiento veces (al isotipo control) de cebadores de la región de control para obtener el enriquecimiento relativo a unregión no unida de control (Figura 1). Es importante destacar que, en cuenta que debido a la generación de las curvas de calibración con el total de ADN de entrada para cada muestra, cada uno de los valores interpolados a partir de inmunoprecipitación por encima de las curvas estándar ya están normalizados a, y se expresaron como, la fracción del total de entrada por el software de la máquina.
11. Si el rigor de los tampones utilizados para la inmunoprecipitación o lavado es demasiado alta, es posible que se observó amplificación robusta a partir de muestras inmunoprecipitadas con anticuerpos específicos, mientras que la amplificación del control de isotipo inmunoprecipitó no se observaron muestras. En tal escenario, es mejor que restar la cantidad de chip de control de isotipo de chip de anticuerpos específicos tanto para la región específica y la región no unida. Enriquecimiento relativo puede calcularse dividiendo la diferencia de la región de orientación por diferencia de región no unida (Figura 3).

Resultados

La inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) de protocolo que aquí se presenta controles de las diferencias, en su caso, de la cantidad de ADN utilizado en la PCR mediante el uso de un par de cebadores que amplifica una región no unida del genoma, lo que sirve como un "control de carga". En el ejemplo mostrado en la Figura 3, se ha utilizado la región de codificación del gen Actb ratón como una región no unida a nuestra proteína de interés y el sitio de unión del factor de tra...

Discusión

El protocolo anterior proporciona un método robusto de cuantificar con precisión enriquecimiento de ADN a partir de linfocitos primarios que utilizan chip. Una de las principales razones de robustez en este protocolo es la inclusión de repeticiones biológica. El protocolo anterior utiliza tres repeticiones, el enriquecimiento de la cual se calcula de forma independiente. Las salidas se promedian para proporcionar un grado de enriquecimiento y las desviaciones estándar calculadas para proporcionar una medida de la v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment