La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

Resumen

Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente In situ a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.

Resumen

En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, "libre") transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.

Introducción

En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de ^1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción ^3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras condiciones químicas se requiere para disociar los ribosomas de ER vesículas derivadas, que pueden bloquear la potencialmente delicada ARNm-ER asociación, estos estudios no fueron concluyentes, proporcionando evidencia de ^5-8 y ^9,10 contra ribosomal independiente de anclaje de ARNm al ER .

Para superar estos problemas, se ha desarrollado un protopara aislar y col imagen ER-enlazados mRNAs. Este procedimiento consiste en un tratamiento de extracción suave, que elimina eficazmente todo el contenido citoplasmático de la célula (incluyendo los no consolidados ER-mRNAs) y al mismo tiempo preservar la morfología de ER y de todas sus moléculas asociadas. Usando este protocolo, hemos demostrado que un subconjunto de mRNAs están dirigidos y después se mantuvo en el ER independientemente de los ribosomas o la traducción ^11.

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Protocolo

1. Preparación de los materiales para la extracción

1. Preparación de las células
   1. Semillas células de cultivo de tejidos en cubreobjetos tratados con ácido para al menos un día antes del experimento. Usamos COS-7 o U2OS, como estas dos líneas celulares exhiben producción de proteína secretada robusto y tener una bien definida ER. Tenga en cuenta que para lograr una eficiencia de extracción de alta, las células no debe exceder de 80% de confluencia en el cubreobjetos en el día del experimento.
   2. Si un ARNm exógeno particular, está siendo investigado, las células se transfectan un día después de la siembra con plásmidos que contienen el gen de interés utilizando protocolos estándar de transfección. Las células entonces se les permite expresar el mRNA durante al menos 18 horas antes de la extracción.
2. El tratamiento de las células con inhibidores de la traducción
   1. Para probar el efecto de los ribosomas intactos en el mantenimiento de los ARNm de asociación con el ER, las células pueden ser tratadas con inhibidores de la traducción que alteran la asociaciónde los ribosomas con el ARNm de ^11.
   2. Los inhibidores de la iniciación de la traducción, tales como homoharringtonin (HHT), pactamycin, o 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-metil-(MDMP), prevenir nuevos ribosomas de asociarse con la transcripción mientras que simultáneamente permite dedicadas a ribosomas traducción completar ^12-14. Puesto que la velocidad de traducción para la mayoría de las proteínas en células de mamíferos es 5 aminoácidos por segundo, independientemente del uso del codón de ARNm o longitud ^15, un tratamiento de 30 min se debe borrar ribosomas off de mensajes con marcos de lectura abiertos mientras 27.000 nucleótidos (que codifica para proteínas siempre que 9.000 aminoácidos).
   3. Inhibidores como puromicina promover la eyección prematura de la cadena naciente y así interrumpir polisomas ^12. Sin embargo, para interrumpir completamente la asociación de los ribosomas a puromicina tratados con el ARNm, los quelantes tales como EDTA de magnesio se añaden al tampón de extracción digitonina ^11.
   4. En este experimento, las células se tratan con puromicina 200 mM, 5 mM HHT, o medio de control durante 30 min antes de la extracción.
3. Preparación de tampón de extracción digitonina. Para visualizar ER-localizada mRNAs sin la obstrucción de la libre (es decir, no citoplásmicos ER-asociados) transcripciones, que selectivamente permeabilizar las células con digitonina, un glucósido esteroide que interacciona preferentemente con 3β-hydroxysterols. A bajas concentraciones, digitonina permeabiliza selectivamente porciones de la membrana plasmática, causando 'permeabilidad' ^16. Por el contrario, la membrana del RE y envoltura nuclear, que son pobres en colesterol, se dejan intactos ^16,17.
   1. Digitonina (Sigma Aldrich) en polvo se disuelve en agua destilada a 5% peso / volumen y esta solución madre se dividió en alícuotas en volúmenes pequeños y se almacena a -20 ° C. En nuestra experiencia, múltiples ciclos de congelación-descongelación disminuye la eficiencia de digitonina disuelve.
   2. Una solución stock de10x tampón de CHO (1x concentración de la solución de trabajo: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM de MgCl _2, 2 mM EGTA y 150 mM de sacarosa) se prepara con RNasa libre de reactivos y se almacenó a -20 ° C. Una solución de trabajo (1x tampón de CHO) se prepara diluyendo la solución madre con RNasa libre de agua y se puede almacenar a 4 ° C.

2. Extracción digitonina

1. Preparación de soluciones de aspirado
   1. Un bloque de calentamiento con una superficie plana es pre-calentado a 40 ° C y se mantuvo a esta temperatura durante la extracción.
   2. Para formar una superficie de trabajo plana, que es libre de RNasa, el bloque de calentamiento se humedece con un poco de agua y se cubrió con un trozo nuevo de Parafilm M (Bemis Company, Inc). Las burbujas de aire entre la lámina y el bloque de parafina calefacción se suavizan con RNasa libre de guantes y Kimwipes (VWR).
   3. 1x tampón de CHO se calienta a 37 ° C por incubación en un baño de agua.
   4. 6-y las placas se utilizan para lavary fijar las células. Cada fila de 3 pozos se utiliza para un cubreobjetos. Para los dos primeros pocillos de la fila, 2 ml de tampón de CHO calentada se añade. Para el último pocillo, 2 ml de la solución de fijación (paraformaldehído PBS + 4% (Ciencias de microscopio electrónico)) se añade. Esta bandeja puede ser almacenado en la incubadora a 37 º C hasta que las células están listas para la extracción.
   5. Solución de digitonina extracción se prepara por dilución de la solución stock de digitonina al 0,025% con tampón de CHO caliente justo antes de su uso. Una vez más en cuenta que para las células tratadas con puromicina, el tampón de extracción, además, debe contener 20 mM EDTA para interrumpir eficazmente ribosomas ^11. Gotas de 100 l de la solución de extracción se colocan en el bloque de calentamiento Parafilm cubierta inmediatamente antes de la extracción.
2. Digitonina Extracción y fijación de células
   1. Eliminar las células de la incubadora a 37 º C.
   2. Durante el proceso de extracción, los cubreobjetos son manipulados con la ayuda de fórceps de jewler. Conlas pinzas recoger el cubreobjetos y sumergirla en el buffer de CHO primero y luego el segundo pozo que contiene para lavar el medio de cultivo.
   3. Rápidamente Seque el exceso de tampón de la parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe e inmediatamente colocar el cubreobjetos, lado de la celda hacia abajo, en la solución de extracción.
   4. Después de 10 segundos, levante el cubreobjetos con las pinzas e inmediatamente transferir, lado de la celda hacia arriba, hacia el pozo que contiene el tampón de fijación 4% paraformaldehído.
   5. Deje incubar la muestra en fijador durante al menos 15 min a temperatura ambiente.
3. Preparación de las células de control no extraído. Para determinar la cantidad total de ARNm en el citoplasma que es una buena idea para preparar una muestra de control no extraído.
   1. Las células cultivadas sobre cubreobjetos se preparan como anteriormente (véase la sección 2,2), excepto que la etapa de extracción de digitonina (2.2.3) se omite.
   2. Después de la fijación, las células no-extraídos deben ser permeabilizaron en PBS + 0,1% de TritonX-100 durante 15 min a temperatura ambiente.

3. FISH tinción

1. El diseño de sondas para la hibridación in situ fluorescente
   1. La secuencia primaria del mRNA de interés se pliega usando ARN software de predicción de estructura secundaria, tales como RNAstructure 5,0 ^18. Los pliegues de ARNm se evaluó visualmente para identificar una región de aproximadamente 50 nucleótidos que está libre de grandes estructuras secundarias.
   2. El complemento inverso de esta región se sintetiza con un fluoróforo Alexa546 unido al extremo 5 'de la sonda (adquirido de DNA Technologies Integrados).
   3. La sonda se diluyó con agua libre de ARNasa a una concentración stock de 100 mM que se pueden almacenar a -20 ° C.
2. La tinción con sondas FISH
   1. Tenga en cuenta que aunque las células digitonina-extrajeron no requieren permeabilización adicional, el tratamiento de estas muestras fijadas con 2 ml de 0,1% de Triton X-100 diluido enPBS durante 15 min a temperatura ambiente antes de la tinción FISH, ayuda a reducir la señal de fondo.
   2. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS para eliminar cualquier paraformaldehído residual o Triton X-100.
   3. Las células se lavan dos veces con formamida 25% a 60% en 1X tampón de citrato sódico (150 mM NaCl y 15 mM citrato de sodio). En general, para las sondas específicas de peces que son 50-60 nucleótidos de longitud, 60% de formamida se utiliza, pero para la tinción de ARNm poli (A) con sonda de oligo FISH (dT), el nivel de formamida se reduce hasta 25%.
   4. Para preparar la cámara de tinción, la parte inferior de una placa de Petri de 150 mm se cubre con agua y un trozo de Parafilm es flotó en el agua. El agua se elimina haciendo girar el plato sobre, permitiendo así que el parafilm para adherirse a la parte inferior del plato. Las burbujas de aire se retiran manualmente con Kimwipes.
   5. Para cada cubreobjetos para ser teñidos, pipetee una gota 100 ml de la solución de hibridación que contenía la sonda FISH de interés sobre la parafilm en la cámara de tinción. La sonda FISH madre se diluye con formamida 25% a 60% en tampón de hibridación (SSC 1x, 100 mg / ml de sulfato de dextrano, 1 mg / ml de ARNt de levadura, complejo de vanadilo ribosida 5 mM, 25-60% de formamida) a una concentración de trabajo de 0,2 m. Tenga en cuenta que la cantidad de formamida debe ser optimizado para la sonda particular que se usa y está presente en la misma concentración como en el tampón de lavado de SSC (ver paso 3.3.3).
   6. El cubreobjetos se coloca boca abajo sobre la celda lateral de la solución de FISH en la cámara de tinción y se incubaron durante 5-24 horas a 37 ° C en una cámara humidificada, tales como el cultivo de tejidos incubadora.
3. El lavado y el montaje de las muestras teñidas
   1. Para preparar un área de lavado RNasa libre, establecer una franja de parafina sobre una superficie plana y nivelada, como una mesa de laboratorio. Para asegurarse de que la parafina es plana, húmeda la superficie nivelada, coloque la parafina en la parte superior y quitar manualmente las burbujas de aire con Kimwipes.
   2. La cámara de tinción essacaron de la incubadora y se colocan en una superficie plana. Los cubreobjetos se luego flotó pipeteando aproximadamente 500 l de tampón de lavado FISH cerca del borde de cada cubreobjetos. La solución se elaborará en el medio del cubreobjetos y la parafina a través de la acción capilar.
   3. Para cada cubreobjetos, 1 ml de tampón de lavado (1x SCC con 25-60% de formamida, consulte el paso 3.3.3) se pipetearon sobre el parafilm zona de lavado (véase la etapa 3.4.1).
   4. Utilizando pinzas, los cubreobjetos se retiraron de la cámara y cada tinción se coloca sobre la gota de tampón de lavado y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. El proceso de lavado se repite 3 veces.
   5. Portaobjetos de vidrio se lavan con 70% de etanol, y se secó con Kimwipes.
   6. Para cada cubreobjetos, 25 l de solución de montaje (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) se pipetea sobre el portaobjetos. Tenga en cuenta que esta solución contiene 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que las manchas de ADN y permite la visualización de los núcleos.
   7. Usifórceps ng y Kimwipes, la parte posterior del cubreobjetos y se seca el exceso de tampón de lavado FISH es borrado apagado sin secar la muestra. Cada cubreobjetos se coloca lado de la célula hacia abajo, sobre la gota de solución de montaje.
   8. Muestras montadas se etiquetan y se puede almacenar a 4 ° C.

4. Imagen y Cuantificación

1. Proyección de imagen
   1. Un microscopio de epifluorescencia se utiliza para la imagen de las células después de la tinción con FISH. La célula transfectada se puede diferenciar de las células no transfectadas por señal brillante de fluorescencia en el canal apropiado. Idealmente, cada campo adquirido también contendrá un celular sin transfectar a ser utilizado para determinar la fluorescencia de fondo para la cuantificación.
   2. Para cada imagen de campo de los peces y el canal de DAPI se adquieren. Además, si las células se co-teñidas con los marcadores de proteínas, una imagen del canal de inmunofluorescencia también se adquiere. Tenga en cuenta que la extracción de digitonina también se puede utilizarpara visualizar ER enlazados a ribosomas y proteínas ^11.
   3. Para asegurarse de que las intensidades de fluorescencia entre los campos se puede comparar, el tiempo de exposición para cada canal debe permanecer constante para cada conjunto de experimento.
   4. Una vez más para asegurarse de que la intensidad de fluorescencia entre las células en cubreobjetos diferentes pueden ser comparados, los cambios del día a día en la intensidad epiluminiscencia o deterioro en la señal de FISH debe reducirse al mínimo mediante imágenes de todos los cubreobjetos en una sola sesión.
2. Cuantificación. Para cuantificar la cantidad de ARNm que se localiza en el ER, se utiliza el software Nikon Elemento NIS. Sin embargo otro software de análisis de imagen tal como ImageJ se puede utilizar.
   1. Con la herramienta Nikon NIS elemento de análisis de imagen, la periferia de la célula y el núcleo se describen como región separada de Interés (ROI).
   2. Para cada retorno de la inversión, la intensidad de fluorescencia (I _T para la intensidad total de células y _N para elintensidad nuclear) y el área (A y _{T N} A) se registran y se exporta a una hoja de cálculo de Excel.
   3. Para cada imagen, la intensidad de fondo fluorescente (I _B) se determina mediante el registro de la intensidad de una célula no transfectadas. Si poli (A) los niveles de ARNm están siendo analizados, una zona libre de células se selecciona.
   4. La cantidad total de ER (en células extraídas) o citoplásmica (en células no extraídos) de fluorescencia se calcula por la fórmula:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _{N] [N} I - I _B]
   5. La intensidad de la tinción nuclear también puede ser calculado y utilizado como control interno entre los diversos tratamientos. Puesto que los núcleos no se ven afectados por el tratamiento de digitonina ¹⁷ o interrupción ribosoma ^11, la cantidad de mRNA nuclear debe permanecer constante entre cada uno de estos tratamientos. Para calcular la fluorescencia nuclear se utiliza la siguiente fórmula:
      [A _N] [I _N - IB]
   6. El porcentaje de ARNm citoplásmico que es ER-establecida se calcula tomando la media de fluorescencia ER de 30-40 células extraídas (véase 4.2.4) dividido por la media de fluorescencia citoplásmica 30 a 40 células no extraídos de nuevo (véase 4.2.4) . Es crítico que las células extraídas y sin extraer se preparan, se tiñeron y fotografiado en paralelo.

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Resultados

Para determinar el porcentaje de ARNm que es ER-asociado, células COS-7 que se transfectaron con plásmidos que contenían la fosfatasa alcalina placentaria (MF) o el citocromo P450 8B1 (CYP8B1) se extrajeron bien con digitonina y luego se fija, o fijada directamente (véase la Figura 1, comparar "no extraído Ctrl" a "Extraídas Ctrl"). La fluorescencia no nuclear se cuantificó en ambas muestras y la fracción de ER asociada a ARNm se calculó (Figura 2)....

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Discusión

La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular ^19,20 región.

Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secrec...

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