Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Resumen

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Resumen

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas ^1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos ^2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud ^5-9.

A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento ^10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas ^11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL.

Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Introducción

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo ^12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas ^13,14 y está implicado en la motilidad celular ^15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un área activa de estudio para las dos últimas décadas ^1.

La flexibilidad (o rigidez) de los biopolímeros se caracteriza por la persistencia de longitud, la longitud de polímero que se dobla por aproximadamente un radián menores fluctuaciones térmicas a temperatura ambiente. Una serie de técnicas han sido desarrolladas para medir la longitud de persistencia ^16, para example activos técnicas que implican doblar el polímero utilizando flujo hidrodinámico, trampas ópticas, o campos eléctricos ^4,17,18, y técnicas pasivas que miden las fluctuaciones de polímeros libres en solución ^5,6. Las mediciones activos, sin embargo, requieren configuraciones especiales para aplicar fuerzas conocidas en la escala del micrómetro, y las mediciones de libre fluctuación puede ser difícil debido a la difusión fuera del plano de foco del microscopio utilizado.

En este artículo, se describe un complementaria, técnica pasiva, para medir la longitud de persistencia de los microtúbulos, un polímero citoesquelético. La técnica consiste en ensayos de deslizamiento, que aseguran que el polímero permanece siempre en el plano focal ^19. Por otra parte, implica el seguimiento fluoróforos individuales unidos permanentemente al polímero de interés, de modo que los lugares específicos a lo largo del polímero están bien caracterizados.

Una caricatura del método se muestra en la Figure 1. Kinesin mueve específicamente hacia el extremo + de microtúbulos, por lo que los microtúbulos en un ensayo de deslizamiento son impulsados ​​unidireccionalmente. El extremo delantero de los microtúbulos, más allá de la quinesina último unido, es libre de fluctuar bajo las fuerzas térmicas de la solución circundante. Como los microtúbulos es propulsado hacia adelante, el extremo fluctúa hasta la unión a una molécula de quinesina nuevo aún más a lo largo de la lámina de vidrio se congela en una fluctuación dada. Debido a kinesin concede microtúbulos muy fuertemente, los microtúbulos se ve obligado a seguir el camino del extremo delantero. Por lo tanto, las fluctuaciones estadísticas congelados en la trayectoria de microtúbulos son las mismas que las fluctuaciones estadísticas del extremo libre ¹¹ de los microtúbulos, y por lo tanto se puede utilizar para calcular la longitud de persistencia de acuerdo con ²⁰

donde _p es l la longitud de persistencia de los microtúbulos, _s θ es el ángulo entre las tangentes a la trayectoria separados por una longitud de contorno s, y <> denota un promedio sobre todos los pares de posiciones separadas por una longitud de contorno s.

El ensayo de deslizamiento misma utiliza kinesin biotinilado en el enrollado de la bobina ²¹ se unía específicamente a la placa de vidrio mediante un enlace estreptavidina-biotina. Esta unión se asegura de que los dominios de motor son libres para unirse a microtúbulos y propulsar. Con el fin de seguir la trayectoria de microtúbulos, los microtúbulos están escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos ^22,23 - las etiquetas deberán ser lo suficientemente escasa que fluoróforos individuales se pueden resolver utilizando microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Fluoróforos individuales son rastreados utilizando rutinas de análisis de imágenes escrito en IDL. Las trayectorias de cada fluoróforo unido a un micrófono dadorotubule se combinan en una trayectoria de microtúbulos compuesto automáticamente ^24. Los ángulos tangentes θ para cada punto a lo largo de una trayectoria se calculan, a partir de estos ángulos tangentes de la s> valor se calcula para cada longitud de contorno s. Finalmente, estos datos se ajustan a la ecuación. 1 con el fin de extraer una longitud de persistencia para un microtúbulo dado, o para muchos microtúbulos en el mismo ensayo de deslizamiento.

El método es lo suficientemente robusto como para trabajar con los microtúbulos preparados en una amplia variedad de condiciones (con diferentes agentes estabilizantes u otras moléculas pequeñas unidas a los microtúbulos, con las proteínas microtubulares unidos asociadas (MAPs), o con una variedad de soluciones viscosas). En nuestro laboratorio, la técnica se ha utilizado para caracterizar la longitud de persistencia de los microtúbulos como una función de la longitud a lo largo de los microtúbulos y los microtúbulos con diferentes agentes estabilizantes. La restricción principal es que los microtúbulos todavía debe spoyo kinesin motilidad. Desde quinesina es una enzima motor robusto, esta es una restricción bastante suelta. Mediante la sustitución de microtúbulos con la actina y la quinesina con una enzima de familia de la miosina, la longitud de persistencia de la actina puede ser medida utilizando la misma técnica.

Protocolo

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones

Prepárese con ensayo de deslizamiento.

1. Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica ^22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas.
2. Purificar biotina-quinesina ²¹ a aproximadamente 1 mM. Almacenar a -80 ° C en 5 ml de alícuotas para su uso en los experimentos individuales.
3. Preparar el tampón de ensayo (AB) de imidiazole 50 mM, 50 mM de cloruro de potasio (KCl), 4 mM de cloruro magnésico (MgCl _2), 2 mM etilenglicol tetraacético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C.
4. Disolver albúmina de suero bovino biotinilada (biotina-BSA) a 2 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras.Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 º C hasta por un mes.
5. Disolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 20 l durante largos períodos de tiempo, a 4 ° C durante hasta dos semanas.
6. Disolver α-caseína a 5 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 ° C durante hasta dos semanas.
7. Disolver ditiotreitol (DTT) en agua desionizada a 200 mM. Almacenar a -20 ° C en 100 ml de alícuotas, utilizar antes de 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar.
8. Disolver paclitaxel (PT) en grado HPLC-dimetil sulfóxido (DMSO) a 4 mM. Almacenar en 10 ml de alícuotas a -80 º C a largo plazo, -20 ° C a corto plazo. Usar dentro de las 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar.
9. Disolver la glucosa en agua desionizada a 120 mg / ml. Almacenar en 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Se puede volver a congelar.
10. Disresolver el trifosfato de adenosina (ATP) en agua desionizada a 150 mM, pH 7,0. Tienda en 5 alícuotas a -80 ° C, utilizar antes de 8 horas de descongelación.
11. Preparar 100x acciones de captación de oxígeno ²⁵ mediante la disolución de 10.000 unidades de glucosa oxidasa y catalasa 156.000 unidades en 600 l tampón de ensayo total. Centrifugar brevemente en una microcentrífuga para sedimentar los sólidos; sobrenadante filtro con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 10 l durante largos períodos de tiempo, a 4 º C durante hasta una semana.

2. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos, Preparación misma solución de Día

Preparar las soluciones en 2.1-2.6 en el día del experimento. Con la práctica, las soluciones de 2.2-2.6 se pueden preparar durante el lavado de celda de flujo. A menos que se indique lo contrario, mantener soluciones madre en hielo.

1. Preparar AB, 1 ml de tampón de ensayo con 10 l de DTT de stock (AB con 2 mM DTT). Conservar a temperatura ambiente.
2. Preparar bio-tampón BSA, 40 y mu; L de una mezcla 1:1 de la población de biotina-BSA y AB. Conservar a temperatura ambiente.
3. Preparar tampón de BSA, la mezcla de 645 l de AB con 5,5 l de BSA (1 mg / ml de BSA en AB). Conservar a temperatura ambiente.
4. Preparar tampón SA, mezclar 57 l de AB con 3 l de stock estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina en AB). Conservar a temperatura ambiente.
5. Preparar α-caseína tampón, mezclando 200 l de tampón BSA, 50 l de stock caseína, y 0,8 l de ATP mu M 15 (1 mg / ml de α-caseína, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM ATP en AB). Conservar a temperatura ambiente.
6. Preparar fluorescencia anti-cloro tampón, mezclar 95 l α-caseína tampón, 2,5 stock de glucosa l, 1 l mezcla oxígeno 100x compactación, 1 stock de paclitaxel l, 1 l de 2-mercaptoetanol (βME). Añadir βME bajo campana de humos. Utilice fluorescencia anti-blanqueo tampón dentro de 1 hora de preparación PRECAUCIÓN:. ΒME es altamente tóxico y huele horrible. Asegúrese de abrir sólo en la campana de humos. Tienda botella en laausencia de luz, la luz degrada βME y su capacidad para reducir photobleaching.

3. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos

1. Construir sobre cuatro carriles de flujo entre un cubreobjetos de 24 x 60 mm y 22 x 22 mm cubreobjetos utilizando grasa de vacío, extruidos de una jeringa a través de una punta de pipeta, como un espaciador. Cada carril de flujo debe ser de aproximadamente 10 l en volumen (escala volúmenes subsiguientes).
2. Lavar 10 l de bio-tampón BSA en cada carril. Incubar 5 min para permitir la BSA para revestir las superficies de vidrio.
3. Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre biotina-BSA, mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. Utilice un Kimwipe o papel de filtro para eliminar el tampón desde el lado opuesto de la cámara de flujo, asegurándose de no permitir que las burbujas de aire que pasar por la cámara de flujo.
4. Lávese 15 l SA-buffer en cada carril. Esperar 10 min, o hasta 2 hr. La estreptavidina se une a la superficie unida a biotina-BSA.
5. Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre SA mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento.
6. Lavar cada carril con 15 l α-caseína tampón. α-caseína ayuda adicional bloquear la unión no específica de kinesin y los microtúbulos en el cristal.
7. Diluir kinesin a 10 nM en tampón de α-caseína y lavar cada carril con 15 l de esta kinesin - α-caseína solución. Esperar 15 min (o hasta una hora) para la quinesina biotinilada para unirse específicamente a la estreptavidina unida a la superficie. Los dominios kinesin motor seguirá siendo gratuito a los microtúbulos se unen.
8. Diluir paclitaxel a 40 micras a temperatura ambiente α-caseína de amortiguamiento, y lave cada carril con 15 l de esta solución para lavar kinesin libre y para precargar cada cámara de flujo con una solución de paclitaxel de microtúbulos para prevenir la despolimerización. Fría también despolimeriza microtúbulos, así que asegúrese de estas medidas se producen a temperatura ambiente con habitación temre soluciones.
9. Diluir la etiqueta fluorescente microtúbulos 1:100-1:1,000 de la fluorescencia anti-blanqueo tampón con 1 mM ATP. Lavar 15 l en un carril y observar dentro de 30 min.

4. Recopilación de datos

1. Observe el deslizamiento microtúbulos mediante microscopía de fluorescencia, un microscopio capaz de resolver los fluoróforos individuales, tales como una configuración de TIRF comercial o doméstica de aumento se requiere ²⁶ (Figura 2).
   Los microtúbulos debe ser propulsado por los motores de quinesina sobre el sustrato a aproximadamente 0,5 m / s, dependiendo de la temperatura. Si el campo de visión del microscopio es de 50 micras, los microtúbulos individuales debe ser visible para aproximadamente 100 seg. Establecer la intensidad de iluminación de manera que los fluoróforos individuales no fotoblanqueador más rápidamente que 100 seg. Si se utiliza láser de excitación, un ajuste de potencia de aproximadamente 3-5 mW es apropiado.
2. Recoger secuencias de imágenes para el análisis. 600 imágenes en5 Hz (2 en total min) funciona bien. Usar secuencias tiempo suficiente que los microtúbulos atravesar todo el campo de visión.

5. Análisis de Datos

Una rutina de IDL, get_lp.pro , se adjunta. Esta rutina devuelve un valor de longitud de persistencia basado en toda deslizamiento microtúbulos en una secuencia de imagen dada. O utilizar esta rutina en cada secuencia de imágenes, modificar parámetros de intensidad en función de la configuración del microscopio especial, o haga lo siguiente:

1. El seguimiento de cada fluoróforo unido a un microtúbulo para crear trayectorias de fluoróforo.
2. Combinar todas las trayectorias de fluoróforos sobre un microtúbulo determinado en una trayectoria de microtúbulos en general, repetir para cada uno de los microtúbulos en la secuencia de imágenes (Figura 3).
3. Calcular el ángulo tangente a cada punto a lo largo de la trayectoria (Figura 4)Y calcular θ _s> en la ecuación. 1 promediando el coseno de la diferencia de ángulo para cada par de puntos separados por una longitud de recorrido s (Figura 5). Halla la longitud de persistencia para un microtúbulo o grupo de microtúbulos por θ _s> a la ecuación. 1, la ponderación de los puntos de datos individuales en el ajuste por el número de valores independientes de cos θ _s que se utilizan para calcular el promedio.

Resultados

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde ...

Discusión

Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Cloruro potásico	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinilado BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseína	Sigma-Aldrich	C6780
Estreptavidina	Thermo Scientific	21125
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratorios	P-9600
Glucosa oxidasa	Sigma-Aldrich	G2133
Catalasa	Sigma-Aldrich	C100
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Comprar pequeña cantidad.
24x60 mm N º 1 1/2 tapa de vidrio	VWR	48393-252
22x22 mm N º 1 cubierta de vidrio	Gold Seal	3306
Grasa de alto vacío	Dow-Corning	NA
Microscopio TIRF	Muchos	NA	El microscopio TIRF utilizado en este método fue hecho en casa.
IDL (software)	Exelis	NA	¿Podría sustituir MATLAB, ImageJ, u otro software de análisis de imágenes.