El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumen

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC) de Drosophila Embriones, lo que permite el análisis de la morfología neuronal ya sea por la luz transmitida o microscopía confocal.

Resumen

En este artículo se describe cómo etiquetar individualmente las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila melanogaster por inyección juxtacellular del lipofílico fluorescente Dil marcador de membrana. Este método permite la visualización de la morfología de las células neuronales en gran detalle. Es posible marcar cualquier célula en el SNC: cuerpos celulares de las neuronas diana son visualizadas bajo óptica DIC o por expresión de un marcador genético fluorescente tal como GFP. Después del marcaje, el Dil se puede transformar en una permanente mancha marrón por fotoconversión para permitir la visualización de la morfología celular con luz transmitida y la óptica DIC. Alternativamente, las células marcadas con Dil se puede observar directamente con la microscopía confocal, permite genéticamente introducidos proteínas indicadoras fluorescentes que se colocalizaban. La técnica se puede utilizar en cualquier animal, independientemente del genotipo, haciendo posible el análisis de fenotipos mutantes con una resolución de célula individual.

Introducción

El conocimiento de la morfología neuronal a nivel de células individuales es una condición previa esencial para la comprensión de la conectividad neuronal y la función del SNC. Así, desde los primeros días de la neurociencia, los investigadores han tratado de desarrollar técnicas de marcaje de células individuales (véase ⁷ para un tratamiento histórico de este número). Los métodos clásicos, tales como la tinción de Golgi proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal, pero no son adecuados si se busca una etiqueta en un tipo particular de neurona en forma dirigida, como la tinción se produce de una manera aleatoria. El desarrollo de métodos para la tinción de las células individuales por inyección intracelular o juxtacellular de colorantes de un microelectrodo se dirigió a la exigencia de un etiquetado específico.

La aplicación de una sola neurona de inyección de tinte para Drosophila presentó un desafío importante, debido al tamaño pequeño de tanto el organismo y sus neuronas. Sin embargo, la tinción única neurona de embriones de Drosophila Neuronas se logró a mediados de la década de 1980 en el laboratorio de Corey Goodman ^15. Mientras que el método ha sido eminentemente útil y ha dado algunas ideas clave sobre los mecanismos para el desarrollo neuronal en Drosophila en los últimos 20-30 años (por ejemplo, ^{2, 10),} muchos trabajadores se han negado a ello, en gran parte debido a sus exigencias técnicas.

La disponibilidad en los años más recientes de técnicas genéticas para el etiquetado neuronal en Drosophila también ha contribuido a la impopularidad de la inyección de un solo tinte neurona. GAL4 expresión dirigida de los constructos de GFP específicos de membrana puede proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal ^{1, 20.} Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones: la expresión a menudo inevitable de GFP en las células múltiples puede oscurecer la estructura de las neuronas individuales, y una línea GAL4 conductor puede no estar disponible para conducir la expresión en una neurona particular de interés. El MARCM (Análisis Mosaico con un representantemarcador de células ressible) ⁸ método puede proporcionar un etiquetado de esencialmente cualquier neurona en el nivel de células individuales, pero no puede ser utilizado con éxito en el embrión y larva temprana debido a la lenta rotación de la proteína GAL80.

Dadas estas limitaciones de etiquetado genética, creemos que la inyección neurona solo tinte en el embrión de Drosophila sigue siendo una técnica valiosa y merece una aplicación más amplia. Para promover este objetivo, ofrecemos aquí una descripción detallada del método. Una ilustración de su potencia es proporcionada por nuestra cuenta reciente de la morfología de la serie completa de interneuronas en neuromeres abdominales de finales de los años ¹⁴ embrión de Drosophila. Este estudio, que reveló tanto la variabilidad morfológica de los distintos tipos de células neuronales y los principios de organización neuromere en el SNC del embrión, no habría sido posible con cualquier otro método de etiquetado disponibles en la actualidad.

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Protocolo

Hemos usado dos variantes ligeramente diferentes del método de etiquetado sola neurona en nuestros laboratorios. Las diferencias se refieren a la recogida de embriones, dechorionisation, devitellinisation y pasos de embrión de fileteado. Figura 1 ofrece una visión general de los pasos comunes y divergentes de las variantes.

1. Preparación de micro-agujas de disección de embriones y Micropipetas para Inyección Dye

1. Agujas de vidrio para la disección de embriones se extraen de capilares de vidrio (1 mm de diámetro y 0,1 mm de grosor) con un extractor de Sutter (Ciencia Instruments) o un equipo comparable. Alternativamente, un electrolíticamente afilado alambre de tungsteno 0,15 mm montada en un soporte de aguja se utiliza para la disección. (Instrucciones para electrolítico de afilado se dan en ^9).
2. Micropipetas tinte de inyección se han extraído de paredes finas capilares de vidrio con filamentos interiores (Science Products, 100 GB TF 8P) con un extractor de Sutter (CienciaInstrumentos) o equipo comparable. La punta de la micropipeta necesita ser afilado, con una conicidad gradual y uniforme de la espiga para facilitar el paso a través de los tejidos del embrión. La micropipeta deseado es el "microelectrodo de alta resistencia, Sharp y largo plazo" variedad, como se describe en la página 20 del manual de Sutter Instrument libro de cocina con una pipeta ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). En general, micropipetas se tiran poco antes de las inyecciones se realizan para asegurar las puntas permanecen afiladas y limpias.

2. Recolección, montaje y disección de embriones

1. Colección de Embriones. Hemos utilizado con éxito el método de inyección neurona se describe aquí en los embriones de las etapas 12 a ¹⁷ marzo. Los embriones desarrollar progresivamente una cutícula durante la etapa 17 y se convierten cada vez más difícil de diseccionar. Dos enfoques alternativos están disponibles para obtener embryos en una etapa particular del desarrollo.
   1. Permita que las moscas ponen sus huevos durante la noche en agar jugo de manzana, placas revestidas con pasta de levadura. Ajustar la temperatura de la recolección de huevos para adaptarse a la hora prevista de inyección el día siguiente. Recoge todos los huevos al día siguiente y seleccionar embriones en la etapa deseada utilizando criterios morfológicos ^3.
   2. Permitir moscas a poner en placas de agar que el anterior, pero intercambiar la placa de agar con uno nuevo cada 1,5 horas a 25 ° C. Incubar cada placa para un período de tiempo definido, hasta que los embriones han alcanzado la fase de desarrollo que se requiere.
2. 1. Química dechorionation. Use una espátula de metal para raspar embriones fuera del agar y transferirlos a un recipiente de vidrio (por ejemplo, placa Petri o bloque de cavidad) que contiene aproximadamente 10 ml Drosophila Ringer o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir unas gotas de lejía concentrada y agitar durante unos minutos en unplataforma giratoria hasta los pantanos corion fuera de los embriones. Lavar los embriones en varios cambios de timbre / PBS hasta que no haya olor a lejía residual. Durante estos lavados, asegurar que los embriones no entran en contacto con la superficie del líquido. De lo contrario, flotarán y se hace difícil sumergir para la manipulación posterior. Alternativamente, dechorionation química se puede llevar a cabo usando la técnica descrita por la cesta ^4.
   2. Dechorionation mecánica (véase la Figura 2, pasos 1-4). Embriones de transferencia de la placa de agar a un portaobjetos cubierto con cinta de doble cara adhesiva. Evitar la transferencia de agar con los embriones ya que interfieren con su adhesión a la cinta. Permita que los embriones que se seque durante 5 a 10 minutos hasta que el corion se vuelve ligeramente quebradiza. (Mientras se espera para recubrir el cubreobjetos necesario para devitellinisation después con pegamento - 2.3B ver más abajo). Toque cada embrión suavemente con una aguja. El corion se dividirá abierto y el embrión se adhiere a la needle. Transferencia de embriones inmediatamente a un bloque de agar para prevenir la resequedad y alinear unos 10 de ellos en fila, con sus lados ventral hacia arriba.

Devitellinisation y fileteado se realiza manualmente mediante uno de los dos métodos descritos en 2.3A y 2.3B.

3. 1. Transferir un único embrión dechorionated de la etapa de desarrollo apropiada en el plato de solución de Ringer con varias gotas de Ringer en una presa de silicona sobre un portaobjetos de microscopio pre-preparada. (Hacer un dique de 3 cm cuadrado untando una capa fina de sellador de silicona en un portaobjetos de microscopio, a continuación, añadir una gota de poli-L-lisina 0,01% hasta el centro de la presa. Permitir que la silicona se seque durante 24 h.) transferir el embrión con una pipeta Pasteur de vidrio, asegurándose de que el embrión permanece debajo de la superficie de la Ringer durante la transferencia.
      Sujetar el extremo posterior del embrión con un par de pinzas finas, mientras que suavemente squeezING el embrión con un par de tijeras finas iridectomía, alrededor de un cuarto de vuelta de su extremo anterior. No corte derecho a través del embrión. El objetivo es romper sólo abierta la membrana vitelina mientras que causan daños mínimos para el embrión. Con las pinzas todavía en posición, utilizar una aguja de tungsteno para facilitar el embrión de la membrana se abrió y la posición de lado ventral hacia abajo en la diapositiva. El embrión debe pegarse a la capa de poli-lisina.
      Filete del embrión con una aguja de tungsteno afilado. Suavemente perforar, luego romper la pared del cuerpo a lo largo de la línea media dorsal. Usando la aguja, presione hacia abajo en la pared del cuerpo para que se adhiera a la diapositiva. Para evitar daños en la pared del cuerpo, empujar la pared del cuerpo con el intestino interpuesto entre ella y la aguja. A continuación, utilice la aguja para romper a través del intestino en sus extremos anterior y posterior y retírela. Si se desea, los embriones adicionales pueden ser transferidos a la misma diapositiva, devitellinised y fileteado, teniendo cuidado de no dañar otros embriones ya enla diapositiva.
   2. Escudo un 24 x 60 mm cubreobjetos con heptano cola (véase la Tabla 1) mediante la colocación de una pequeña gota de pegamento en el centro de la corredera y extendiéndola con un cubreobjetos de 18 x 18 mm a una película muy fina. Colocar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio y crea un marco de cinta adhesiva de un solo lado alrededor de sus bordes. Recorte el exceso de agar del bloque de la celebración de la fila de 10 embriones, toque suavemente los embriones con el cubreobjetos heptano pegamento. Ahora deberán cumplir con el cubreobjetos con sus lados ventrales hacia abajo. Añadir una cantidad generosa de PBS para cubrir los embriones (véase la Figura 2, pasos 4-6).
      Penetrar en la membrana vitelina con un vidrio o una aguja de tungsteno en el lado dorsal de cada embrión cerca de su extremo posterior. Desgarrar la membrana a lo largo de la línea media dorsal y arrastre el embrión de la membrana. Oriente el lado ventral de embriones en otra parte sobre el substrato y el filete de cola heptano usando el mismo método descrito en 2.3A) (véaseLa figura 2, los pasos 7-8). Desde varios embriones se corta en filetes en el mismo portaobjetos, es útil que ser muy precisa con su orientación o hacer un dibujo de su orientación en la diapositiva.
4. Tras el fileteado, los embriones pueden ser ligeramente fijado para 10 a 15 min en 7,4% de formaldehído en PBS, seguido de 4 lavados en PBS. Deberá tenerse cuidado de no llevar el embrión en contacto con la superficie de la solución durante este proceso, ya que las fuerzas de tensión superficial va a destruir el embrión. Esta etapa de pre-fijación no es estrictamente necesario, pero es útil para evitar la contracción de los músculos de la pared corporal en los embriones en fase tardía y ayudar a estabilizar los tejidos de embriones en etapas jóvenes. Tenga en cuenta que la fijación es hacer que los tejidos del embrión más opaco y por lo tanto compromete la calidad de imagen en observación DIC.

3. Llenado de inyección Micropipetas

Llene hasta la mitad un tubo Eppendorf de 0,5 ml de microfuga conuna solución al 0,1% de la Dil carbocynanine tinte (Molecular Probes, Eugene, OR) en el 100% de etanol (asegúrese de usar "seco" EtOH absoluto para evitar la precipitación DII). Hacer un agujero estrecho en la tapa del tubo e insertar el extremo romo de la micropipeta a través del agujero en la tapa. Permitir el Dil a ascender hasta el filamento durante al menos 5 min. (Siempre cubra el orificio de la tapa cuando no llenar una micropipeta para evitar la evaporación de etanol).

Equipo necesario para la neurona colorante inyección (Figura 3).

Microscopio. Un microscopio de platina fija debe ser utilizado para neurona inyección de colorante para evitar el movimiento vertical del embrión durante el enfoque. Cualquier movimiento tales desplazaría a la pipeta después de que haya entrado en contacto con el embrión. Hemos encontrado tanto la Zeiss Axioskop FS y la Olympus AX50/BX50 modelos de fases fijas a ser muy adecuado para este propósito. El microscopio debe estar equipado con óptica de luz transmitida por DIC para la visualización de neurons antes de la tinción. El microscopio también debe ser una posición vertical en lugar de un modelo invertido. Con un microscopio vertical, la punta de la micropipeta es en el mismo lado del embrión como objetivo la visualización, mientras que con un microscopio invertido los dos están en lados opuestos del embrión. La última disposición compromete la calidad de la óptica DIC. El microscopio se debe configurar para microscopía de fluorescencia, con un juego de filtros adecuado para la observación Dil. Desde Dil tiene un espectro amplio comparable con máximos de excitación y emisión a 549 y 565 nm muchos conjuntos de filtros de esta gama se trabajan, por ejemplo, aquellos para Alexa 568, Cy3, rodamina, rojo Texas o TRITC. Aunque es conveniente para ajustarse a un obturador controlado electrónicamente en el camino de la fuente de luz de fluorescencia, para permitir el funcionamiento de la obturación sin contacto de la mano con el microscopio, también efectivamente provistos, en una configuración que estaba equipado sólo con un disparador manual. Por último, un gran aumento, alto apertu numéricore objetivo de inmersión en agua es necesaria para la observación durante la inyección. Este objetivo debe ser diseñado para el uso sin cubreobjetos. Hemos utilizado con éxito el Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W y Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 W objetivos.

Un micromanipulador se requiere para colocar y mover el micropipeta durante neurona de inyección de tinte. Hemos utilizado tanto el micromanipulador Leica y una etapa de montaje Narashige 3-ejes micromanipulador hidráulico.

Un amplificador intracelular de DC, con la instalación para la inyección de corriente, se requiere para la inyección de Dil iontoforético de la micropipeta.

4. Procedimiento para la inyección de colorante

1. Colocar el portaobjetos con el embrión montado (s) en la platina del microscopio de la inyección (Figura 3). Utilice un objetivo de 10x para localizar un embrión y ponerlo en el centro del campo de vista.
2. SOING el objetivo de alta potencia en la posición de visión y llevar el embrión en el foco. Localizar la célula de interés bajo la óptica DIC (o usando fluorescencia si la célula objetivo expresa GFP) y ponerlo en el centro del campo de vista. Asegúrese de que el diafragma de campo del microscopio se abre justo hasta el borde del campo de vista, no más allá. Un haz de iluminación se estrecha ayudar en la colocación de la micropipeta (ver paso 4,4 abajo). Elevar el objetivo hasta que sea tan alta como sea posible por encima del embrión mientras que aún permanecen en contacto con la solución de Ringer / PBS.
3. Colocar el electrodo de baño para el amplificador de DC en el bien clara del embrión y el camino de la micropipeta PBS.
4. Insertar la micropipeta inyección en su soporte, que ha sido llenado con una solución 0,1 M LiCl. Coloque el soporte micropipeta para el micromanipulador. Uso de los controles secundarios micromanipulador, traer la micropipeta en el espacio entre la punta del objetivo y el embrión.Asegúrese de que está bien por encima del nivel del embrión. Debido a la corta distancia de trabajo del objetivo de alta potencia, la micropipeta tendrá que realizarse en un ángulo bajo con el fin de ponerla en foco (ver Figura 3). Usted tendrá que establecer el ángulo apropiado por ensayo y error en la primera instancia. Si el ángulo es demasiado alto, usted no será capaz de obtener la punta de la micropipeta en el foco. Si es demasiado bajo, el eje de micropipeta, ensuciará contra la pared del dique que contiene la solución de baño en su lugar.
5. Centro de la punta de la micropipeta en el campo de visión. Para lograr esto, forma sus ojos al nivel del embrión y mover la micropipeta atrás y hacia adelante en el eje Y de la platina del microscopio. Cuando la punta atraviesa la trayectoria de la luz, podrás ver el brillante reflejo de los rayos de luz de la misma. Mover la punta de la micropipeta hacia adelante en el eje X de modo que rebasa el haz de luz. Será más fácil de localizar la micropipeta en la pequeñacampo de visión del objetivo de alta potencia si usted está en busca de su eje en lugar de la punta. Ahora mira a través de los oculares del microscopio y reducir gradualmente el objetivo de alta potencia hasta que el eje de la micropipeta entra en el foco. Traslado de la micropipeta atrás y hacia adelante en el eje Y con los controles micromanipulador ayuda a localizar, ya que poco a poco entra en el foco. Cuando el eje está en foco, mover la micropipeta en el eje X hasta que su extremo se encuentra en el centro del campo de visión. En esta etapa, la punta de la micropipeta debe estar bien por encima del nivel del embrión. Cambie a la iluminación de fluorescencia y examinar la punta para comprobar que no haya fugas de Dil. Ajustar la corriente continua para evitar que cualquier cristal de Dil forma en la punta.
6. Uso de los controles micromanipulador, bajar la micropipeta en el eje-Z. Traerlo de vuelta en el foco con el control de enfoque del microscopio. Progresivamente más baja de la micropipeta abajo hacia el embrión de esta manera. Inicialmente, usted puede hacer esto con el gruesoEje Z controles del micromanipulador y el microscopio. Sin embargo, como el embrión entra en el foco debe cambiar a los mandos de control de calidad.
7. Cuando la superficie del embrión entra en el foco, mover la punta de la micropipeta hacia el borde del campo de vista, en la dirección de la micromanipulador. Centrarse en la célula para ser inyectado y comprobar que se encuentra en el centro del campo de vista. Centrarse de nuevo en la punta de la micropipeta y lo mueve en el eje Y hasta que quede al mismo nivel que en el eje Y como la célula. Mover la punta de la micropipeta hacia la célula en el eje X como lo bajas en el eje-Z. Si se utiliza un micromanipulador Leica, usted probablemente encontrará que la platina del microscopio controla darle un mayor control de movimiento en el eje X de los controles micromanipulador, por lo que cambiar a la etapa de control como la punta se acerca a la celda.
8. Llevar la punta de la micropipeta en contacto con la célula y crea una depresión en su superficie. Pase nanoamps varios de depolarizing actual durante unos segundos. Usted debe ver a un pequeño cristal de Dil se forma en la célula. Para confirmar que la célula ha sido etiquetado, brevemente abrir el obturador para iluminar el embrión con luz fluorescente, a continuación, vuelva a DIC. Si el cuerpo de la célula de interés muestra signos de etiquetado, aplicar corriente durante varios segundos más. Apagar la corriente y rápidamente tirar del embrión lejos de la micropipeta en el eje X mediante el control de platina del microscopio. A continuación, retirar la micropipeta de la solución. Si no etiquetado Dii es evidente, la micropipeta puede ser bloqueado y será necesario reemplazarlas con una micropipeta fresca. Es posible que la punta de la micropipeta ha enganchado otros tejidos en el camino a la célula de interés y este tejido se tiñe en lugar de la célula. En este caso, intente retirar la micropipeta ligeramente, y re-acercarse a la célula. Puede ser necesario reemplazar la micropipeta y vuelve a intentarlo.

9. Si se desea, varias celdas pueden ser individualmentealiarse marcado en el mismo embrión.
10. Eliminar la mayor parte de la solución en la cámara de inyección, a continuación, fijar los embriones mediante la adición de 7,4% de formaldehído / PBS durante 10 min seguido de 4 lavados con PBS. El embrión se dejó a temperatura ambiente durante al menos 4 h (o toda la noche a 4 ° C) en una cámara oscura, húmeda (para evitar la decoloración o la caída en seco) para permitir que el DII para difundirse a través de los procesos neuronales. En esta etapa, las células Dil-etiquetados se pueden ya sea photoconverted o ver directamente en el microscopio confocal.

5. Fotoconversión para su examen a la óptica DIC

El principio de fotoconversión es la oxidación (foto-) de DAB por la luz fluorescente emitida por la célula teñida durante la iluminación con la longitud de onda apropiada. Esto significa que las células brillantes se photoconverted en un tiempo más corto en comparación con las células débilmente teñidas. Si varias celdas marcadas en una muestra difieren demasiado en cuanto a su brillo esto puede llevar a difficulties en photoconverting todos ellos en la misma calidad (ver Figura 4): en este caso se puede tomar una decisión sobre una transacción entre descuidar las células más débiles (con iluminación corta) o aceptar que las células comienzan a hincharse más brillantes (con más iluminación) . Si todas las células son demasiado débilmente marcado (por lo que requieren iluminación muy largo), de fondo causado por peroxidasas endógenas puede convertirse en un problema. Desde DAB es tóxico se debe manipular con cuidado. Los residuos pueden ser "desactivada" con un 7% de cloro blanqueador.

1. Fotoconversión debe llevarse a cabo para cada embrión individual. En los casos en que se inyecta un solo embrión por diapositiva, la solución de PBS que cubre el embrión se sustituye con una solución de DAB (3 mg DAB / ml de tampón Tris), el portaobjetos colocado en un microscopio de fluorescencia y la celda llena vieron con un objetivo de 100x. (El uso de un microscopio vertical los huecos de objetivos en la solución de DAB y se debe limpiar varias veces con agua después de la fotoconversión procedimiento está terminado; esto puede evitarse si un microscopio invertido se utiliza). Un conjunto Cy3 filtro y una lámpara de Hg de 100 W se utilizan y la célula expuesta a las longitudes de onda de excitación rojo hasta un producto de reacción marrón de DAB se hace evidente en la neurona marcada (comprobar periódicamente por el cambio a iluminación de campo brillante). El tiempo necesario para la tinción DAB óptima es variable, pero requiere la exposición a la luz de excitación más allá de la fase en que la fluorescencia se ha desvanecido por completo. Después de fotoconversión es completa, se lava la preparación varias veces con PBS. Vuelva a colocar la PBS con una caída de 70% de glicerol, raspar la silicona con una hoja de bisturí, reemplace con un anillo de vaselina y poner un cubreobjetos.
2. Cuando los embriones múltiples se han llenado en la diapositiva uno, transferir cada embrión a una pequeña gota de PBS en un cubreobjetos separada 24 mm x 60 con el lado ventral del embrión hacia el cristal. Coloque un marco de cinta adhesiva alrededor de cada embrión para crear una bien y cubra la preparación con PBS. Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda antes fotoconversión para evitar que se reseque. Cambio de la PBS que cubre el embrión con una solución de DAB. Inmediatamente colocar el portaobjetos en un microscopio invertido equipado con una lámpara de Hg de 100 W y utilizar un filtro de Cy3 configurado para excitar el DiI, usando hacha 50 objetivo. Después de fotoconversión, transferir el embrión a una diapositiva fresco en una gota de 70% de glicerol, añadir un cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas.

6. El examen por microscopía confocal

1. Después del paso 4,10, embriones de transferencia a una pequeña gota de PBS en un cubreobjetos fresco 24 mm x 60. Logramos óptica óptimos mediante el montaje de los embriones aplanadas con el lado dorsal hacia el cubreobjetos (dejando sólo una pequeña cantidad de PBS entre el cubreobjetos y el embrión).
2. Coloque un marco de cinta adhesiva alrededor del embrión y ampliar la gota PBS para llenar el marco cuando se cubre con una diapositiva. Coloque una diapositiva en él con cuidado y fijarla con esmalte de uñas. Neuronas deben ser llenadas examenINED en un confocal (o de fluorescencia) microscopio tan pronto como sea posible.

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Resultados

La Figura 4 ilustra los resultados típicos de la técnica, como se describe aquí. Figura 4A muestra un ejemplo de un Dil llena interneuron único que se photoconverted limpiamente. Es muy bien demuestra la cantidad de detalle que ofrecen estas preparaciones. Cuando se observa bajo la óptica DIC el contexto espacial de la celda marcada dentro del tejido circundante no marcado se hace visible, por ejemplo, la posición del cuerpo de la celda dentro de la corteza y de la proyec...

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Discusión

Una ventaja importante de Drosophila como sistema modelo es que permite el análisis del desarrollo y la función en el nivel de células individuales. Esto es especialmente útil en relación con el sistema nervioso, donde la diversidad de tipos de células es excepcionalmente alta y la función y la morfología de las células vecinas pueden ser totalmente diferentes.

El método que aquí presentamos permite el etiquetado de las neuronas individuales con un colorante que puede ser...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			REACTIVOS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg / ml en 100 mM Tris-HCl, pH 7,4
Dil	Invitrogen / Molecular Probes	D-282	1 mg / ml en etanol
Formaldehído	Merck Millipore		7,4% en PBS
Glicerol	Roth	3783	70% en PBS
Heptano Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	diluir ca. 1 a 1 con n-heptano
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPO
Microscopio Confocal	Leica	TCS SP2	para ver y documentar etiquetados de la fluorescencia
DC - unamplifier	Dragan Corporación	Cornerstone ION-100	para llevar a cabo los etiquetados
Cubreobjetos	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Cubreobjetos	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscopio de disección	Leica	MZ8	para preparar y diseccionar embriones
Piso Capilares	Hilgenberg		diámetro exterior 1 mm, grosor de 0,1 mm glas
Inyección Capilares	Science Products	100 GB TF 8P
Micromanipulador R	Leica		para llevar a cabo los etiquetados
Modelo P-97	Sutter Instruments		para tirar de los capilares
Diapositivas Objetos	Marienfeld Superior	1000000
Microscopio Científico	Zeiss	Axioskop 2 MOT	para ver etiquetados después fotoconversión
Microscopio Científico	Olimpo	BX50	para llevar a cabo los etiquetados
Sony MC3255 cámara de vídeo	Sony / AVT Horn	Sony MC3255	para grabar etiquetados después de fotoconversión