El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Resumen

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

Resumen

La investigación proteómica revela la impresionante complejidad de proteomas eucariotas en un detalle sin precedentes. Ahora es un principio comúnmente aceptado que las proteínas en las células de la mayoría no existen como entidades aisladas sino que ejercen su actividad biológica en asociación con muchas otras proteínas, en los seres humanos diez o más, la formación de líneas de montaje en la célula para la mayoría si no todas las funciones vitales. ^{1 , 2} El conocimiento de la función y la arquitectura de estos conjuntos multiproteicos requiere su disposición en calidad superior y en cantidad suficiente para un análisis detallado. La escasez de muchos complejos de proteínas en las células, en particular, en los eucariotas, prohíbe su extracción a partir de fuentes nativas, y requiere la producción recombinante. El sistema vector de expresión de baculovirus (BEVS) ha demostrado ser particularmente útil para la producción de proteínas eucarióticas, la actividad de los cuales a menudo se basa en el procesamiento post-traduccional que otros sistemas de expresión comúnmente utilizados a menudo puedeno son compatibles. ³ BEVS utilizar un baculovirus recombinante en el que se insertó el gen de interés para infectar cultivos de células de insectos que a su vez producen la proteína de elección. MultiBac es un BEVS que ha sido especialmente adaptado para la producción de complejos de proteínas eucariotas que contienen muchas subunidades. ⁴ Un requisito previo importante para la producción eficiente de proteínas y sus complejos son robustos protocolos para todos los pasos implicados en un experimento de expresión que, idealmente, puede ser implementado como los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) y seguido también por usuarios no especializados con relativa facilidad. La plataforma MultiBac en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) utiliza procedimientos normalizados de trabajo para todos los pasos implicados en un complejo multiproteico experimento de expresión, a partir de la inserción de los genes en un genoma de baculovirus ingeniería optimizado para la producción de proteínas heterólogas propiedades para el análisis a pequeña escala de la proteína ejemplares producidos. ^5-8 La plataforma dese instala en un modo de acceso abierto en el EMBL de Grenoble y ha apoyado a muchos científicos de la academia y la industria para acelerar los proyectos de investigación complejos proteicos.

Introducción

La actividad biológica se controla por conjuntos de proteínas y otras biomoléculas que actúan en concierto para catalizar las funciones celulares. Los ejemplos notables incluyen la maquinaria que transcribe la información genética contenida en el ADN en ARN mensajero. En los seres humanos, más de 100 proteínas se unen en un proceso definido y regulado para transcribir los genes, la formación de grandes complejos multiproteicos de 10 y más subunidades incluyendo el ARN polimerasa II y los factores de transcripción generales, tales como TFIID, TFIIH y otros. ⁹ Otros ejemplos son los ribosoma, que consta de muchas proteínas y moléculas de ARN, que cataliza la síntesis de proteínas, o el complejo del poro nuclear, que es responsable de shuttling biomoléculas a través de la envoltura nuclear en eucariotas. Una disección de arquitectura y bioquímica detallada de esencialmente todas las máquinas multicomponente en la célula es vital para entender su función. La elucidación de la estructura de procariótico y eukarribosomas yotic, por ejemplo, constituyeron acontecimientos característicos que producen una visión sin precedentes de cómo estas máquinas macromoleculares llevar a cabo sus funciones designadas en la célula. ^10,11

Los ribosomas se pueden obtener en cantidad y calidad suficiente para un estudio detallado mediante la purificación del material endógeno de las células cultivadas, debido al hecho de que hasta el 30% de la masa celular consta de los ribosomas. ARN polimerasa II ya es menos abundante en órdenes de magnitud, y muchos miles de litros de cultivo de levadura tenía que ser procesada para obtener una vista atómica detallada de este complejo central y esencial para la transcripción. ¹² La inmensa mayoría de los otros complejos son sin embargo esenciales presentes en cantidades mucho más bajas en células nativas, y por lo tanto no pueden purificarse adecuadamente a partir de material fuente nativa. Para hacer tales complejos accesibles para el análisis estructural y funcional detallado requiere la producción heteróloga utilizando te recombinantechniques.

Producción de proteína recombinante tenía un gran impacto en la investigación biológica. Muchas proteínas fueron producidos de forma recombinante, y su estructura y función disecados en alta resolución. Programas de genómica estructural han aprovechado el esclarecimiento de los genomas de muchos organismos para abordar el repertorio de productos de genes de organismos enteros en el modo de alto rendimiento (HT). Miles de estructuras de proteínas por lo tanto se han determinado. Hasta la fecha, el sistema más utilizado prolíficamente para la producción de proteínas recombinantes ha sido E. coli, y muchos sistemas de expresión se han desarrollado y perfeccionado en los años para la producción heteróloga en este huésped. Los plásmidos que albergan una gran cantidad de funcionalidades para permitir la producción de proteínas en E. coli llenan catálogos enteros de proveedores comerciales.

Sin embargo, E. coli tiene ciertas limitaciones que lo hacen inadecuado para producir muchas proteínas eucarióticas y en particulares complejos de proteínas con muchas subunidades. Por lo tanto, la producción de proteínas en huéspedes eucariotas se ha convertido en cada vez más el método de elección en los últimos años. Un sistema particularmente bien adaptado para producir proteínas eucariotas es el sistema vector de expresión de baculovirus (BEVS) que se basa en un baculovirus recombinante que lleva los genes heterólogos para infectar cultivos de células de insectos cultivadas en el laboratorio. El sistema de MultiBac es un BEVS más recientemente desarrollados, que se adaptan particularmente para la producción de complejos de proteínas eucarióticas con muchas subunidades (Figura 1). MultiBac se introdujo por primera vez en 2004. ¹³ Desde su introducción, MultiBac se ha perfeccionado continuamente y se racionaliza para simplificar el manejo, mejorar la calidad de la proteína diana y generalmente haciendo que el sistema sea accesible a los usuarios que no son especialistas en el diseño de los procedimientos normalizados de trabajo (PNT eficientes). ⁴ MultiBac se ha implementado en muchos laboratorios de todo el mundo, en la acAdemia y la industria. En el EMBL de Grenoble, los programas de acceso transnacionales se pusieron en marcha por la Comisión Europea para proporcionar la formación de expertos en la plataforma MultiBac para los científicos que desean utilizar este sistema de producción para el avance de sus investigaciones. La estructura y la función de muchos complejos de proteínas que eran hasta ahora no accesible se dilucidan mediante muestras producidas con MultiBac. ⁴ En la siguiente, los pasos esenciales de la producción MultiBac se resumen en protocolos como están en operación en la instalación MultiBac en el EMBL Grenoble.

Protocolo

1. Tandem recombinería (TR) para la creación de construcciones de expresión Multigene

1. Planificación de la estrategia de co-expresión. Enfoque de diseño para la inserción de los genes de interés en los donantes y receptores. Submódulos fisiológicas potenciales de su complejo deben agruparse en aceptores y donantes específicos. Utilice Módulo multiplicación consiste en vivienda de endonucleasa (HE) - pares BstXI de combinar módulos de expresión de los donantes individuales y los plásmidos aceptador ^7,8 Crea todas las construcciones relevantes en silico y validar la estrategia antes de continuar con el trabajo experimental.. Por ejemplo, los genes de interés se deben comprobar que no contienen HE o otros sitios de restricción y la presencia de correctas marcos de lectura abierta (ORFs) debe ser validado. Considere la posibilidad de ordenar los genes sintéticos optimizados para el uso de codones de células de insecto y la estructura secundaria del mRNA para mejorar los niveles de producción de proteínas, así como la eliminación de cualquier EXIpicadura HE sitios de los genes de interés. Considere la posibilidad de colocar etiquetas de purificación basado en datos de la literatura acerca flexibles o expuesto N-o C-terminal de las proteínas de la elección. Considere la aplicación de estrategias de poliproteína que tienen como objetivo la producción de varias subunidades de proteínas en su compleja si necesitan ser controlados debido a problemas de estequiometría en el complejo de las cantidades relativas de proteínas individuales. ⁴ Prepare detalla "How-To" documento (se recomienda el cuaderno de laboratorio electrónico) que contiene todas las medidas experimentales proyectados del proyecto previo a la construcción multigénica completo (s). Crear archivos electrónicos de los plásmidos condensados ​​Cre-loxP por ejemplo mediante el uso del software de Cre-ACEMBLER que se puede descargar desde la página de inicio del grupo Berger ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler ).
2. Inserte los genes de interés en los donantes seleccionados yAceptantes por el uso de enzimas de restricción y la ligasa, o, alternativamente, mediante el uso de la ligadura de métodos independientes de conformidad con los protocolos publicados. ^5,6,14 Si usted tiene acceso a un tratamiento de líquidos estación de trabajo y si usted planea un gran número de construcciones que se generen ( por ejemplo, para los enfoques combinatorios) considerar el uso de scripts de robótica desarrollado e implementado por el grupo Berger (Figura 2). ^14,15 Si un manejo de líquidos estación de trabajo no está disponible, la operación manual utilizando placas de microtitulación permite la inserción de genes en un HT como la moda.
3. Las limitaciones impuestas por la necesidad de controlar la estequiometría de las subunidades expresadas pueden materializarse. En el caso de los niveles de expresión desequilibradas estequiométricamente de subunidades de un complejo de proteínas, considerar la aplicación de las estrategias de poliproteína de unir varias subunidades de la compleja y una proteasa específica (por ejemplo, tabaco etch virus NIa proteasa) en grandes ORFs individuales separadas por ssitios proteolíticas ESPECÍFICAS. ^4,8 considerar co-expresión de uno o varios poliproteınas con casetes de expresión solo si tiene un complejo muy grande con muchas subunidades y ampliamente comprendida pesos moleculares de las subunidades individuales. Considere la posibilidad de co-expresión de varios genes que codifican para la misma proteína en una poliproteína o como varios casetes de expresión idénticos si la proteína que se caracteriza por rendimiento de producción bajo. ^4,13
4. Validar todas las construcciones donante y aceptor clonados mediante mapeo de restricción (opcionalmente en alto rendimiento) y la secuenciación. Proceder a fusionar combinaciones donador-aceptor por Cre-loxP recombinación para generar las construcciones de expresión de múltiples genes de elección. Validar plásmidos de fusión Aceptador de donantes purificada por mapeo de restricción, utilizar secuencias electrónicos creados por Cre-ACEMBLER o programas similares como una referencia.
5. Guarde donantes purificados y validado, aceptantes y fusiones donador-aceptor a -20 ° C o -80 ° C. Archivo plasmids y sus secuencias (Microsoft Excel, FileMaker, otros) cuidadosamente para su uso posterior.

2. Multigenes Composite Baculovirus generación, amplificación y almacenamiento

1. Integrar vectores de transferencia multigene el genoma de baculovirus MultiBac mediante la transformación en células DH10 que alberga el genoma viral y las funcionalidades requeridas para la transposición Tn7. Tenga en cuenta que el genoma de baculovirus MultiBac puede ser precargado con determinados genes de interés (YFP marcador, chaperonas, etc) en su propio sitio LoxP (por ingeniería genética en el genoma distal al sitio de unión Tn7) por una reacción in vivo Cre Tn7 que precede a la integración. ¹³ Después de transposición Tn7, las células con baculovirus compuesto que contiene los genes de interés se seleccionan mediante el cribado azul / blanco (exitosas Tn7 resultados de transposición en la pérdida de α-complementación de la β-galactosidasa, por lo tanto, las colonias con correcta transposición Tn7 siguen siendo blanco en un selectivaplacas gar contienen X-gal) y el genoma es preparado por lisis alcalina y etanol / precipitación isopropanol ^5,6.
2. La transfección y la producción de virus inicial. Place de 6 pocillos placa de cultivo de tejido en campana estéril. A partir de la fase logarítmica cultivo celular de insecto Sf21, semilla a cabo alícuotas de las células en los pocillos y transfectar mediante la adición del genoma de baculovirus purificado y un reactivo de transfección mezclado en medios de cultivo como se ha descrito. ⁶ Cosecha de virus inicial después de 48-60 horas mediante la eliminación de los medios de comunicación ( alta calidad y bajo contenido de virus V _0, por lo general 3 ml por pocillo). Suplemento medio fresco, y de prueba para la producción de proteínas (y, si un marcador YFP está presente, para la fluorescencia) después de un período adicional de 2-3 días. ^6,7
3. La amplificación del virus, bajo régimen de MOI. Usar V ₀ virus para infectar 25-50 ml de células en fase logarítmica (densidad celular <1x10 ⁶ células por ml) en pequeña (100-250 ml) agitador de matraces Erlenmeyer de agitadoen agitadores de plataforma orbital (Figura 3). Contar las células y dividir cada 24 horas hasta que las células dejan de duplicación (paro proliferación). Siga un régimen de baja MOI (multiplicidad de infección es decir, número de partículas virales por célula): Las células deben doblar (al menos) una vez (MOI <1), de lo contrario repita experimentar con un menor volumen de V ₀ agregó. Normalmente, se utilizan 3 ml de ₀ V para infectar 25 ml de células de insecto Sf21 a una densidad de 0.5x10 ⁶ células / ml. Esto es esencial para prevenir perjudicial exceso de amplificación y auto-eliminación de virus que puede resultar en la pérdida de los genes heterólogos de interés. Cosecha de virus de la V ₁ (25-50 ml) después de 48-60 h por la sedimentación de células y la eliminación de los medios de comunicación que contienen el virus. Suplemento por medio fresco y de prueba para YFP y la producción de proteínas mediante la eliminación de las células de 1x10 ⁶ cada 12 ó 24 horas, la granulación y la validación de la producción de proteínas y la señal de proteína marcadora (YFP). ^6, Amplify virus (aV ₂₎ aún si los volúmenes de expresión más grandes tienen como objetivo al infectar a las células 400 ml en 2 L agitador frascos con V ₁ virus respetando la baja MOI régimen anterior (las células deben duplicar al menos una vez después de la infección con V _1). Severidad las pruebas de producción de proteínas y de señal proteína marcadora durante la amplificación para evitar la acumulación de virus defectuosos no contienen los genes de interés. ^5-7 Uso sedimentos de células se acumulan en cada paso ya amplificaciones para establecer protocolos de purificación del complejo proteína expresada de interés.
4. BIIC de almacenamiento de la producción de virus. Recomendamos almacenar virus V ₂ como el virus de la producción mediante el uso de la BIIC (B aculovirus-i nfected i NSECT ells c) método, para evitar modificaciones (por ejemplo, la pérdida del gen de interés) del virus recombinante y para preservar la expresión nivels ¹⁶ células infectadas pellets se observó 24 horas después del arresto la proliferación -. En esta etapa las células contienen partículas virales completas justo antes de que serían liberados (en ciernes) en los medios de comunicación. Retire los medios de comunicación y alícuotas congelación del sedimento de células en nitrógeno líquido y se almacenan de forma indefinida. ^7,16

3. Producción de proteínas y la elaboración secundaria

1. Infección de las grandes culturas (r) y monitoreo YFP. Utilice V _1, V ₂ o BIIC alícuotas congeladas para infectar cultivos de células más grandes para series de producción (por lo general de 400 ml en matraces de 2 L). Adherirse a bajo régimen de MOI (ajustar el volumen del virus utilizado para la infección de manera que la cultura infectada duplica al menos una vez). Ampliar cantidades de cultivos infectados si es necesario multiplicar el número de frascos. Si la proteína YFP marcador está presente, retirar a intervalos definidos las células 1x10 ^6, pellets y lisar las células y supervisar la evolución de la señal de YFP hasta que se alcanza una meseta indicating máxima producción de proteína recombinante. Niveles de YFP se pueden medir en un lector de placa de 96 pocillos estándar capaz de grabar señales de fluorescencia (por ejemplo, Tecan Spectrafluor). Células de la cosecha en esta etapa. Tienda gránulos de las células a -20 ° C (a corto plazo) o -80 ° C (a largo plazo).
2. La lisis celular y fraccionamiento. Lyse células de su método favorito de la elección, a la medida de las necesidades de su proteína (congelación-descongelación, sonicación, prensa francesa, otros). ^5-7 Fraccionar citosol y núcleos y la prueba de la presencia de las proteínas de interés. Desarrollar protocolos de purificación basado en los resultados para simplificar la purificación de proteínas. Considere la aplicación de los procedimientos de remojo para extraer las proteínas de la fracción nuclear en condiciones de alta KCl si sus proteínas residen en el núcleo. ^7,18
3. Purificación de proteínas (micro-escala, a gran escala). Tenga en cuenta que a menudo pequeños volúmenes (10 o 25 ml) de cultivo celular son doficiente para la obtención de gránulos de las células para la purificación de cantidades sustanciales de sus proteínas de interés debido a los niveles normalmente altos o muy altos de producción de proteínas heterólogas en los sistemas de células de baculovirus / insecto (a menudo 10-100 mg de proteína por cultivo L y más). En conjunción con micro-purificación (placas de pocillos múltiples, métodos microtip, sistema de GE Healthcare ÄKTAmicro, otros) es posible obtener los datos bioquímicos y de la actividad y a menudo también cantidad suficiente de las proteínas y complejos deseados para la escala de nanolitros de cristalización de alto rendimiento (HTX ). Considere el uso de purificación de afinidad de metal (Clonetech Takara TALON, resinas Qiagen Ninta quelante de metales) y un oligo-histidina (residuos 6-10) etiqueta en subunidades expuestas de su proteína de complejos para facilitar la purificación, conjuntamente con intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño en pequeña volúmenes utilizando por ejemplo la ÄKTAmicro o una máquina de purificación de pequeño volumen similar (Figura 4 ). Otras etapas de purificación de afinidad e intercambio iónico (IEX pasos), además de la purificación por afinidad con etiquetas oligo-histidina u otras etiquetas (elegir GST, MBP, CBP, otros) puede y debe ser considerado, de acuerdo con las propiedades bioquímicas de las proteínas de los intereses y las preferencias individuales. Considere la posibilidad de etiquetado más de una subunidad con etiquetas de afinidad para mejorar la eficacia de la purificación. Concentre sus complejos de proteínas purificadas y establecer protocolos de almacenamiento, tales como la congelación con o sin glicerol. Desarrollar criterios de control de calidad que se pueden aplicar de forma estándar (ensayos de actividad, pruebas bioquímicas y biofísicas) para evaluar la variación lote a lote de sus proteínas purificadas.

Resultados

Fuerte co-expresión de proteínas heterólogas alcanzados por el sistema de MultiBac se muestra en la Figura 1d (sondas tomadas 48 horas después de infectar una suspensión de cultivo celular). Las bandas de proteínas sobreexpresados ​​son claramente discernibles en todo el extracto de células (SNP) y el lisado aclarado (SN). La calidad y cantidad del material de proteína producida es a menudo suficiente para permitir la determinación de la estructura de los complejos de proteínas, tales como...

Discusión

Vídeo instantáneas en las Figuras 2 y 3 ilustran todo el proceso de generación asistida por robot a partir de ADNc de expresión multigénica construye todo el camino a la infección de cultivos de células de insectos para la producción de proteínas. Nuevos reactivos (plásmidos y virus) y protocolos robustos se han desarrollado para permitir una tubería de depender de SOP. Toda la tubería se ha implementado como una plataforma tecnológica en el EMBL de Grenoble. La plataforma ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103