El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Resumen

RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.

Resumen

Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de ^1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año ^2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante ^3.

Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica ^4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales ^5,6, así como otros tumores sólidos ^7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico.

El análisis de proteínas basado en ⁸ de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos ^9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.

Protocolo

1. La identificación de la heterogeneidad morfológica y molecular del tumor

1. Tumores extraídos de -80 ° C congelador y se mantuvo en hielo seco.
2. Dividir los tumores en secciones de aproximadamente 1 cm ^3. Mapear la posición original de cada sección del tumor respecto a la otra y la etiqueta con un nombre único. Almacenar las muestras en crioviales individuales a -80 º C hasta que esté listo para su uso.
3. Muestras de abrigo en octubre y cortadas en un criostato a -22 ° C.
4. Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina método counterstaining.
5. El análisis microscópico de cortes congelados para asegurar que son de naturaleza ccRCC, tumor viable y para la clasificación (de bajo grado y de alto grado o mixto baja / alta calidad, difícil de diferenciar los grados Fuhrman 1 a 4 de la sección congelada). Figura 1 A y B (H & E tinción de alta calidad y bajo mixta).
6. Seleccione hasta 4 muestras de cada región morfológicamente diferentes dentro de cada tumor para la extracción de proteínas.

2. La extracción de proteínas de muestras de tumores

1. Cortar muestra de tumor de octubre
2. Place 50-75 mg de tejido en tubos de 2 ml con 990 l de tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), NaCl 150 mM] suplementado con aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma, P5716), cóctel inhibidor de fosfatasa 3 (Sigma, P0044) y un cóctel inhibidor de proteasa (Roche, 11836153001).
3. Añadir una sola bola de acero de 5 mm a cada tubo y homogeneizar a 50 Hz durante 5 minutos dos veces utilizando un TissueLyser, comprobando el nivel de homogeneización después de cada período de 5 minutos.
4. Verter la muestra homogeneizada a nuevo tubo de 2 ml con pipeta dejando detrás de la bola de acero.
5. Añadir 10 l de Triton X-100 a cada muestra antes de la centrifugación a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
6. Transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos.
7. Determinar la concentración de proteína usando BCA ensayo (Figura 2).
8. Normalizar las concentraciones de proteína a 1 mg / ml.

3. Validación de anticuerpos

1. Preparar muestras de proteínas (extraído de las líneas celulares adecuadas o tejido) para transferencia Western y se ejecutan en un 10% SDS-PAGE gel.
2. Transferir las muestras a una membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4 ° C.
3. Bloquear la membrana en tampón de Odyssey Li-Cor bloqueo (50:50 diluyó en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Diluir los anticuerpos primarios en Buffer Odyssey Li-Cor 50:50 Bloqueo (diluido en PBS) a los fabricantes recomienda dilución normalmente de 1 en 1.000.
5. Incubar la membrana en los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C.
6. Hacer un 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml de Tween 20 / 1L PBS).
7. Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3).
8. Diluir fluorescente marcada con anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo Odyssey (diluido en PBS 50:50) 0,01% SDS a 1:10,000 dilución (1,5 μl/15 ml).
9. Incube la membrana en secundariaanticuerpos a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - es importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado.
10. Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), manteniendo la membrana en la oscuridad.
11. Lavar la membrana en PBS a temperatura ambiente durante 5 min (x3) para eliminar Tween20 residual, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad.
12. Lie membrana plana sobre un trozo de papel de filtro en la oscuridad y dejar secar al aire - permitiendo que la membrana se seque puede mejorar la señal y reducir el fondo, pero hacen inútil para pelar y re-sondeo.
13. Escanear la membrana en el escáner Odyssey LiCor. Mantener la membrana en la oscuridad hasta el momento en que se ha escaneado.
14. Sólo seleccionar anticuerpos que generan una sola banda predominante en el peso molecular correcto. Figura 3 muestra ejemplos de anticuerpos aceptables e inaceptables para su uso con RPPA.

4. RPPA Printing

1. Proteína lisados ​​fueron avistados en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa (Whatman Fastslides-) utilizando un MicroGrid II robot ayudante. Las diapositivas utilizadas contenían 2 almohadillas en el que las muestras fueron vistos. Cada almohadilla fue vista con muestras idénticas, en este caso 100 muestras. Otros formatos disponibles son 1, 8 y 16 diapositivas de pad. Cuanto mayor sea el número de almohadillas más pequeño es el número de muestras que se pueden observar en cada uno.
2. Una serie de cinco diluciones de 2 veces se hicieron de cada muestra y cada uno fue visto entonces por triplicado (que resulta en un total de 15 puntos por muestra).

5. RPPA de detección de proteínas

1. Portaobjetos húmedos en Buffer LiCor exceso de bloqueo (50:50 diluyó en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en una plataforma oscilante.
2. Preparar 800 l de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo LiCor (50:50 diluyó en PBS) a las concentraciones deseadas y mantener en hielo.
3. Montar las diapositivas, ya sea (i) el clip único chip marcoo (ii) cuatro el 'FastFrame' soporte de diapositivas bahía de modo que un sello hermético se forma entre la corredera y la cámara de incubación.
4. Retire tampón residual de los pozos y añadir 600 l anticuerpo primario a los pozos respectivos.
5. Colocar el portaobjetos y la cámara en una caja sellada húmeda e incubar en la plataforma oscilante durante la noche a 4 ° C.
6. Completar hasta 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 l de Tween 20/100 ml de PBS).
7. Retire los portaobjetos de la cámara frigorífica y retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada pocillo.
8. Añadir 600 l de PBS-T y lavar los portaobjetos en la plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 5 min (X3).
9. Preparar fluorescente marcada con anticuerpos secundarios mediante la dilución en tampón de bloqueo Odyssey (50:50 diluyó en PBS) 0,01% de SDS a 1:2,000 dilución (1 l / 2 ml) en la primera instancia.
10. Retire tampón de los pocillos y añadir 600 l fluorescente marcada con anticuerpos secundarios a los pozos respectivos. Incubar anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - loEs importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado.
11. Eliminar los anticuerpos secundarios de lavado bien y brevemente (x3) en 600 l de PBS-T a temperatura ambiente. Extraer el portaobjetos de la portadora, transferir a un recipiente adecuado y lavar en exceso de PBS-T durante 15 minutos, manteniendo la membrana en la oscuridad.
12. Retirar PBS-T y la membrana lavado adicional con PBS a temperatura ambiente durante 15 min para retirar los residuos de Tween-20, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad.
13. Secar la Fastslide en 50 ° C horno durante 10 min y luego escanear en el escáner Odyssey Li-Cor. Mantenga la diapositiva en la oscuridad hasta que se hayan escaneado.
14. Escanear el portaobjetos a 680 nm y / o 800, dependiendo del anticuerpo secundario / anticuerpos utilizados. Para la detección de dos colores siempre uso altamente transversal adsorbidos anticuerpos secundarios para minimizar la reactividad cruzada. La cuidadosa selección de anticuerpos primarios y secundarios es necesario para la detección de dos colores. De importancia primaria es la selección de losespecies diferentes de acogida (por ejemplo, conejo y ratón) para los dos anticuerpos primarios. Esto permite la discriminación por anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón que están marcados con colorante con espectros de emisión fácilmente distinguibles.
15. Los archivos de imágenes se guardan como archivos. Tiff. Figura 4 (imagen de los archivos escaneados).

6. Análisis de Datos

1. Activar el software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EE.UU.).
2. Abra. Archivo tiff imagen que contiene el análisis de la diapositiva RPPA.
3. Seleccionar un archivo de plantilla predefinida que tendrá una rejilla para superponer sobre la imagen de la diapositiva RPPA.
4. Haga clic en la Definición de zonas de interés (ROI) botón para que aparezca la cuadrícula.
5. Coloque la rejilla sobre los puntos RPPA. Figura 6a (imagen de la cuadrícula sobre la imagen).
6. Haga clic en el botón Seleccionar todo para seleccionar todo el ROI.
7. Haga clic en Buscar todos. MicroVigene se Automticamente encontrar el ROI, encontrar los puntos, se resta el fondo, limpie el polvo y cuantificar las manchas.
8. Haga clic en el botón Ver Curve dilución para mostrar los resultados de todas las muestras de la diapositiva RPPA.
9. Haga clic en Guardar Datos de dilución.
10. Como cada muestra se imprime a través de 5 puntos cada dilución por triplicado hay 15 puntos a analizar, lo que reduce el riesgo de errores y mejora la calidad de ajuste de la curva. MicroVigene produce un 4-parámetro logistic-log modelo "Supercurve" algoritmo (Figura 6b), que incorpora todos los puntos para producir una curva sigmoidea de la cinética de anticuerpos de unión a antígeno. El supuesto es que los mismos anticuerpo-antígeno cinética de unión se lleva a cabo en cada punto de la muestra, incluso en las diferentes muestras, por lo tanto, tomando todos los puntos en una matriz para ajustar una curva de respuesta común puede aumentar la confianza del ajuste de la curva ^10,11
    Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
    donde x es la dilutiofactor n e Y es la intensidad de la señal.
    Las muestras pueden ser analizadas comparativamente con el valor y0, que en nuestro análisis corresponde al valor de y en el punto medio de los valores de x después de la asignación de aquellos en el supercurve.
11. Exportar los datos en Microsoft Excel y la trama y0 como en la figura 7.
12. Varianza proteína intratumoral se calculó por separado para los pacientes tratados no tratados y tratados en un marco de ANOVA. Distribuciones de varianza combinando los datos de todas las proteínas analizadas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney (MWT). Variaciones intratumorales de proteínas individuales se compararon mediante una prueba F donde las hipótesis de normalidad y homocedasticidad celebradas respectivamente evaluó mediante la Lillefours y pruebas Fligner, tasa de falso descubrimiento (FDR) corrección se aplicó ^12. La expresión diferencial de proteínas entre muestras de los pacientes tratados y no tratados fue probado para cada proteína usando la t de Student prueba donde la normalidad y la homoscedasticidad suposicións se cumplieron, por lo demás MWT se realizó, FDR fue aplicado sobre valores combinados t-test y MWT ^12. Importancia de la expresión de la proteína y la correlación de Pearson varianza para las proteínas se estimaron utilizando un enfoque estándar [R de referencia] y FDR aplicado ^12.

Resultados

Un ejemplo de una diapositiva escaneada RPPA se puede ver en la Figura 4 (i) con dos canales 680 y 800 nm mostradas. La separación de las imágenes por longitud de onda, la Figura 4 (ii) permite a cada almohadilla en la diapositiva RPPA a analizar y expresión de la proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como se puede ver en la Figura 4 (iii) la expresión de las proteínas individuales en las muestras es único con gelsolina tiene un alto ni...

Discusión

El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aume...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
aprotinina	Sigma	A6279
cóctel de inhibidores de fosfatasa 2	Sigma	P5726
cóctel de inhibidores de fosfatasa 3	Sigma	P0044
cóctel inhibidor de la proteasa	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey tampón de bloqueo	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robot vigilante	Biorrobótica
Cuatro FastFrame 'bay soporte de diapositivas	Whatman	10486001
RÁPIDO Slide - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT cabra anti-ratón IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW cabra anti-conejo IgG	Licor	926-32211