Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

Resumen

Aquí presentamos un método electrofisiológico basado en membranas de soporte sólido con el foco en sus aplicaciones para la caracterización de transportadores de membrana electrógenos.

Resumen

El método electrofisiológico se presenta se basa en una membrana sólida apoyado (SSM) compuesta de una capa octadecanotiol quimisorbida sobre un chip sensor recubierto de oro y una monocapa de fosfatidilcolina en la parte superior. Este conjunto está montado en un sistema de cubeta que contiene el electrodo de referencia, un alambre de plata clorada.

Después de la adsorción de fragmentos de membrana o proteoliposomas que contienen la proteína de membrana de interés, una bolsa de solución rápida se utiliza para inducir la actividad de transporte de la proteína de membrana. En la solución de un solo cambio de protocolo dos soluciones, se necesitan uno no activación y una solución activadora,. El flujo es controlado por un sistema de válvula y el tubo de aire a presión y dentro de una jaula de Faraday.

La cinética de la actividad de transporte electrogénico se obtiene a través de acoplamiento capacitivo entre el MSE y los proteoliposomas o fragmentos de membrana. El método, por lo tanto, produce sólo transiencamisetas corrientes. La corriente de pico representa la actividad de transporte estacionaria. Las corrientes transportador dependientes del tiempo pueden ser reconstruidos por el análisis de circuitos.

Este método es especialmente adecuado para transportadores de procariotas o eucariotas transportadores de las membranas intracelulares, que no pueden ser investigadas por patch clamp o métodos de fijación de voltaje.

Introducción

Aquí se demuestra un nuevo enfoque electrofisiológico basado en una membrana de apoyo sólido (SSM) para la caracterización de las proteínas de membrana electrógenos.

El soporte sólido consiste en una capa delgada de oro sobre un portaobjetos de vidrio, el chip del sensor. La superficie de oro hidrófilo se utiliza para enlazar el grupo tiol de un reactivo alcanethiol. Después, selfassembly de un monolyer fosfatidilcolina completa la formación de la SSM.

Para medir reacciones electrógenos de proteínas de membrana, proteoliposomas o fragmentos de membrana se adsorben a la SSM (Figura 1). La proteína que contiene la membrana y el MSE a continuación, formar un sistema de membrana acoplado capacitivamente. Por lo tanto, la translocación de carga en la membrana que contiene la proteína puede ser detectada por acoplamiento capacitivo a través de la SSM. Este método produce sólo corrientes transitorias. La corriente de pico representa la actividad de transporte estacionaria. La cu transportador dependiente del tiemporrents puede ser reconstruido por el análisis de circuitos.

El chip sensor está montado en un sistema de cubeta (Figura 2). La cubeta tiene un volumen cubeta cilíndrica de 17 l (volumen neto con junta tórica montada). Un pasador de resorte de contacto crea el contacto con el amplificador. Un conector de salida está atornillado a la parte superior de la parte principal y lleva el electrodo de referencia, un alambre de plata clorada.

La cubeta está montado en una jaula de Faraday. Está conectado a una vía de fluido, que se utiliza para inducir la actividad de transporte de la proteína de la membrana en respuesta a un cambio de solución rápida (Figura 3). En la solución de un solo cambio de protocolo dos soluciones, se requieren un no-activación y una solución activadora,. El flujo es controlado por aire a presión usando un software de control de la válvula en un ordenador o interruptores manuales en una caja de interfaz.

Protocolo

1. La creación de un aparato para Electrofisiología MSE basado

Los detalles aparecen en dos de nuestras publicaciones técnicas, que también contienen dibujos esquemáticos y fotografías de nuestras cubetas y establecer ^{1, 2.} Diferentes configuraciones de cambio de solución y los protocolos de flujo también se discuten en nuestro método de papel ^2.

A continuación añadimos algunas mejoras recientes y los detalles técnicos que son de relevancia directa para la presentación de vídeo.

Válvula de control y adquisición de datos

La caja de interfaz contiene un / interface comercial digital USB de salida analógica de entrada (NI USB 6009 National Instruments) y los controladores de válvulas. Se controla el flujo de la solución y es responsable de la adquisición de datos. Las válvulas son normalmente conducidos con 12 V. Sin embargo, para cambiar rápidamente las válvulas pueden ser accionadas con una tensión de hasta 18 V. En el video que utilizan una fuente de alimentación de 12 V.

La placa de circuito impulsor de la válvula puede operar cuatro válvulas. Fue fabricado en el taller del Instituto Max Planck de Biofísica. Las válvulas pueden ser controladas por ordenador o manualmente a través de interruptores en el panel frontal. Este último es conveniente para los procedimientos de limpieza-y-lavado. Durante la medición, la interface es controlado por ordenador mediante una válvula de control y el software de adquisición de datos ⁽² Surfe software R, IonGate Biosciences).

2. Preparativos

En esta sección se mencionan los diferentes protocolos para la preparación de un experimento de electrofisiología SSM-based.

Haciendo 2,1 la solución de lípidos para la formación de la SSM

1. Mezclar 25 l octadecilamina (5 mg / ml en cloroformo) y 375 l Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml en cloroformo) en un vial de vidrio.
2. El uso de un evaporador rotatorio y el flujo de gas nitrógeno continuo, se evapora el cloroformo paraaproximadamente 30 min.
3. Quite la grasa de las paredes de la ampolla de cristal sacude con 500 l de n-decano. La concentración final de lípidos es de 15 mg / ml con 1:60 (w / w) octadecilamina.
4. Transferir la solución en el vial de vidrio de almacenamiento. Almacenar la solución de lípidos a -20 ° C.

2.2 La cloración del electrodo de referencia

Los electrodos de referencia tienen que ser clorada en intervalos regulares debido a la abrasión.

1. Retire el resto de la capa de silverchloride de edad usando papel de lija fino antes de que el proceso de cloración.
2. Coloque el alambre de plata junto con un electrodo de platino en una solución 1 M de ácido clorhídrico y cloro durante 15 minutos a 0,5 mA. Después de completar la cloración, el alambre de plata cambia su color a un color gris oscuro homogéneo.

2.3 Preparación del puente en gel de poliacrilamida

1. Preparar una solución que contiene 100 mM de KPi a pH = 7, 100 mM de KCl y 6% De acrilamida.
2. Añadir 0,3% de APS (10% Stock) y 0,6% TEMED y poco mezclar la solución con una pipeta.
3. Inmediatamente después de mezclar la solución, utilizar una pipeta para inyectar 30 l de la mezcla en el recipiente de puente gel de vacío. Es importante evitar las burbujas de aire durante la inyección.
4. Durante un tiempo de incubación de 20 min se polimeriza el gel.
5. Después de la polimerización el puente de gel se almacena en solución (KPi 100 mM, pH 7, 100 mM de KCl). Para prolongar la vida útil del puente de gel de la solución se almacena a 4 ° C.

2.4 Preparación de las soluciones de medición

Debido a la fuerte interacción de los solutos con el SSM, se generan artefactos eléctricos cuando se intercambian soluciones de diferente composición. Por lo tanto, la preparación de las soluciones es un paso crítico. Tome las siguientes precauciones durante el proceso de preparación de la solución para minimizar los artefactos de cambio de solución.

1. Hacer no la activación y la activación de soluciones de un lote, ajustar el pH y la fuerza iónica.
2. Fondo de alta sal ayuda a reducir los artefactos de cambio de solución.
3. Divida la solución por lotes en dos volúmenes.
4. Añadir el compuesto activador a la solución activadora. Usar un compuesto compensatorio en la solución no-activador para mantener la osmolaridad y la fuerza iónica de ambas soluciones lo más similar posible.
5. Si las soluciones se almacenan a 4 ° C, asegúrese de que todas las soluciones alcanzaron la temperatura ambiente antes de iniciar una medición, ya que incluso pequeñas diferencias de temperatura pueden producir artefactos.

3. Un experimento Electrofisiología MSE basado

Aquí se presenta un protocolo típico de un experimento electrofisiológico SSM-based.

3.1 Preparación de la instalación de SSM

Si bien el programa de instalación MSE no está en uso, los tubos se llenan con un 30% de etanolSolución / agua para evitar el crecimiento bacteriano.

1. Lavar el sistema con agua pura para eliminar el etanol a partir de la tubería antes de que el montaje de la cubeta. Vuelva a colocar los contenedores de etanol con recipientes de agua. Uso de alta presión (0,6 a 1,0 bar) limpiar el sistema con 20-30 ml de agua.
2. Repetir el procedimiento de limpieza usando un tampón KPi 100 mM a pH 7,6 o solución no activación.
3. Asegúrese de que no queden burbujas de aire en el sistema de fluido.

3.2 Montaje de la cubeta

1. Conecte un o-ring para el electrodo de referencia
2. Tome el puente gel a partir de la solución de almacenamiento y conectar el electrodo de referencia.
3. Prellenado el conector de salida con tampón de no activación, insertar una junta tórica y conectar el puente de gel para completar el conjunto de electrodo de referencia. Tenga especial cuidado de que no hay burbujas de aire en la unión del puente de gel y la vía de flujo de la solución de salida.
4. Premontar la parte principal de la cubaTTE mediante la adición de la clavija de contacto de muelle (conexión con el amplificador), el tubo de entrada (conexión a la terminal de válvulas), la junta tórica (sellado para el MSE) y los tornillos.
5. Usando unas pinzas, tomar el chip sensor fuera de la solución de almacenamiento (octadecanotiol 10 mM en etanol).
6. Con una pipeta, lavar la solución restante con aprox. 5 ml de etanol puro.
7. Secar el electrodo bajo gas nitrógeno.
8. Coloque el chip sensor con precisión sobre la parte de base de la cubeta de manera que el orificio de entrada de la parte principal de la cubeta se dirige a la zona activa circular del sensor.
9. Añadir 1 l de la solución de lípidos a la zona activa del chip sensor. Asegúrese de que la capa de oro está totalmente cubierta por la grasa.
10. Inmediatamente después de añadir la solución de lípidos, cerrar la cubeta mediante la adición de la parte principal preensamblados.
11. Antes de montar la cubeta en la jaula de Faraday, asegúrese de que todas las superficies estén completamente secas.
12. Connect el amplificador a la clavija de contacto de resorte y el tubo de entrada a la válvula de terminal. A continuación, fije la cubeta con los tornillos dentro de la jaula de Faraday.
13. Atornillar el conector de salida a la parte superior de la cubeta. Finalmente conectar el tubo de salida para el conector de salida y el generador de voltaje al electrodo de referencia.
14. Inmediatamente después del montaje de la cubeta de lavar el sistema con tampón a 0,6 bar. Esto conduce a la formación espontánea SSM.

3.3 Parámetros de membrana de medición

Para comprobar la calidad de la SSM, la capacitancia y la conductancia se miden utilizando el generador de funciones.

1. Utilizando el generador de función, se aplican 100 mV voltaje de CC para medir la conductancia.
2. Calcular la conductancia: La disminución de corriente muestra la carga del condensador de membrana. Después de que el condensador se carga completamente los rendimientos actuales de medición de la conductancia de la membrana utilizando la ley de Ohm. En aras de la simplicidad se utiliza el Current 1 seg después de que el voltaje se aplica para el cálculo de la conductancia G = E / U.
3. Aplicar un voltaje de CA triangular de 50 mV pico a pico de amplitud y una frecuencia de 0,5 Hz para medir la capacitancia.
4. Calcular la capacitancia: La amplitud de la corriente de onda cuadrada resultante representa las corrientes de carga del condensador. La capacitancia C es igual a la carga transferida Q = IΔt dividido por ΔU = 100 mV. (ΔU es el doble de la tensión aplicada de 50 mV porque I es la diferencia actual pendiente positiva menos negativo de la tensión triangular.)
5. Monitorear los parámetros eléctricos de la membrana varias veces cada 10 min durante aprox. 30 a 40 minutos, hasta que se alcancen valores constantes. Lavar en el medio con tampón KPi a alta presión en el intervalo de aproximadamente 0,6 a 1 bar.
6. Estimación de la calidad del SSM: Los parámetros óptimos están en el rango de 0,1 a 0,2 nS y 2 a 3,5 nF. Una alta conductividad por encima de 0,8 nS capacitancia y baja por debajo de 1 nF indicaque el MSE no está bien formado. Una alta capacidad por encima de 4 nF puede implicar que la zona activa no está cubierto completamente por el SSM.
7. Si los parámetros no están en el intervalo óptimo, la membrana debe ser desechado y otra SSM preparado, utilizando un chip de electrodo recién preparada.

3.4 Comprobación de los artefactos de cambio de solución

Después de que los parámetros de membrana se han comprobado, los tampones de medición deben ser probados para artefactos de cambio de solución.

1. Insertar los respectivos contenedores de solución para el sistema de fluido.
2. Eliminar las burbujas de aire del sistema del fluido, utilizando las válvulas manuales.
3. Utilizando el software de adquisición de datos eligió el protocolo de flujo que desea utilizar en su experimento.
4. Ajustar la presión a 0,6 bar y comenzar la medición.
5. Además de los artefactos de conmutación de válvulas mecánicas, idealmente sin corrientes de artefactos deben ser medidos o deberían ser mucho smaller de las señales esperadas de transporte de proteínas. Si se observan artefactos de cambio de solución, tratar de optimizar las composiciones de amortiguación y / o el procedimiento de preparación antes de continuar el experimento.

3.5 Adición de la muestra proteica

Por lo general, proteoliposomas o fragmentos de membranas se almacenaron congeladas a -80 ° C. Para una medición se necesita una alícuota de aproximadamente 30 l.

1. Enjuague la SSM con una solución no-activación.
2. Descongelar la muestra de proteína en el hielo.
3. Tres ciclos de sonicación de 10 seg se alternan con intervalos de enfriamiento de 10 segundos en hielo. Proteoliposomas se sometieron a ultrasonidos utilizando un sonicador de baño. Para los fragmentos de membrana se utiliza un aparato de ultrasonidos punta (50 W, 30 kHz, 1 mm de diámetro sonotrode, intensidad de 20%, el ciclo de 0,5). Después de la última etapa de sonicación no ponga la muestra de nuevo en hielo, pero lo inyecta inmediatamente en la cubeta.
4. Desatornillar el conector de salida junto con el electrodo de referencia assembly.
5. Con una pipeta, aspire 30 l de la muestra de proteína y montar la punta de la pipeta en el taladro de salida.
6. Abrir la válvula manual en la vía no-activador para el contenedor de residuos e inyectar los proteoliposomas en el volumen de la célula. Tenga cuidado de no inyectar aire en el volumen de la célula con el sensor.
7. Antes de retirar la punta de la pipeta, cerrar la válvula manual para evitar un mayor flujo de la solución.
8. Permitir que los proteoliposomas para adsorber al MSE para un tiempo de incubación de 1 a 2 horas. También es posible incubar durante toda la noche.

3.6 Procedimiento general de un experimento MSE basado

1. Calentar los tampones de medición en el tiempo, si se almacenan a 4 ° C. Todos los tampones de medición tienen que estar a temperatura ambiente antes de iniciar la medición para evitar artefactos.
2. Al cambiar las soluciones, primero limpiar los tubos dentro de los contenedores de solución con un tejido no fuzzing, a continuación, insertar las nuevas botellas.
3. Antes de iniciar la medición, utilice las válvulas manuales para eliminar las burbujas de aire, que podrían haber evolucionado a partir de la operación del cambio.
4. Ajuste la presión justo antes de iniciar una medición. Nosotros usamos una presión de 0,6 bar, que en nuestra válvula y el tubo de la configuración específica se obtiene un caudal de aproximadamente 1,0 ml / seg.
5. Las primeras mediciones se pueden llevar a cabo directamente una tras otra y deben ser rechazados hasta que el pico de corriente se mantiene constante. Si las soluciones difieren en el pH que se necesita un tiempo de incubación de al menos 3 min para ajustar el pH interno de los proteoliposomas antes de iniciar la medición.
6. Ahora la configuración está listo para la medición. Para reducir el ruido de al menos 3 mediciones deben realizarse y se promediaron.

3.7 Medidas de control

Un resumen de la señal durante una serie de mediciones podría ocurrir debido a la degradación de la proteína o una pérdida de la adsorción. Cada experimento SSM debe iNCLUDE un control descuidado. Esto se hace mediante mediciones repetidas con soluciones idénticas. El control mínimo resumen significa una medición al principio y otra al final del experimento, usando la misma solución.

Recomendamos hacer el control resumen en condiciones en las que se pueden esperar de la amplitud pico más alto en el experimento. Esto hace que sea más fácil cuantificar el resumen de la señal.

El resumen de señal se puede cuantificar mediante una comparación de las amplitudes de pico de los dos controles degradadas. El valor porcentual resultante se puede utilizar para corregir las señales medidas por suponiendo una dependencia del tiempo lineal de la escaleta.

3.8 Controles Artefacto

Si es posible tratar de validar sus resultados mediante la inhibición de la proteína de interés después del experimento. Señales restantes son probablemente artefactos de cambio de solución. Las señales a continuación, tienen que ser corregidos para los artefactos de medición.

3.9 Después del experimento

1. Lavar el sistema con 20-30 ml de agua pura y 20-30 ml de 30% de etanol / agua. La solución etanólica evita el crecimiento bacteriano cuando el sistema no está en uso.
2. Después de este procedimiento de limpieza, libere la presión del sistema y apague todos los instrumentos.
3. Retire la cubeta de la jaula de Faraday y desmontarlo. Todas las partes de la cubeta se pueden limpiar con agua y etanol puro, si es necesario, mediante el uso de un baño de ultrasonido.
4. Coloque el chip sensor en un vaso de precipitados de vidrio con etanol puro. Someter a ultrasonidos el vaso de precipitados durante aproximadamente 1 a 2 minutos usando un sonicador de baño.
5. Secar el chip sensor de bajo gas nitrógeno.
6. Guarde el chip sensor de la luz en una solución etanólica Octadecanthiol 10 mM. Después de un tiempo de incubación de alrededor de 30 min el chip sensor está listo para su reutilización.

Resultados

Hasta ahora, la electrofisiología MSE basado se utilizó para caracterizar más de 20 transportadores, en su mayoría de origen procariótico, por ejemplo MelB ^{3, 4} y NhaA PutP ⁵ (que se resumen en ^6). Pero también transportadores eucariotas de las membranas intracelulares, por ejemplo, ClC7 ^7, así como canales de iones, por ejemplo, el receptor de acetilcolina nicotínico ⁸ han sido investigados.

Aquí se presenta como un ejemplo mediciones de la azúcar / H + cotransportador LacY a partir de Escherichia coli utilizando proteoliposomas con el lado derecho, al menos, 85% a cabo orientado LacY a una LPR de 5 ^{9, 10.} Nos centramos en los principales pasos que conducen a un modelo mínimo cinética de esta proteína de transporte.

1. Caracterización electrofisiológica de LacY tipo salvaje

El primer paso es una caracterización general de la reacción electrogénico mediante la medición de diferentes valores de pH ( > Figura 4), ​​las concentraciones de sustrato (Figura 5) y sustratos. Para validar la técnica, K _M y valores de pK dado en la literatura se reprodujeron.

La dependencia del pH de LacY muestra dos reacciones diferentes electrógenos. Los aumentos actuales capacitivamente acoplados entre pH 5 y pH 8,5, pero también cambia su forma. En condiciones alcalinas se observa transporte estado estacionario, mientras que para valores de pH ácido sólo una reacción rápida electrogénico permanece. Para distinguir las señales de estado de equilibrio de las reacciones rápidas electrógenos que utilizamos análisis de circuitos para reconstruir corrientes transportador (Figura 6).

A pH 7 la señal bifásica se convierte en monofásica. Esto también indica que hay dos reacciones diferentes electrógenos. Estimado de la carga transferida (integral de las señales), las dos reacciones tienen aproximadamente 6% y 94% del total de electrogenicity el ciclo de transporte.

ove_step "> 2. Asignación de las reacciones electrógenos

Para asignar las dos reacciones electrógenos a pasos particulares en el ciclo de reacción de encaje, se midió la variante LacY E325A (Figura 7). Esta variante sólo muestra intercambio lactosa pero es deficiente para todos los modos de transporte activo, debido a la inhibición de la liberación de protones. La señal de E325A LacY representa un transitorio rápido y es constante para todos los valores de pH medidos. La forma y la amplitud de la señal es similar a la señal de tipo salvaje LacY en condiciones ácidas. Además se observa una pequeña fase negativa después de la disminución de la corriente de pico, que es característica de corrientes transitorias rápidas medidos en sistemas acoplados capacitivamente. Debido a la unión de lactosa y la liberación no es electrógeno, la transitoria rápida deben correlacionarlos con una transición conformacional electrogénico siguiendo lactosa vinculante.

Se sabe que la etapa de liberación de protones es la tasa de limiting por movimiento de Lacy en el modo de transporte impulsado por gradiente de concentración de lactosa. En este caso se espera un aumento de la velocidad de transporte con pH alcalino, debido a la liberación de protones se ve favorecida. Este es el caso para el transporte en estado estacionario de señal de tipo salvaje LacY correlacionados. Por otra parte se pudo demostrar por medición gradiente de pH que sólo el pH interno influye en el transporte en estado estacionario de LacY (no publicado). Por lo tanto la gran reacción electrogénico podría ser asignado a la etapa de liberación de protones.

3. Las mediciones para el análisis cinético

Después de la identificación de las reacciones electrógenos dentro y fuera de las tarifas de transporte se determinaron utilizando una configuración de SSM con una alta resolución temporal de alrededor de 4,5 milisegundos. Esto sólo es posible en condiciones, cuando una reacción domina la señal. En este caso, las constantes de velocidad se pueden derivar de las corrientes transitorias en consideración del tiempo de resolución de las señales mediante un proceso iterativo de mínimos cuadrados de algoritmo de convolución (Figura 8). Las constantes de velocidad determinados, así como el modelo cinético mínimo propuesto (Figura 9) se utilizaron finalmente para la simulación de la cinética del transportador. Las curvas simuladas se reproducen los datos de SSM que demuestra, además, el modelo cinético.

Figura 1. Adsorción geometría de proteoliposomas en el SSM. El MSE se forma sobre un chip sensor, un oro estructurado portaobjetos de vidrio recubierto. Para medir las reacciones electrógenos de proteínas de membrana, proteoliposomas o fragmentos de membrana se adsorben a la SSM. Las dos membranas forman un sistema acoplado capacitivamente. Por eso sólo se detectan corrientes transitorias.

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Figura 2. El MSE cubeta lleva el chip sensor y el electrodo de referencia. El chip sensor está emparedada entre la base y la cubeta de la cubeta de la cabeza. El electrodo de referencia está aislado de la vía de flujo mediante un puente de sal gel de poliacrilamida.

Figura 3. Vía de fluido y el circuito eléctrico de la instalación de SSM. En el protocolo de intercambio de una solución única se requieren sólo una no activación (NA) y un activador (A) solución. El flujo es controlado por dos válvulas de 2 vías (V1) y una válvula de terminales (V2). Los interruptores de las válvulas terminales entre soluciones no activadoras y activación, la dirección de una de las soluciones a la cubeta y la otra solución a un recipiente de residuos (W). El chip sensor (SSM) está conectado al amplificador (E / T), mientras que el electrodo de referencia (AgCl) está conectado al generador de función (F) en el circuito eléctrico externo. Un ordenador (PC) y una caja de interfaz se utilizan para el funcionamiento de la válvula y la adquisición de datos.

La Figura 4. Corrientes transitorias medidos con proteoliposomas encaje de tipo salvaje después de 100 mM de concentración de lactosa saltos a diferentes valores de pH. La solución no activadora contenían 100 mM de glucosa, mientras que la solución activadora contiene lactosa 100 mM. Todas las soluciones se prepararon en 100 mM de tampón de fosfato potásico al pH indicado con DTT 1 mM. Para los detalles de las condiciones de medición en esta y en las siguientes figuras consulte a ⁹ y ^10.

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Figura 5. Promediados corrientes de pico normalizadas midieron con proteoliposomas de encaje de tipo salvaje después de saltos concentración de lactosa en diferentes concentraciones y valores de pH. Los valores de K _M se obtuvieron a partir de los ajustes hiperbólicos.

La Figura 6. Reconstrucción de las corrientes transportadoras. Las corrientes transitorias (A) utilizado para reconstruir las corrientes transportador (B) se midieron con proteoliposomas encaje de tipo salvaje después de 100 mM lactosa saltos de concentración a pH 8,5 (traza azul) y pH 5,2 (línea roja). A pH 8,5 se observa rotación continua, mientras que a un pH de 5,2 se produce una reacción electrogénico rápido. Esto se observa claramente en la actual reconstruida (B).

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Figura 7. Corriente transitoria mide con E325A proteoliposomas de encaje después de un salto de lactosa 100 mM de concentración a pH 5,2. Esta variante LacY se inhibe en la etapa de liberación de protones del ciclo de transporte y por lo tanto deficiente en el transporte. El pequeño componente negativo observado es característico de corrientes transitorias rápidas medidos en sistemas acoplados capacitivamente y es causada por la descarga de la capacitancia de la membrana después de una reacción electrogénico rápido. Su tiempo de π0 constante está determinada por las capacitancias y conductancias del sistema (Figura 1).

Figura 8. Corrientes transitorias medidos con proteoliposomas encaje de tipo salvaje after diferentes saltos de concentración de lactosa a pH 5,2. En estas condiciones no hay transporte en estado estacionario se observa, sino una transición conformacional electrógeno a la lactosa vinculante. La línea discontinua muestra la función de transferencia que representa la resolución de tiempo del sistema. El recuadro muestra la determinación del encendido y apagado de las constantes de velocidad k obs constantes de velocidad observadas con un ajuste hiperbólico a los datos. La constante de velocidad observada se determinó a partir de las corrientes de compensación con un algoritmo de deconvolución iterativa de mínimos cuadrados ^10.

La Figura 9. Un modelo cinético para el ciclo de reacción de encaje. Dos pasos electrógenos podría ser identificado y caracterizado por medidas SSM. Una reacción fuertemente electrogénico que representa ~ 94% del desplazamiento de carga total en la reacciónciclo sólo se observó a valores de pH neutros y básicos. Podría ser asignado a la etapa de liberación de protones (flecha azul). Se observa un paso débilmente electrogénico a pH ácido cuando se inhibe la rotación continua de la de tipo salvaje de encaje. Se asignaron de esta reacción a una transición conformacional electrogénico a la lactosa de unión, que representa el 6% del desplazamiento total de carga en el ciclo de reacción.

Discusión

1. Ventajas de electrofisiología MSE basado en comparación con los métodos convencionales

Electrofisiología SSM basada ha demostrado ser una herramienta valiosa de la caja de herramientas electrofisiológico. Es especialmente útil en los casos en que la convención de electrofisiología, es decir, patch clamp y los métodos de fijación de voltaje, no se puede aplicar: Salvo algunas raras excepciones transportadores de bacterias no pueden ser investigados mediante abrazadera de tensión o métodos de patch clamp, debido al pequeño tamaño de las bacterias y porque que son difíciles de expresar en células de mamífero u oocitos. Pero también fisiológicamente transportadores de mamíferos pertinentes pueden ser investigados. En este caso electrofisiología MSE basado es atractivo para los transportadores de las membranas intracelulares y para aplicaciones de detección en el descubrimiento de fármacos debido a su robustez y su potencial para la automatización.

SSM-basedUsing electrofisiología, el tiempo caracterización resuelto convencional de transporta ores es un reto. Dado que el volumen de negocios de los transportistas es bajo un "parche gigante o se requiere la configuración de una" célula entera ", que tiene una resolución de por sí bajo el tiempo en un experimento de cambio de solución. La complicación puede ser superada mediante la liberación sustrato fotolítica. Sin embargo, sólo un número limitado de sustratos son adecuados para este enfoque. Aquí el intercambio solución rápida a la SSM ofrece la oportunidad única de realizar estudios electrofisiológicos con una alta resolución temporal utilizando sustratos arbitrarias.

2. Limitaciones y pasos críticos

En contraste con patch clamp y técnicas de fijación de voltaje, la electrofisiología MSE basado no se puede utilizar para aplicar un potencial. Por lo tanto, la caracterización Transportador se limita a los modos de transporte que no se basan en un potencial de membrana.

En general, la electrofisiología MSE basado no tiene limitaciones en cuanto al tipo del transportador (electrogénico). Pero cl voltajeamplificador o parche métodos de sujeción pueden tener ventajas, si se requieren componentes intracelulares como las proteínas de unión para la funcionalidad de proteínas.

Las limitaciones pueden surgir, en caso de cambio de solución crea grandes corrientes de artefactos. Esto sucede cuando el sustrato interactúa fuertemente con el MSE como en el caso de compuestos lipófilos. Artefacto controles se pueden utilizar para corregir las señales medidas. Además fondo elevado de sal en todos los tampones de medición se puede utilizar para reducir los artefactos. Sin embargo, en los casos, donde el tamaño del artefacto es comparable a la señal de la proteína, es casi imposible para aislar la señal de la proteína relacionada con el artefacto. Afortunadamente, los altos artefactos son inusuales en un intercambio solución optimizada.

Hay algunos pasos que son fundamentales para la realización con éxito de un experimento de electrofisiología SSM-based. La preparación de la muestra de proteína es la parte más importante. Si se utilizan proteoliposomas, asegúrese de que las reconstución proceso produce una muestra limpia, reproducible de una LPR suficiente y el transportador está orientado en la forma correcta. La LPR se puede comprobar por congelación fractura microscopía y la orientación de electrones por un experimento ELISA de anticuerpos si están disponibles.

Utilice sólo un SSM que muestra los parámetros óptimos para la incubación de la muestra de proteína. La inyección de la proteína es un paso crítico. La sonicación es esencial y las burbujas de aire se deben evitar durante la inyección. Después de la incubación de la muestra el propio mediciones son fundamentales, ya que las burbujas de aire se retire la muestra de proteína adsorbida del chip sensor. Por lo tanto siempre eliminar las burbujas de aire después de cambiar las soluciones. Sin embargo, puede ocurrir un resumen de la señal. Para corregir una posible señal de resumen, es esencial para llevar a cabo controles degradadas durante el experimento.

3. Sistemas Especializados

La SSM-Setup se puede modificar en función de su aplicación. Por otra parte taquí son completamente diferentes configuraciones, altamente especializados disponibles.

Existe la posibilidad de medir señales de la proteína en condiciones asimétricas, por ejemplo en virtud de un gradiente de pH. Para establecer composiciones tampón asimétricos dentro y fuera de los proteoliposomas tercera solución, la solución en reposo, tiene que ser introducido y esto requiere una configuración de doble intercambio. Aquí se requiere una conmutación entre las soluciones no-activación y de reposo de la válvula de tres vías adicional.

Para aumentar la resolución de tiempo del sistema que hemos desarrollado una vía de flujo alternativo que carece de la válvula de terminal, pero usando un tipo diferente de cubeta. Aquí la unión de activación y la solución no activación se encuentra dentro de la cubeta, 3 mm en frente de la SSM. Esta configuración es muy adecuado para análisis de la cinética de los procesos de transporte rápido. Se pudo demostrar que el tiempo de resolución tan bajo como 2 ms es posible.

F Comercialully sistemas automatizados están disponibles con el objetivo de un rendimiento significativamente mayor para la detección de drogas. Una unidad móvil recoge soluciones y los inyecta en la superficie del sensor en placas de 96 pocillos en un formato de placa de microtitulación estándar.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Waterbath Sonicator	Bandelin	RK 52 H
Tip Sonicator	Hielscher Ultrasonics GmbH	UP50H
2-way valve	NResearch, West Caldwell, USA	NR225T011
Terminal valve	NResearch, West Caldwell, USA	NR225T031
Manometer	Greisinger electronics	GDH 14 AN
Faraday cage	Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette	Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers	Kartell	1623
O-rings	Seal Science Inc.
Oscilloscope	Tektronix	TDS 1002
Reference electrode	Max Planck Institute of Biophysics
Function generator	Max Planck Institute of Biophysics
Tubings	SAINT-GOBAIN Performance Plastics	AAC00006
Sensor chip	Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box	Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier	Keithley	427
Manual cog	Vygon GmbH	876
USB analog-to-digital converter	National Instruments	6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356
Acrylamide/Bis-acrylamide	Sigma Aldrich	A3574
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Ethanol absolut	VWR AnalaR NORMAPUR	603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract	Avanti Polar Lipids, Inc.	100600	for LacY reconstitution
n-Decane	Sigma Aldrich	D901
Octadecanethiol	Sigma Aldrich	O1858
Octadecylamine	Sigma Aldrich	74750
Potassium chloride	Merck	1049360500
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791
Tetramethylethylenediamine	BIO RAD	1610801
α-Lactose monohydrate	Sigma Aldrich	L8783