Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

Resumen

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Resumen

Se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento rápido y barato para identificar reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína, un gen asociado con la enfermedad de Parkinson. Células 293T se transfectaron de forma transitoria con plásmidos de una biblioteca de expresión ORF dispuestos, junto con plásmidos informadores de luciferasa, en un formato de microplaca de un gen-por-así. Actividad de la luciferasa de la luciérnaga se ensaya después de 48 horas para determinar los efectos de cada gen de la biblioteca después de la transcripción alfa-sinucleína, normalizada para la expresión de una construcción de control interno (un promotor de hCMV dirigir la luciferasa de Renilla). Este protocolo se ve facilitada por un robot de sobremesa encerrado en una cabina de bioseguridad, que realiza la manipulación de líquidos aséptica en formato de 96 pocillos. Nuestro protocolo de transfección automatizado es fácilmente adaptable a la producción de alto rendimiento biblioteca lentiviral u otros protocolos de cribado funcionales que requieren triples-transfecciones de un gran número de plásmidos de la biblioteca únicos en conjugadoFuncione con un conjunto común de plásmidos auxiliares. También presentamos una alternativa económica y validado para comercialmente disponibles reactivos de luciferasa duales, que emplea el PTC124, EDTA, y pirofosfato para suprimir la actividad luciferasa de luciérnaga antes de la medición de la luciferasa de Renilla. El uso de estos métodos, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 68 reguladores de la alfa-sinucleína. Este protocolo es fácilmente modificables para atacar otros genes de interés.

Introducción

La capacidad de identificar elementos reguladores genéticos clave y los factores que actúan sobre ellas es fundamental para la exploración de numerosos procesos biológicos. Sin embargo, los factores que regulan la expresión de genes en los tipos de células raras, como la identificación de poblaciones neuronales específicas, puede ser un reto. Aquí, se presenta un protocolo para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína (SNCA), un gen asociado con la enfermedad de Parkinson y expresado en las neuronas dopaminérgicas en la substantianigra pars compacta de la región del cerebro medio. Esto lo logramos mediante una pantalla reportero de alto rendimiento, doble luciferase, in vitro para deconstruir la expresión de alfa-sinucleína en las células 293T. El promotor de alfa-sinucleína se clona primero en un plásmido que contiene el gen reportero de luciferasa de luciérnaga. Un plásmido comercialmente disponible que contiene la luciferasa de Renilla bajo el control de un promotor constitutivamente activo sirve como un control interno. Thesconstrucciones e reportero se transfectan conjuntamente en células 293T en microplacas con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de tal manera que cada pocillo se transfectaron con un único plásmido de la biblioteca. Después de 48 horas, la actividad de la luciferasa para cada reportero se mide de forma secuencial utilizando un ensayo de doble resplandor. La expresión relativa de alfa-sinucleína en respuesta a cada gen biblioteca se deduce por la relación de luciérnaga: la actividad de luciferasa de Renilla en cada pocillo (F: relación R) después de la normalización a base de placa.

Este protocolo proporciona la capacidad de detectar un gran número de genes (~ 2,500 por semana) por su capacidad para transactivar un gen reportero usando mano de obra mínima (1-2 personas) y un costo mínimo (unos 3 dólares el costo de reactivos por ensayo de microplacas). Reguladores de la transcripción de los genes neuronales (por ejemplo, alfa-sinucleína), que son difíciles de estudiar en neuronas cultivadas refractarios a la manipulación genética, se pueden comparar lado a lado en este ensayo funcional directa. Incluimos en nuestroprotocolo de un método detallado para la clonación y el crecimiento de plásmidos que contienen el promotor de alfa-sinucleína, ya que encontramos que los plásmidos que contienen esta región son inestables cuando se cultivan con procedimientos convencionales (véase la discusión). También incluimos una alternativa económica a los reactivos disponibles en el mercado dual de luciferasa para ensayos de alto rendimiento. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros elementos reguladores de interés, o a cualquier proceso que requiere de alto rendimiento transfecciones transitorias.

Protocolo

Para una visión general experimental, ver Figura 1.

1. Preparar reportero plásmidos que contienen la alfa-sinucleína Promotor

Los elementos reguladores del gen de la alfa-sinucleína (Figura 2) abarcan aproximadamente 10 kb, desde el upstream NACP (A no componente beta amiloide) secuencia de repetición del dinucleótido ^1,2 través intrón 2 ^3. Incluimos una parte de esta región en nuestro reportero construir. Encontramos que los plásmidos que contienen el intrón 2 se requieren procedimientos especiales para el crecimiento, que se detallan a continuación. Los plásmidos de luciferasa, pGL4.10 y pGL4.75 (Figura 3), están disponibles comercialmente de Promega y se pueden propagar a través de protocolos de biología molecular convencionales.

1. Amplificar los 2 componentes de el promotor de alfa-sinucleína en las PCR separadas utilizando la receta en la Tabla 1 y los cebadores de la Tabla 2.
2. Verify productos de PCR en un gel de agarosa y se limpia utilizando el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen), eluyendo en 50 l de TE (Tris-EDTA). Almacenar el fragmento de 0,9 kb eluido a -20 ° C para su uso futuro.
3. Digerir todo el volumen del fragmento de PCR de 3,4 kb, así como 5 g de pGL4.10, con SacI y XhoI. Tratar el vector con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Roche) y gel de purificar utilizando el kit de PureLink Gel Extracción rápida (Invitrogen).
4. Se liga el fragmento y el vector utilizando ADN ligasa T4 (NEB). Limpiar la reacción completada usando el kit de PCR PureLink Micro (Invitrogen), eluyendo en 10 l de tampón TE.
5. Transformar 2 l de la limpiado, reacción de ligación en 20 l de células competentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) y electroporar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agitar en un 30 ° C incubadora a 225 rpm durante 90 min. Spread 2 volúmenes en placas de LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante 2 días.
6. Con un palillo, seleccione 4-6 pequeñas colonias de inoculación en 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultivar estas culturas miniprep en un 30 ° C coctelera O / N.
7. Se purifica ADN plasmídico a partir de 1,5 ml de cada cultivo Miniprep utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido Miniprep (Invitrogen).
8. Digerir las minipreparaciones con BamHI y a electroforesis en un gel de agarosa. El clon correcto debería producir fragmentos de 2,8 kb y 4,9 kb.
9. Restreak la cultura Miniprep restante del clon correcto en un LB (caldo de Luria) placa fresca y crecer a 30 ° C durante 2 días.
10. Seleccionar una pequeña colonia e inocular un cultivo iniciador 1,5 ml de TB. Agite O / N a 30 ° C. No deje que el cultivo iniciador crecer hasta la saturación.
11. Diluir todo el cultivo iniciador en 150 ml de TB precalentada y agitar a 30 º C durante 2 días. Antes de proceder al paso siguiente, utilizar 1,5 ml de este cultivo para una miniprep y la digestión adicional para confirmar que el clon no mutar durante replicati en.
12. Se purifica ADN de plásmido a partir del cultivo restante utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido maxiprep (Invitrogen). Los rendimientos esperados de este plásmido intermediario son de 50-150 mg por 150 ml de la cultura.
13. Descongelar el fragmento de 0,9 kb congelada en el paso 1.2. Repita los pasos 1.3 a 1.12 para clonar el fragmento de 0,9 kb en el plásmido intermedio, digiriendo lugar con KpnI y SacI. Ligar, transformar, seleccionar y crecer durante Maxipreps que el anterior. La digestión con BamHI debe producir fragmentos de 5,8 kb y 2,8 kb. Este es el plásmido que se utilizará para la pantalla.

2. Preparar las células 293T, el reportero plásmidos y ADN Library for Screening

Células 293T se sembraron primero en placas de 96 pocillos y se transfectaron el día siguiente. Reportero plásmidos y ADN de biblioteca se diluyen en placas de 96 pocillos. Se obtuvieron placas de ADN biblioteca transfección de grado a partir del ADN del núcleo en el Hospital General de Massachusetts (obtener = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Este protocolo transfecta una placa única biblioteca en 2 placas idénticas de células 293T (Figura 1), por lo tanto, 2 placas de células deben ser sembradas para cada placa de la biblioteca que se proyectarán.

Nota: Se cultivan las células en medio sin rojo fenol o antibióticos, ya que éstos interfieren con los ensayos de luciferasa y aumentan la toxicidad durante la transfección, respectivamente.

1. Para cada placa de la biblioteca de ser controlados, volver a suspender las células 293T tratadas con tripsina a una concentración de 1,5 x 10 ⁵ células / ml en DMEM que contenía 14% de FBS. Vierta la mezcla en un recipiente estéril (Axygen).
2. Coloque el depósito, 2 de fondo claro-, placas de 96 pocillos (Corning), y una caja de puntas de pipeta filtro (Agilent) en la cubierta del robot. Dispensar 100 l de células en cada pocillo de ambas placas, para una densidad de 1,5 x 10 ⁴ células por pocillo.
3. Centrifugar las placas de las células a 50 xg durante 2 min, con bajas velocidades de rampa para garantizar la igualdaddensidad celular a lo largo de cada pocillo. Incubar a 37 ° C y 10% de CO ₂ O / N.
4. Diluir la luciérnaga y Renilla reportero plásmidos a 5 ng / l en medio libre de suero. Combinar las diluciones en una proporción de 05:03 de luciérnaga a plásmido de Renilla (en volumen) en un tubo cónico de 15 ml.
5. Pipet los plásmidos combinados en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, dosificar 17 l por placa de biblioteca, además de 2-10 l exceso, en cada pocillo.
6. Obtener las placas de la biblioteca de ADN transfección grado que el anterior y diluir a 13,3 ng / l de agua libre de endotoxinas. El volumen mínimo por pozo debe ser de 28 l.

3. Lleve a cabo transfecciones

En el día 2 de la pantalla, reportero plásmidos y ADN de biblioteca se transfectaron en células 293T.

1. Para cada placa de biblioteca, mezclar 107,5 l de RT Optifect (Invitrogen) con 4,3 ml de medio libre de suero (1:40 dilución) en un tubo de poliestireno. Incubar durante 5 min a TA, y elN prescindir de 44 l (por placa biblioteca) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, de fondo en V de poliestireno (Greiner).
2. Coloque el plato de diluida Optifect, reportero plásmidos (Paso 2.5), los ADN de la biblioteca (Paso 2.6), y una caja de puntas de pipeta en la cubierta del robot.
3. Aspirar 17 l de reportero plásmidos, 43 l de diluirse Optifect, y 26 l de ADN de la biblioteca, la inserción de un espacio de aire 5 l entre cada aspiración. El ADN de la biblioteca debe ser aspirado pasado para evitar la contaminación cruzada. Vierta el contenido de las puntas en una nueva placa de poliestireno V de fondo, mezclar, tapar y dejar de lado por 20 minutos para permitir que los complejos de lípido / ADN para formar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, reemplace las puntas de pipeta y placa de biblioteca, y repetir.
4. Destape la placa de mezcla Optifect / ADN y lo coloca en la cubierta del robot con 2 placas de células 293T. El uso de una sola caja de puntas de pipeta, aspire 80 l de la Optifect: mezcla de ADN y lentamente dispensar 40 l en cada placa de células. Si transfecting múltiples placas de biblioteca, repita para todos Optifect: placas de ADN. Cubra las células.
5. Centrifugar las placas de células a 1200 xg durante 30 min. Cubrir y volver a la incubadora.
6. Se incuban las células durante 4-6 horas. Durante esta incubación, preparar medio fresco mediante la mezcla de 12 ml de DMEM que contiene 10% de FBS y 10 mg / ml de ciprofloxacina (CellGro) para cada placa de biblioteca transfectadas. Verter medio fresco en un depósito estéril.
7. Coloque 2 cajas de puntas de robots, una sola placa de las células, el depósito que contiene medio fresco, y un depósito de residuos en la cubierta del robot. Aspirar 100 l de medio de las células y dispensar en el depósito de residuos parcialmente lleno con etanol al 70%. Utilizando puntas frescas, aspirado de 100 l de medio fresco y se dispensa lentamente sobre las células. Repita el procedimiento para todas las placas de células.
8. Placas Volver a la incubadora durante 48 horas.

4. Realizar Dual-Luciferase ensayos

El día 4 de la pantalla, lase llevan a cabo ensayos de luciferasa de luciérnaga y Renilla.

Nota: El ensayo de doble luciferasa requiere la adición secuencial de 2 tampones de ensayo, 3X tampón de ensayo de luciérnaga y de Renilla 3X tampón de ensayo, como se describe en la Tabla 3 de la luciérnaga y de Renilla luciferasas no se secretan, por lo tanto las células deben ser lisadas antes de medir la actividad luciferasa. . Tampón de ensayo Firefly lisa células y proporciona sustrato para la luciferasa de luciérnaga; tampón de ensayo Renilla apaga la señal de luciérnaga y proporciona sustrato para la luciferasa de Renilla.

1. Para cada placa de biblioteca, preparar 8 ml de 3X tampón de ensayo de luciérnaga a partir de soluciones madre como se describe en la Tabla 3, y dispensar 82 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V.
2. Para cada placa de biblioteca, también preparar 12 ml de tampón de ensayo 3X de Renilla y dispensar 122 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Ponga a un lado tanto elluciérnagas y Renilla tampones de ensayo.
3. Coloque una caja de puntas de pipeta, un depósito de residuos, y 2 placas de células (transfectadas del mismo plato biblioteca) en la cubierta del robot.
4. Aspirar 60 l de los medios de comunicación de cada placa y desechar en el depósito de residuos parcialmente lleno de etanol al 70%. Las placas de cubierta y reservar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas.
5. Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de 3X tampón luciérnaga ensayo, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot.
6. Aspirar 40 l de tampón 3X luciérnaga ensayo y la agregan a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a las nuevas puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Colocar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la lisis. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, cambie las cajas de puntas y placas de las células, y repetir.
7. Luminiscencia Record de cada pocillo de cada placa de células en un luminómetro, grabar durante 1 segundo por pocillo. Placas Volver al robotcubierta.
8. Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de tampón de ensayo 3X Renilla, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot.
9. Aspirar 60 l de tampón de ensayo 3X Renilla, y agregarlo a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a una nueva caja de puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas de las células.
10. Luminiscencia Registro de todas las placas en un luminómetro, registrando cada pocillo durante 1 segundo el anterior. Deseche las placas.

5. Análisis de Datos

1. Calcular la luciérnaga: relación Renilla luminiscencia ("F: relación R") para cada bien dividiendo los condes de la señal de la luciérnaga por los condes de señal de Renilla.
2. Calcular el valor de inducción dividiendo la relación F: R de cada pocillo por el promedio de F: relación R de la placa, excluido el de mayor y más bajo 25% de los pozos.
3. La media de los valores de inducción a través de repeticionespara una placa de biblioteca única transfectadas. Los genes que inducen o reprimen la alfa-sinucleína más de tres pliegues son considerados "hits" en esta pantalla y están sujetas a una mayor validación y pantallas secundarias.

Resultados

Luciferase valores típicos, F: R ratios y valores de inducción para un único medio de placas se muestran en la Figura 4 Nota del éxito en el pozo H2, un inductor de 32 veces.. Los genes que causan una toxicidad excesiva (por ejemplo, así E3), o los pozos que fueron mal transfectadas, producirán valores bajos para ambos luciérnaga y luciferasa Renilla, pero un valor medio de inducción. Los genes que causan la inducción no específica de la actividad de la luciferasa, tal vez a trav?...

Discusión

Alfa-sinucleína se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) como un componente de los cuerpos de Lewy ^4, inclusiones intracelulares considerados patognomónicos de la enfermedad. Numerosos estudios de asociación del genoma han relacionado polimorfismos de nucleótido único en la alfa-sinucleína con un mayor riesgo para los esporádicos PD ^5,6,7. Aunque menos común que la enfermedad de Parkinson esporádica, PD familiar puede estar también causada por mutaciones en alfa-sinucleína

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003