Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Resumen

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Resumen

Muchos patógenos bacterianos intracelulares utilizar protozoos de agua dulce como un reservorio natural para la proliferación en el medio ambiente. Legionella pneumophila, el agente causante de la neumonía del legionario, gana una ventaja sobre patógena en bacterias cultivadas in vitro cuando primero cosechadas a partir de células de protozoos antes de la infección de los macrófagos de mamífero. Esto sugiere que los factores de virulencia importantes que no pueden ser adecuadamente expresada in vitro. Hemos desarrollado un sistema manejable para el cebado L. pneumophila a través de su huésped natural, protozoo Acanthamoeba castellanii antes de la infección de células de mamíferos. La contribución de cualquier factor de virulencia puede examinarse comparando el crecimiento intracelular de una cepa mutante de bacterias de tipo salvaje después de la imprimación protozoo. Que expresa GFP de tipo salvaje y mutante de L. cepas pneumophila se utilizan para infectar monocapas de protozoarios en una etapa de cebado y se dejó alcanzar las últimas etapas de crecimiento intracelular. Bacterias fluorescentes Después se recogen a partir de estas células infectadas y normalizado por espectrofotometría para generar números comparables de las bacterias para una posterior infección en macrófagos de mamífero. Para la cuantificación, bacterias vivas son monitoreados después de la infección mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, y por chapado colonia. Esta técnica pone de relieve y se basa en la contribución de la expresión génica de la célula huésped dependiente imitando el medio ambiente que se encuentra en una ruta de adquisición natural. Este enfoque puede ser modificado para adaptarse a cualquier bacteria que utiliza un huésped intermediario como un medio para obtener una ventaja patógena.

Introducción

Numerosos patógenos bacterianos han adaptado estrategias generalizadas para explotar células huésped para la supervivencia y replicación en un compartimiento intracelular. En muchos casos, los mecanismos patogénicos son similares entre protozoos y metazoos células. Sin embargo, estos dos microambientes son muy diferentes y pueden resultar en la expresión diferencial de los factores de virulencia ^1-4. La enfermedad del legionario bacteria Legionella pneumophila doquier se asocian con ambientes de agua dulce en todo el mundo ^5. Es importante destacar que, L. pneumophila cultivada en células de protozoos antes de la infección de los monocitos humanos obtener una ventaja patógena, lo que sugiere que los perfiles de expresión génica global de la bacteria sale de una célula de protozoo son diferentes que la de la vitro en cultivo organismo ^6-8. En la naturaleza, las amebas de agua dulce proporcionan nutrientes ricos confines de la rápida amplificación de una bacteria invasora. Adquisición humano de L. pneumophila es más a menudo atribuida a la inhalación de gotitas de agua contaminadas que contienen la bacteria. Es probable que estas gotitas puerto protozoarios asociados a las células bacterias; donde las células de protozoos son más resistentes a las prácticas convencionales de tratamiento de agua ^9,10. La infección de macrófagos alveolares pulmonares procede de una manera casi idéntica a la del ciclo de vida intracelular de la bacteria en las células huésped de protozoos ^11-13.

Con el fin de sobrevivir y replicarse en células eucariotas, L. pneumophila utiliza un tipo especializado sistema de secreción IVb denominado Dot / Icm llegar a casi el 300 'ejecutor' proteínas en el citosol de la célula huésped ^14-16. Estas proteínas efectoras colectivamente funcionar para subvertir procesos celulares con el fin de generar un compartimiento de replicación permisiva para la bacteria ^17,18. Las deleciones en cualquiera de los 26 genes que constituyen el resultado transportador Dot / Icm en cepas defectuosas para mult intracelulariplication ^19-23. Históricamente, la deleción de genes individuales que codifican efectoras rara vez resultó en cepas atenuadas para el crecimiento intracelular. Este fenómeno se ha atribuido a varias hipótesis, incluida la función redundante y paralogous copias de efectores.

Algunos factores de virulencia se expresan únicamente en el contexto de la célula huésped asociada a crecimiento intracelular ^24. Hemos racionalizado que si un efector particular, se expresa sólo en el contexto de la infección por protozoos, entonces la contribución del efector no podía ser comparada con una cepa de tipo salvaje cuando ambos se cultivaron in vitro. L. pneumophila transiciones desde un replicativa a una fase de transmisión a medida que entra en la fase estacionaria de cultivo de ^25. El fenotipo de conmutación de fase representa el agotamiento de los nutrientes encontrados durante el crecimiento intracelular y se ejemplifica a través del conjunto de los flagelos para la movilidad ^26. Debido a que L. pneumophila es más invasive y virulenta cuando se cosecha a partir de células de protozoos, hemos tratado de desarrollar un ensayo que más fielmente representa el estado patógeno de la bacteria cuando se encontró con los macrófagos de acogida.

Para este fin, hemos desarrollado un ensayo protozoo cebado versátil que puede adaptarse a cualquier huésped adecuado tanto para las infecciones de la primera etapa (cebado de células) y segundo (célula diana). El proceso de infección es tratable mediante el uso de bacterias que expresan establemente la proteína verde fluorescente (GFP). El modelo de la infección por el protozoo Acanthamoeba castellanii sigue una metodología ampliamente utilizado en el campo ^27. Para la etapa de cebado, L. pneumophila cepas se cultivan in vitro hasta la fase estacionaria en medio líquido para producir la etiqueta 'transmisivo "bacterias (Figura 1A). Las bacterias se vuelva a utilizar para infectar monocapas de A. castellanii durante 18 horas para lograr una etapa tardía del ciclo de vida intracelular. Contienen grandes vacuolasbacterias ING puede ser visualizado en este punto de tiempo usando microscopía de fluorescencia (Figura 1A). Las células se lisan por protozoos y bacterias recuperadas a partir del lisado se miden para emisión a 512 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia. La fluorescencia se correlaciona con la densidad óptica para calcular multiplicidad de infección (MOI) en la infección de células diana (Figura 1, Curva * Correlación). Después de la invasión h (T ₀₎ y 18 post-invasión (T _18), las células diana se cuantifican por fluorescencia, en representación de las bacterias intracelulares. La fluorescencia puede ser monitoreada por microscopía y citometría de flujo, y el recuento de viables se puede medir a través de placas de colonias. El ensayo de cebado siempre se acompaña de infecciones por L. de tipo salvaje pneumophila y una cepa defectuosa en el sistema Dot / Icm de secreción de tipo IV (Δ dotA) (Figura 1A). Este importante proporciona controles internos para las comparaciones directas entre los de tipo salvaje unnd cualquier cepas isogénicas mutantes utilizados en el proceso de infección. La inclusión de la cepa no virulenta Δ dotA durante la fase de cebado establece un umbral para la observación de fenotipos de crecimiento atenuadas asociados con cepas mutantes isogénicas que se cultivan in vitro.

Protocolo

1. Preparación de Legionella pneumophila Culturas de Infecciones fase de cebado

1. Transformar todo L. pneumophila cepas usadas en el ensayo con los plásmidos pAM239, que codifica una isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) inducible proteína verde fluorescente (GFP) ^28. Inocular las cepas bacterianas en hierro y cisteína suplementado N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES) tamponada con carbón vegetal agar de extracto de levadura (CYEA) que contiene 6,25 mg / ml de cloranfenicol (CM) (para el mantenimiento del plásmido) y se incuba durante 72 hr a 37 ° C.
2. Transferir un inóculo de la cepa bacteriana en ACES suplementadas tamponada caldo de extracto de levadura (AYE) con 6,25 g / ml CM y 1 mM de IPTG y cultivar a la fase estacionaria (O / N) en un agitador orbital a 37 ° C.
3. Confirmar la expresión de GFP en los cultivos in vitro utilizando microscopía de fluorescencia. Transferir 10 l de cultivo en un portaobjetos de vidrio bajo una cubiertadeslizamiento y la imagen usando un objetivo de 60X con excitación GFP / cubo de emisión (AMG EVOS fl).
4. Diluir una alícuota de 100 l de cada cultivo in vitro a 1:10 con H2O _estéril El blanco con 100 l AYE medios de comunicación con IPTG 1 mM y 6,25 g / cm ml y agua. Tome OD600 mediciones de las diluciones utilizando un espectrofotómetro (Bio-Rad inteligente Spec Plus). Calcular el volumen necesario para infectar un pozo a una MOI = 20 para cada cultivo in vitro: V = [(ameba cabeza de serie) x MOI] / [OD ₆₀₀ x (factor de dilución) x (constante)] = [(1 X 10 ⁶ ) x (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. La concentración de bacterias se determinó como OD ₆₀₀ = 1,0 = 1 x 10 ⁹ UFC / ml.

2. Cebado de la infección por Acanthamoeba escenario mediante castellanii

1. Mantener y cultivar las amebas en medio ATCC 712 PYG en 175 cm ² frascos a temperatura ambiente.
2. Vuelva a colocar los medios de comunicación en la cultura amebasras 24 h antes de iniciar los cultivos líquidos bacterianos. En el mismo día líquidos cultivos bacterianos se han iniciado, recoger y contar las células en un microscopio de luz usando un hemocitómetro.
3. Diluir las amebas con medio fresco a una concentración final de 1 x 10 ⁶ células / ml. Semilla 12-y placas de cultivo de células con 1 ml de alícuotas de las amebas utilizando una pipeta de repetición y se incuba a RT O / N.
4. Después de la incubación, se lavan los pocillos de las placas de cultivo de 12-pocillos de células 3 veces con 1 ml de PBS estéril usando una pipeta serológica de 10 ml y una ayuda de pipeta manual.
5. Después de la aspiración de PBS, añadir 1 ml de la infección por los medios de comunicación (ATCC 712 medios de comunicación PYG menos glucosa, peptona, y extracto de levadura) con IPTG 1 mM y 6,25 g / ml cm a cada pocillo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 1 hr.
6. Infect pocillos a una MOI = 20. Centrifugar la placa a 400 xg durante 5 min (Eppendorf 5810R) y flotar en un baño a 37 ° C durante 5 min. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 18 hr.
7. Confirme las infecciones utilizando imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de la sede de la lisis celular y la cosecha de las bacterias.

3. Siembra de células THP-1 para la infección de las células diana Stage

1. (Comience este proceso de 24 horas antes de la creación de cultivos bacterianos líquidos). Cultivar células THP-1 en un 75 matraces de cultivo de ² cm a alrededor de-confluencia en medio RPMI 1640 con inactivado por calor al 10% de suero fetal bovino (FBS).
2. Contar las células en suspensión utilizando un hemocitómetro, diluir las células THP-1 en medio RPMI 1640 con FBS al 10% y 100 ng / ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a una concentración de 1 x 10 ⁶ células / ml y la placa en alícuotas de 1 ml en placas de 12 pocillos de cultivo celular. Incubar las placas durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO _2.

4. Tratamiento para la infección de bacterias Etapa de células diana después de la infección fase de cebado

1. Aspirar el medio de las amebas cebada.
2. Lyse la unamoebae usando 500 l de hielo frío, estéril ultrafiltrada (UF) H ₂ O y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Piscina Los lisados ​​de acuerdo con la cepa de tipo E y tomar una medición de _{512 nm} para cada uno de los lisados ​​combinados utilizando un lector de placas de fluorescencia (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
4. Calcular un OD ₆₀₀ de medición para los lisados ​​agrupados: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - Fondo de lisado) + 0.0019. La fórmula se determinó previamente por gráfica una comparación directa de ambas la OD ₆₀₀ y el E _{512 nm} mediciones de diluciones de L. pneumophila tipo salvaje GFP expresión de la fase estacionaria del cultivo in vitro (Figura 1 *). Los lisados ​​de ameba no infectadas, sujetas a las mismas condiciones experimentales que la ameba infectada, se usa como blanco y proporcionó un valor de corrección (por ejemplo, lisado de fondo), que fue incorporado en la ecuación. El t volumen necesarioo infectar un pozo a una MOI = 20 se calcula para cada grupo de lisado: V = [(THP-1 sin semillas) x MOI] / [calcOD ₆₀₀ x (constante)] = [(1 X 10 ⁶⁾ x (20)] / [calcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = 20 / calcOD _600.
5. Lavar las células THP-1 3x con PBS y añadir 1 ml de medio fresco RPMI 1640 (10% de FBS) a cada pocillo. Incubar las células THP-1 durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2.
6. Infectar las células THP-1 en la cantidad, calculada usando los lisados ​​MOI agrupados. Permitir que un conjunto de pocillos para no infectarse, sirviendo como un control negativo para el análisis de citometría de flujo. Procesamiento de la fase de cebado debe ser completado en menos de 30 min. Los lisados ​​se mantienen en hielo para limitar los cambios en la expresión génica antes de la infección bacteriana.
7. Centrifugar la placa, flotar para elevar la temperatura, y se incuba como en la fase de cebado.
8. Una hora después de la infección, retire el soporte mediante aspiración y lavar los pocillos 3 veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares.
9. Añadir 1 ml freSH RPMI 1640 (10% de FBS) a los pocillos de la placa y volver a la incubadora. El tiempo inmediatamente después del reemplazo de los medios de comunicación sirve como tiempo cero (T _0). Se incuban las células THP-1 durante 14-16 horas a 37 ° C, 5% de CO _2.

5. Análisis Experimental

5,1 imágenes de células vivas

Imagen de los pozos infectados utilizando un microscopio de fluorescencia (AMG EVOS fl) a 10X o 20X de aumento (Figuras 1A-D). Las imágenes se pueden comparar de manera cualitativa o cuantitativamente para determinar los niveles de infección, tanto en la fase de cebado y las infecciones de células diana etapa.

5,2 de citometría de flujo

1. Los picos de emisión de diferentes infecciones pueden ser comparados por citometría de flujo (BD FACS Calibur). Tripsinizar las infectadas células THP-1 y suavemente de lavado de los pozos mediante la mezcla en PBS con una pipeta.
2. Piscina las células por tipo de cepa en tubos de 15 ml Falcon y el sedimento a 1.800 xg durante 2min en la centrífuga de mesa.
3. Suspender los gránulos en 1 ml de PBS y transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
4. Centrifugar la suspensión a 1.800 x g (Eppendorf 5424) y volver a suspender los gránulos en 1 ml de PBS. Si las suspensiones resultantes son muy turbia (OD ₆₀₀ ≥ 1,0) que debe ser diluido en PBS adicional (1:3) para prevenir la obstrucción de las líneas en el citómetro de flujo.
5. Use filtrada estéril PBS para el equilibrado del citómetro de flujo y para los pasos de lavado entre inyecciones de muestra. Trazar la dispersión frontal / lateral de las células diana infectadas antes de la inyección de muestras objetivo infección celular.
6. Recoge 20.000 eventos totales para cada condición de uso de 488 nm láser de excitación y el canal FL1.
7. Puerta de captura de post-poblaciones de células para excluir las células no infectadas y la intensidad de fluorescencia de trama en un histograma (FlowJo) (Figura 1E).

5,3 CFU plating

1. Examinar la eficacia of infección por chapado UFC de las células cosechadas por citometría de flujo. Preparar diluciones seriadas de las muestras en ultrafiltrada O H ₂ a 10 ^-1, 10 ^-2, y ^-3 10.
2. Placa de 20 l de cada dilución en el 1/3 de una placa de CYEA con 6,25 g / ml CM.
3. Incubar las placas a 37 ° C durante 72 hr.
4. Contar las colonias utilizando un palillo de dientes y contador de células.

Resultados

Un resultado típico para el proceso de infección completo se describe en la Figura 1. Vivo micrografías de fluorescencia de células que representan monocapas de A.castellanii infectadas con el tipo salvaje L. pneumophila durante la fase de cebado se muestra en la Figura 1A. Una medida de éxito de la etapa de cebado daría lugar a una población de aproximadamente 90% de las células huésped que contienen grandes vacuolas pobladas con bacterias GFP etiquetados en ...

Discusión

La expresión génica bacteriana está estrechamente controlada a través de una combinación de la progresión del ciclo de vida y la respuesta a las señales en el microambiente circundante. Patógenos vacuolar tales como L. pneumophila responder a una multitud de receptores de células derivadas de las señales cuando compartimentada en un fagosoma. Como resultado colectivo de agotamiento de nutrientes en la célula huésped, la bacteria compensa mediante la expresión de factores requeridos para la difusió...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes