Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Resumen

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Resumen

Cryo-tomografía electrónica (cryoET) permite la visualización 3D de las estructuras celulares con resolución molecular en un estado cercano al fisiológico ^1. Sin embargo, la visualización directa de los complejos virales individuales en su ambiente celular del huésped con cryoET ² es un reto, debido a la naturaleza poco frecuente y dinámica de la entrada viral, en particular en el caso de VIH-1. Mientras time-lapse de imágenes de células vivas ha dado una gran cantidad de información sobre muchos aspectos del ciclo de vida del VIH-1 ^3-7, la solución ofrecida por microscopia de células vivas es limitada (~ 200 nm). Nuestro trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un método de correlación que permite la visualización directa de los eventos tempranos de la infección por VIH-1 mediante la combinación de células vivas microscopía de luz fluorescente, la crio-microscopía fluorescente y cryoET. De esta manera, las señales de células en vivo y crio-fluorescente se pueden utilizar para guiar con precisión la toma de muestras en cryoET. Por otra parte, la información estructural obtenida de cryoET puede be complementado con los datos funcionales dinámicas adquirida a través de imágenes de células vivas de fluorescente diana marcada.

En este artículo de vídeo, ofrecemos métodos y protocolos detallados para la investigación estructural de VIH-1 y las interacciones de la célula huésped utilizando correlativa de imágenes de células vivas 3D de alta velocidad y alta resolución cryoET análisis estructural. Células HeLa infectadas con partículas de VIH-1 se caracterizan por primera vez por microscopía confocal de células vivas, y la región que contiene la misma partícula viral se analizaron a continuación por crio-tomografía de electrones para los detalles estructurales 3D. La correlación entre dos conjuntos de datos de imágenes, proyección de imagen óptica y electrónica de imágenes, se logró mediante una etapa microscopía óptica crio-fluorescencia de fabricación casera. El enfoque detallado aquí será de gran valor, no sólo para el estudio de las interacciones de células virus-huésped, sino también para aplicaciones más amplias en la biología celular, tales como señalización, tráfico de receptor de membrana celular, y muchos otros procesos celulares dinámicos. </ P>

Introducción

Cryo-tomografía de electrones (cryoET) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la visualización en tres dimensiones (3D) de las células y los tejidos y proporciona información detallada sobre la organización de los orgánulos nativas y estructuras celulares en resolución molecular en un primer estado fisiológico a ^1. Sin embargo, la inherentemente bajo contraste de muestra congelada sin teñir-hidratado, combinada con su sensibilidad a la radiación, hace que sea difícil la localización de áreas de interés dentro de una célula y, posteriormente, la realización de la serie de inclinación con éxito sin dañar el área de destino. Con el fin de superar estos problemas, un enfoque correlativo que combina microscopía de luz y de electrones es necesario. Características específicas de relieve por marcaje fluorescente se identifican y se encuentran por microscopía de luz de fluorescencia, y a continuación, sus coordenadas se transfieren al microscopio electrónico para la adquisición de los datos estructurales 3D de alta resolución. Este método correlativo ayuda a localizar el objetivo de unreas de interés que deben abordarse. Debido a la limitación sobre el espesor de la muestra con cryoEM (<300 nm), actualmente sólo las regiones periféricas de la célula son adecuados para el análisis estructural 3D por CryoET. Una mayor reducción del espesor de las muestras congeladas, hidratadas por vítreo seccionar ⁸ o crio-centrado del haz de iones (FIB) de molienda ⁹ ampliaría la capacidad de proyección de imagen correlativa.

Anteriormente, los métodos correlativos se utilizaron principalmente para facilitar la adquisición de datos cryoET para las grandes y estática estructuras ^10-13. En estos estudios, crio-etapas se han aplicado a aceptar rejillas cryoEM y cabe en cualquier un microscopio vertical o un microscopio invertido ^10,11,14. Aunque las redes de conmutación parece bastante sencillo en sus diseños, hay adicional transferencia de pasos implicados para la red EM, el aumento de la probabilidad de que la red puede ser deformada, dañada y contaminada. Recientemente hemos demostrado un avance técnico enmicroscopía correlativa que nos permite visualizar directamente los eventos dinámicos que son por naturaleza difíciles de capturar, como el VIH-1 y las interacciones de células huésped en las primeras etapas de la infección ^15. Esto lo logramos a través del diseño e implementación de una plataforma de muestra crio-microscopía de luz que se adapta un sistema de cartucho para minimizar el daño espécimen debido a la manipulación red, facilitando así la correlación. Nuestro diseño incluye un soporte del cartucho de muestra integrada, que permite tanto la crio-microscopía de luz y electrónica criogénica a realizar, de forma secuencial, en el mismo soporte de la muestra, sin transferencia de la muestra, lo que agiliza el proceso correlativo. Además, también implementado un procedimiento de correlación precisa y fiable el uso de perlas de látex fluorescentes como marcadores fiduciales.

Protocolo

1. Cultivo de células HeLa en carbono con recubrimiento de oro EM Buscador Grids

1. Descarga el resplandor del lado de carbono de un R2 de malla 200/2 Quantifoil oro EM buscador de la red de menos de 25 mA durante 25 s.
2. Cubra la rejilla EM con fibronectina, por flotar, carbono-hacia abajo, sobre una gota de 40 l 50 mg / ml solución de fibronectina, luego desinfectarla con luz UV durante 2 horas en una campana de cultivo de tejidos.
3. Células HeLa placa en la red a una densidad de 2 x 10 ⁴ células / ml (cultivo total de 2 ml) en una placa de cultivo con fondo de cristal y crecer las células a 37 ° C, con 5% de CO _2, en DMEM suplementado con 4,5 g / L de L-glutamina y glucosa, 10% inactivado por calor suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina, durante aproximadamente 18 horas. Las células HeLa se infectaron después del cultivo O / N.

2. La infección por VIH-1 y células vivas imágenes

1. Añadir un rastreador celular fluorescente (Red CMTPX, 1 l / 2 ml) a la cultura con fondo de cristalplato (de la etapa 1.3) y se incuba la placa a 37 ° C durante 10 min, para permitir la toma de hasta-el tinte fluorescente.
2. Se lavan las células con PBS y añadir 50 l de medio fresco precalentado.
3. Coloque el plato sobre la cámara en vivo de células, a 37 ° C, de un campo de escáner de microscopio confocal de barrido. Seleccionar varios campos (posiciones 10-15) que contienen 1 a 3 células / cuadrados, con las celdas entre dos fases de la mitosis, cuando son más dispersa y plano (véanse las figuras 2c y 2d), ya que requiere cryoEM regiones relativamente delgadas de la muestra. Guarde estas posiciones para obtener imágenes de futuro (paso 2.5).
4. Infectar las células con pseudo-mecanografiadas partículas VSV-G del VIH-1 que contienen GFP-VPR (utilizamos 40 l de una muestra que contiene 40 ng / ml de p24). Cuando la adición de las partículas de virus en la parte inferior del plato, tener cuidado de no perturbar la red EM, ya que las posiciones de formación de imágenes ya han sido seleccionados y almacenados.
5. Inmediatamente después de la adición de los viriones, recoger TIme-lapse de alta velocidad confocal de imágenes en 3D, en las posiciones previamente seleccionados (desde el paso 2.3) de 20-40 min.
6. Confocal imágenes fueron adquiridas mediante MetaMorph y analizados por el rastreo de partículas 3D automatizado para la dinámica de las partículas individuales utilizando el software Imaris (Ver Figura 1). Ya que estamos correlacionando el comportamiento dinámico de difracción limitada VIH-1 partículas con ultraestructura celular, time-lapse de imágenes de células vivas y rastreo de partículas 3D son fundamentales para los resultados. Sin embargo, para una estructura grande y estática, una imagen de fluorescencia sencillo (sin-vivo de células) sería suficiente para el análisis correlativo.

3. Frozen-hidratado EM Preparación de la muestra

Para reducir al mínimo el retardo de tiempo entre la recolección de la última imagen confocal y crio-fijación de la muestra, la FEI Vitrobot (u otro dispositivo de vitrificación) debe ser iniciado y preparado para la inmersión de congelación durante la colección de imágenes de células en vivo confocal de fluorescencia.

1. Encienda el dispositivo de vitrificación y fijar la temperatura del clima a 22 ° C, la humedad objetivo al 100%, el tiempo de transferencia de 7 segundos, y el tiempo de espera y tiempo de drenaje de 1 seg.
2. Coloque la caja de almacenamiento de red en el émbolo dewar y preparar etano líquido frío. Monte el dewar en el dispositivo de vitrificación.
3. Inmediatamente después de la formación de imágenes de células vivas confocal (sección 2), coloque la placa de cultivo en un bloque de cobre enfriada con hielo y la transferencia a la sala de preparación de muestras cryoEM. Coloque la rejilla EM en las pinzas especializadas y secar rápidamente lejos cualquier medio de comunicación en la red. El secante se realiza manualmente, con papel de filtro, después de lo cual 4 l de solución de 15 nm de bolas de oro se mezcla con 0,2 micras microesferas fluorescentes se coloca inmediatamente en la parrilla. Las perlas de oro se utilizan como marcadores de referencia para ayudar a la recogida de datos tomográfica y la alineación. Las microesferas fluorescentes se utilizan para ayudar a la correlación entre las imágenes fluorescentes y cryoEM (Véanse las Figuras 2c-2f).
4. Coloque las pinzas en el dispositivo de vitrificación y dar instrucciones al dispositivo de borrar y hundir congelación de etano líquido ^16. Los parámetros optimizados Blot para alcanzar el mejor resultado son: tiempo de transferencia, 7 seg; blot desplazamiento, 0; tiempo de drenaje, 1 seg; temperatura, 22 ° C, y humedad, 100%.
5. Transfiera la red frozen-hidratado a un titular cryoEM para imágenes cryoET inmediata, oa un almacenamiento de nitrógeno líquido dewar para su uso posterior.

4. Cryo-Microscopía de fluorescencia de luz

Se requiere un sistema, la cámara muestra la crio-fluorescencia de fabricación casera y la etapa (Figura 3) para llevar a cabo los pasos 04.01 a 04.10. Las especificaciones detalladas y descripción de la etapa se pueden encontrar en Junio ​​et al. ^15.

1. Llenar un nitrógeno líquido auto-presión Dewar con nitrógeno líquido por lo menos 2 horas antes de iniciar la crio-microscopía de luz de fluorescencia (véase la Figura 3a).
2. Montar una homebuilt crio-fetapa de la muestra luorescence ¹⁵ (Figura 3) en un microscopio de luz invertido de fluorescencia, tales como una Olympus IX 71.
3. Conectar la entrada de nitrógeno líquido de la etapa de crio-muestra para el dewar de auto-presión y colocar la salida de protección contra el desbordamiento de nitrógeno líquido en un recipiente apropiado. Conecte una línea de gas nitrógeno seco a una manga colocada sobre la lente del objetivo de mantener la lente cálido y libre de heladas.
4. Coloque una plataforma bloque de cobre (flecha negro en la Figura 3b) en la cámara de crio-etapa para la carga de la rejilla muestra congelada-hidratado. Enfriar y llenar la cámara de cobre de la crio-etapa con nitrógeno líquido a través de la línea de entrada de la auto-presión de llenado Dewar.
5. Cuando la etapa criogénica alcanza la temperatura del nitrógeno líquido (en aproximadamente 4-6 min), la transferencia de la caja de almacenamiento de red (desde el paso 3.5) a la etapa criogénica.
6. Coloque la rejilla muestra congelada hidratado en el cartucho muestra de EM en el bloque de cobre y el clip de la glibrado en su lugar con un anillo C (si se utiliza un cartucho microscopio Polara), o coloque un anillo de cobre pre-enfriado en la parte superior (negro punta de flecha en la Figura 3d), para mantener la red en el lugar y también para facilitar la recuperación de la red después de imágenes crio-fluorescencia (si por un crio-microscopio de electrones no Polara).
7. Coloque el cartucho (de la etapa 4.6) en la cámara interior de la crio-etapa (punta de flecha blanca en la Figura 3b).
8. Busca y encuentra las mismas partículas de virus de los datos de formación de imágenes de células vivas. Desde la rejilla EM tiene un índice, es fácil de localizar la misma partícula en la parrilla en las dos imágenes de células en vivo e imágenes de crio-florescencia.
9. Adquirir imágenes GFP crio-DIC y en las posiciones identificadas bajo la crio-estado utilizando un microscopio de luz con un tiempo de trabajo (2,7-4 mm) lente del objetivo. Durante la proyección de imagen de la crio-fluorescencia, revisar periódicamente el nivel de nitrógeno líquido en la etapa criogénica y volverlo a llenar, según sea necesario, para mantener el escenario de ejemplo siguiente -170° C.
10. Al término de las imágenes de crio-fluorescencia, reposar el cartucho de muestra para la plataforma bloque de cobre y guarde el cartucho en un termo de nitrógeno líquido para su análisis cryoET futuro con un sistema Polara. Si se utiliza un microscopio crioelectrónica no Polara, retire el anillo de cobre, recuperar la red muestra, colocarla en una caja de almacenamiento de red, y almacenar la muestra en un termo de nitrógeno líquido hasta que la muestra es examinada por cryoET.
11. Para el análisis de datos, se superponen los crio-DIC y GFP imágenes adquiridas (desde el paso 4.9, véase la figura 4b) y correlacionar las posiciones de las señales de GFP en la imagen Cryo-fluorescencia con los obtenidos en la serie de imágenes de células vivas.

5. Cryo-tomografía electrónica

1. Cargar el cartucho de la muestra en la estación de crio-transferencia de un microscopio electrónico equipado con un arma de emisión de campo, tales como Polara microscopio G2.
2. En el modo de baja dosis de investigación con una ampliación de 140X, identify y guardar las cuadrículas correspondientes (del paso 4,11) en un archivo de escenario.
3. En el modo de baja dosis de investigación con una ampliación de 3500 X, insertar un 100 micras apertura del objetivo, buscar y guardar todos los puestos se correlacionaron con señales de GFP en un segundo archivo de escenario.
4. En el modo de dosis baja exposición, encontrar un área en blanco para ajustar la intensidad del haz a una dosis de 1 o 2 e ^- / Å ² y refinar el eje de inclinación, utilizando la función y etapa, quemando el hielo en una región de carbono sin importancia con varias perlas de oro.
5. En el modo de baja dosis de enfoque, ajustar la distancia de enfoque a ~ 3 micras y ajustar el ángulo para alinear la dirección de enfoque a ser paralelo al eje de inclinación.
6. En el modo de baja dosis de investigación, hay que recordar posiciones guardadas (del paso 5.3), ajuste la altura eucéntrica muestra y compruebe el rango de inclinación de la zona de interés. Adquirir una imagen de proyección con una dosis de electrones muy baja (~ 1 e ^- / a ²⁾ a 8 a 10 micras desenfoque, en exposmodo de ure, para confirmar las partículas del virus correlacionados para la crio-tomografía electrónica.
7. Cambie al modo de baja dosis de enfoque. En el menú de funciones de auto TEM, preceder a la altura eucéntrica automatizado y se centran en las funciones del área de enfoque.
8. Establecer los parámetros para la adquisición de una serie de inclinación. En la figura 4, en el presente trabajo, los ángulos de inclinación que varía ± 70 °, por debajo y por encima de 45 °, a los 3 ° y 2 ° de inclinación incrementos, respectivamente, fueron utilizados, con 6 micras desenfoque y aproximadamente el 70 e ^- / Å ² dosis total.
9. Repita los pasos 5.7 y 5.8 para todas las posiciones guardadas. Software de tomografía por lotes puede ser utilizado para la recogida de datos automatizada en múltiples posiciones para aumentar el rendimiento.

6. Reconstrucción tridimensional utilizando IMOD ¹⁷

1. Inspeccione la serie inclinación prima para ajustar los valores mínimos y máximos de densidad y determinar si hay algún fin de ser excluido debido a la gran cambio de imagen.
2. Iniciar Etomo y el panel de configuración utilizando tomografía tipo de eje, tamaño de píxel, diámetro fiducial, etc. A continuación, crear scripts com.
3. Configurar la ventana principal de tal manera que varias etapas de la computación tomografía se pueden ajustar / siguieron simultáneamente. Modificar los parámetros necesarios y ejecutar los programas específicos que son requeridos por cada paso del proceso (Ver Etomo tutorial, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. En la etapa final, crear una pila alineada completa (con un error residual medio inferior a 0,6) y reconstruir tomografías utilizando un algoritmo de retroproyección ponderada en IMOD.
5. DeNoise áreas potenciales de interés mediante una difusión anisotrópica no lineal borde mejorar el programa 3D implementado en IMOD con los parámetros adecuados para mejorar el contraste y la claridad.

Resultados

Para caracterizar el comportamiento dinámico de las partículas de virus, las células HeLa infectadas con el VIH-1 se obtuvieron imágenes de alta velocidad por microscopía confocal de células en vivo y los movimientos de partículas se analizaron mediante el rastreo de partículas 3D automatizado (Figura 1). Para evitar que el lapso de tiempo de varios minutos que se pueden producir entre la recolección de la última imagen de células vivas confocal y sumergirse de congelación (que puede ser lo ...

Discusión

Hemos presentado un conjunto sencillo de protocolos para proporcionar un enfoque correlativo avanzada para analizar los procesos celulares dinámicos mediante time-lapse confocal de fluorescencia de células vivas seguido cryoET. Nuestro desarrollo metodológico para correlacionar imágenes de células vivas 3D con alta resolución cryoET es fundamental para investigar muchos problemas biológicos difíciles, tales como la visualización y partículas raras, dinámica (no estática, como se informó anteriormente) de di...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.