Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Resumen

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Resumen

Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.

Introducción

Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidrólisis de la celulosa a glucosa ^1,2, que proporciona un sustrato de carbono utilizable para la absorción y asimilación microbiana. La enzima fosfatasa libera grupos fosfatos inorgánicos solubles de organofosfatos, esencialmente mineralizantes fosfato y su puesta a disposición para su uso por la mayoría de los organismos ^3. Otras enzimas, tales como N-acetilglucosaminidasa (la NAGase), son IMPORTANTESt en la degradación de la quitina y puede hacer tanto el carbono y el nitrógeno disponible para la adquisición microbiana ^4.

Uno de los procedimientos para el ensayo de actividad de la enzima microbiana extracelular en ambientes naturales es el uso de p-nitrofenil artificial de sustratos enlazados (p NP), un enfoque que se desarrolló originalmente para detectar la actividad fosfatasa de suelo ^5. Este enfoque se basa en la detección de un producto final coloreado, p-nitrofenol, que se libera cuando el sustrato artificial es hidrolizado por la enzima apropiada. El p-nitrofenol puede posteriormente cuantificar colorimétricamente midiendo su absorbancia a alrededor de 400-410 nm. Este método ya se ha aplicado para detectar otras enzimas tales como la NAGase ^6, y se ha utilizado en varios estudios en busca de actividad de la enzima microbiana extracelular en los suelos y sedimentos ^7-9.

Un enfoque alternativo que era originally desarrollado para evaluar la actividad glucosidasa extracelular en ambientes acuáticos ^10,11 hace uso de (MUB) sustratos ligados 4 metilumbeliferona. El producto final liberado (4-metilumbeliferona) es altamente fluorescente y puede detectarse utilizando un fluorómetro con un ajuste de excitación / emisión de alrededor de 360/460 nm. Una variedad de sustratos artificiales MUB enlaces-están disponibles, permitiendo la medición fluorométrica de la actividad de al menos el mayor número de enzimas (por ejemplo, β-glucosidasa, celobiohidrolasa, Nagase, fosfatasa) como puede ensayarse usando el procedimiento colorimétrico-NP sustrato p. Otras enzimas extracelulares microbianos, tales como la aminopeptidasa de leucina en proteínas degradantes, se pueden ensayar fluorométricamente utilizando 7-amino-4-metil-cumarina (COU) sustratos enlazados. Tanto MUB-y sustratos COU vinculados se han utilizado para determinar la actividad de la enzima en varias muestras terrestres y acuáticos ^12,13.

Mientras que los estudios anteriores han described microplaca fluorométrico o colorimétrico se acerca para determinar la actividad enzimática extracelular ^14, hay una necesidad de una presentación clara de cómo llevar a cabo dichos ensayos. Aquí se demuestra los procedimientos para la realización de técnicas de alto rendimiento de la microplaca para el análisis de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos, utilizando el enfoque sustratos NP-linked p colorimétrico y en aguas naturales mediante la técnica fluorescente sustratos MUB enlazada. Nos centramos en la medición de las actividades de β-glucosidasa, la NAGase, y fosfatasa como estas enzimas pueden estar vinculados a carbono, de nitrógeno, de fósforo y el ciclismo, respectivamente. Sin embargo, los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar a la medición de otros enzimas extracelulares utilizando diferentes sustratos artificiales.

Protocolo

Análisis colorimétrica de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos

1. Preparación del substrato y Soluciones tampón para análisis colorimétricos de actividad enzimática

1. H Preparar 50 mM de tampón de acetato (pH 5.0-5.5) mediante la mezcla de 50 ml de 0.1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial en 500 ml de agua), 150 ml de acetato de sodio 0,1 M, y 200 ml de agua destilada ₂ O. Ajustar el pH a 5,0-5,5 con ácido acético 0,1 M si es necesario.
2. Preparar una solución de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) en _H2O destilada
3. Preparar soluciones de sustrato NP-linked p en 50 mM de tampón acetato. Para ensayo de fosfatasa preparar 5 mM p NP-fosfato en 50 mM de tampón acetato; para ensayar la β-glucosidasa preparar 5 mM p NP-β-glucopiranósido; para someter a ensayo la NAGase preparar 2 mM de PNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparar todas las soluciones de sustrato en estériles de 15 ml o 50 ml tubos de centrífuga. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas.

2. Determinación de un estándar para convertir Absorbancia Concentración de p NP

1. Preparar soluciones estándar de p-nitrofenol en 50 mM de tampón acetato. Las concentraciones deben variar desde 0,025 hasta 1 mM.
2. Transferencia tres repeticiones de 100 l de cada concentración a una clara microplaca de 96 pocillos. Añadir 10 l de NaOH 1 M y 190 l de _H2O destilada a cada pocillo.
3. Absorbancia Récord en 410 nm utilizando un lector de microplacas.
4. Concentraciones se multiplican en la curva estándar de 0,3 para obtener moles p NP por cada 300 l de volumen de reacción. Trazar una curva de absorbancia frente micromoles de p NP. La pendiente de la curva sirve como el factor de conversión (C) que se relacionan la absorbancia a micromoles de p NP en cada reacción de la enzima.

3. Realizar el ensayo enzimático

1. Para suelos, preparar una suspensión de cada muestra a ensayar en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril a una Concentrción de aproximadamente 1 g / ml ^-1 utilizando 50 mM de tampón acetato. Para los sedimentos, añadir tampón de acetato suficiente para hacer la pasta fácilmente pipettable. El volumen exacto de suspensión necesaria variará de acuerdo con el número de enzimas ensayadas, pero se recomienda un mínimo de 5 ml. Vortex cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o los sedimentos se han dispersado y anote el volumen final.
2. Re-vórtice cada suspensión y pipeta de inmediato 150 l en cada uno de los seis pozos en un bloque de 96 pocillos para pozos profundos (Figura 1). Es importante mezclar bien y con frecuencia con el fin de mantener a las partículas del suelo en suspensión. Deje por lo menos dos pozos por bloque vacías para servir como control de sustrato. Nota: el clip final de puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear como suelos fangosos tienden a obstruir las propinas. Preparar un bloque de 96 pocillos para cada enzima a ensayar.
3. Verter aproximadamente 5 ml de tampón de acetato en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la memoria intermedia a la LAST dos pozos de cada muestra (estos serán controles de tampón de muestra) y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1)
4. Vierta aproximadamente 10 ml de la solución apropiada NP-sustrato p en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la solución de sustrato a las primeras cuatro pocillos de cada muestra y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1). Tenga en cuenta el tiempo que la reacción se inicia tan pronto como se añade la solución de sustrato.
5. Incubar las placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tiempo de incubación exacta variará dependiendo del nivel de actividad en las muestras y la enzima a ensayar. Para la mayoría de los suelos y sedimentos, fosfatasa y β-glucosidasa requieren tiempos de incubación de 0,5 a 1,5 horas, mientras que la NAGase y otras enzimas requieren tiempos de incubación de> 2 h.
6. Mientras que los ensayos están incubando preparar clara microplacas de 96 pocillos a interpretar la extinción. Preparar una microplaca para cada bloque de pozos profundos (es decir, para cada direcciónnzyme ensayada). Pipetear 10 l 1 M NaOH y 190 l de agua destilada en cada pocillo de la microplaca. Nota: NaOH ralentiza la reacción enzimática y eleva el pH que mejora el color de la p NP liberado durante la reacción.
7. Después de la incubación, centrifugar los bloques de 96 pocillos a 2.000-5.000 g durante 5 min para sedimentar las partículas del suelo.
8. Use una pipeta multicanal a retirar 100 l de cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la pastilla, y la transferencia a las correspondientes bien en claro microplaca de 96 pocillos preparados.
9. Encienda el lector de microplacas y configurar el software necesario. Absorbancia Récord en los 410 nm. Si la absorbancia de un pozo en particular está por encima del límite de detección lineal de la lector de placas, diluir así que 1:01 con agua y volver a medir. Si la absorbancia es todavía demasiado alta, el ensayo debe repetirse con un tiempo de incubación más corto.

4. Determinación de la masa seca de las muestras

1. Pipetear 1 ml de cada sampl e mezcla en una cacerola de aluminio previamente pesado.
2. Secar en una estufa de secado 75 ° C durante 48 horas y pesar. Reste el peso de la cacerola de este valor para obtener la masa seca del suelo o sedimento en 1 ml de la suspensión. Multiplicar por un factor de 0,15 para determinar la masa seca de la muestra en los 150 l añadidos a cada pocillo en el ensayo enzimático.

5. Cálculo de la actividad enzimática por la masa seca del suelo o sedimento

1. Cálculo de absorbancia final de cada muestra sustrayendo la absorbancia de la muestra de control a partir de la absorbancia de la muestra de ensayo. Si los controles de sustrato tienen alta absorbencia (aproximadamente> 0.060) luego restar esos también.
2. Cálculo de la actividad enzimática en moles h ^-1 g de masa seca ^-1 partir de la ecuación:

La actividad enzimática = / (masa C x tiempo de incubación x muestra seca) absorbancia final

Análisis fluorescente de la enzima extracelular Actividad en Natural Aguas

tle "> 1. Preparación de sustrato, Standard y Soluciones tampón para análisis fluorométricos de actividad enzimática

1. Preparar 200 M soluciones de sustratos MUB enlaces-(por ejemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) disolviendo el sustrato apropiado en estéril (autoclave) destilada _H2O en 15 ml estériles o tubos de 50 ml de centrífuga. Envuelva los tubos de papel de aluminio para evitar la luz y almacenar en el refrigerador antes de su uso. Los sustratos deben ser estables durante al menos 1 semana si se almacena de esta manera.
2. Preparar un estándar MUB haciendo una solución madre de 100 mM 4-metilumbeliferona en agua destilada estéril ₂ O. Almacene refrigerado en ámbar o botella envueltas en papel aluminio. Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución 100 mM de stock de 1/10 en _H2O estéril para hacer una solución de trabajo de 10 m para los ensayos enzimáticos.
3. Preparar una solución madre de tampón de bicarbonato 100 mM disolviendo 8,4 g de NaHCO _{3 en 1 LH 2 O y autoclave. Diluir esta solución madre 1/20 en H2O estéril según sea necesario para hacer una solución de trabajo de 5 mM para los ensayos enzimáticos.}

2. La organización de muestras de agua en un 96 pocillos de microplacas Negro

1. Organizar una microplaca para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en la Figura 2. Tenga en cuenta que lo que permite la replicación adecuada, estándares, y los controles, este procedimiento puede ensayar la actividad de una única enzima para un máximo de nueve muestras de agua en uno de 96 pocillos de microplacas negro.
2. Verter aproximadamente 5 ml de la primera muestra en un depósito de pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a pipette200 l en todos los pocillos de la columna 1 de la microplaca (s). Deseche las puntas de pipeta usadas y repetir según sea necesario para cada muestra de agua para llenar las columnas 1-9.

3. Configuración de la Muestra, Standard, Quench, y controles de sustrato

1. Establecer controles para dar cuenta de las muestras, estándars, sustrato y enfriamiento en la misma microplaca negro como las muestras (Figura 2).
2. Controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad pero demostrarán la lectura de la consistencia a lo largo del curso del experimento. Los controles de enfriamiento consisten en agua de la muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia en la muestra de agua. Substrato y controles estándar se componen de tampón o bien-sustrato vinculado o la etiqueta fluorescente estándar, respectivamente, y bicarbonato.
3. Vierta aproximadamente 5 ml de 5 mM de tampón de bicarbonato en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l de tampón en los pocillos de la microplaca 1 a 9 en filas D y E para formar dos pocillos replicados de controles de la muestra por muestra. Puntas de pipeta Cambio luego se transfieren 200 l de tampón de bicarbonato para pozos de 10 a 12 en las filas A y H.
4. Reducir la iluminación ambiental por atenuar o apagar las lilos dere como el estándar fluorescente es sensible a la luz.
5. Verter aproximadamente 5 ml de 10 mM 4-metilumbeliferona en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l en los pocillos de la microplaca de 1 a 12 en la fila H, y en los pozos 1 al 9 en filas G y F para formar tres réplicas de los controles de enfriamiento por muestra y los controles generales estándar. O coloque la microplaca en la oscuridad o cubrir con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz de MUB.
6. Encienda el fluorómetro y puesta en marcha cualquier software necesario para estar listo para leer antes de añadir el sustrato. Nota: algunas bombillas fluorómetro pueden requerir un tiempo de calentamiento de 3 minutos o más.
7. Verter aproximadamente 5 ml de sustrato MUB vinculado-apropiado (por ejemplo 4-MUB-fosfato) en un depósito de pipeta limpia. Utilice una pipeta de 12 canales para pipetear 50 l en los pozos de la microplaca de 1 a 12 en la fila A, y en los pozos 1 a 9 en las líneas B y C para formar tres ensayos replicados de cada muestra y tres controles de sustrato. INMEDIATAMy vaya al paso 4.1, la fluorescencia de grabación.

4. Fluorescencia de grabación

1. Leer la fluorescencia inicial inmediatamente después de la adición de sustrato a la microplaca. Después de leer la fluorescencia, se incuba la microplaca a temperatura ambiente (22 ° C) o bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz MUB.
2. El tiempo de incubación requerido para medir la actividad máxima de la enzima potencial en una muestra de agua dependerá de la concentración de la enzima dentro de la muestra. Dado que este es desconocida antes de que se completó el ensayo, la microplaca se tendrá que leer en múltiples pasos de tiempo. Típicamente, la lectura a intervalos de 10-15 minutos en el transcurso de 1 h es aceptable para muchas enzimas, aunque las muestras con actividad muy alta para ciertas enzimas pueden alcanzar su punto máximo antes de 10 min.
3. Seguir leyendo la fluorescencia en microplacas a sus intervalos designados durante al menos 1 hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre la lecturas.

5. Cálculo de la actividad enzimática por volumen de agua

1. Para cada muestra en cada intervalo de tiempo de cálculo de las: fluorescencia media de la muestra inicial (pozos D y E), la fluorescencia de la muestra final media (pozos AC), la media de fluorescencia estándar (pozos H10-11), y la media apagan la fluorescencia de control (pozos FG).
2. Para cada intervalo de tiempo, calcular la actividad enzimática en nmoles hr ^{-1 ml-1} a partir de la ecuación:

La actividad enzimática = (media fluorescencia de la muestra - significará la fluorescencia de la muestra inicial) / ((media de fluorescencia / 0,5 mol) x estándar (media saciar la fluorescencia de control / media de fluorescencia) x estándar (0,2 ml) x (tiempo en horas))

3. Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo. Determinar la actividad potencial final a partir de la etapa de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad siguen aumentando entonces pueden ser necesarias medidas de tiempo posteriores, si los valores de actividad caen througHout el transcurso de la carrera, a continuación, ejecute de nuevo con pasos de tiempo más cortos. Actividad final es en nmoles de sustrato consumido hr ^-1 ml ^-1, pero se puede escalar hasta expresar como micromoles hr ^-1 L ^-1.

Resultados

Los suelos y sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de las comunidades microbianas adjuntos (biofilms) que crecen en la superficie de las partículas. Figura 3 muestra cómo esta actividad cambia en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un tercer corriente de orden en el norte de Mississippi, EE.UU.. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento ...

Discusión

La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica ^17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers