Técnicas de Procesamiento de ojos implantados con una prótesis de retina para el análisis histopatológico localizada

Resumen

Técnicas para la visualización de la retina citoarquitectura directamente adyacente a los electrodos individuales dentro de un estimulador de la retina.

Resumen

Con el reciente desarrollo de prótesis de retina, es importante desarrollar técnicas fiables para evaluar la seguridad de estos dispositivos en los estudios preclínicos. Sin embargo, la fijación estándar, la preparación, y procedimientos de histología automatizados no son ideales. Aquí se describen nuevos procedimientos para la evaluación de la salud de la retina directamente adyacente a un implante. Prótesis de retina incluyen matrices de electrodos en contacto con el tejido ocular. Los métodos anteriores no han sido capaces de localizar espacialmente el tejido ocular adyacente a los electrodos individuales dentro de la matriz. Además, el procesamiento histológico estándar a menudo resulta en desprendimiento artefactual bruto de las capas de la retina cuando la evaluación de los ojos implantados. En consecuencia, ha sido difícil evaluar daños localizados, si está presente, causada por la implantación y la estimulación de un conjunto de electrodos implantados. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para la identificación y la localización del tejido ocular adyacente a e implantadolectrodes utilizando un esquema de marcado tinte (código de color), y modificado una técnica de fijación de los ojos para minimizar el desprendimiento de retina artefactos. Este método también dictó la esclerótica translúcida, lo que permite la localización de los electrodos individuales y partes específicas de un implante. Por último, se utilizó un control emparejado para aumentar la potencia de las evaluaciones histopatológicas. En resumen, este método permite la discriminación fiable y eficaz y la evaluación de la citoarquitectura retina en un ojo implantado.

Introducción

Prótesis de retina puede convertirse pronto en intervenciones clínicas útiles para el tratamiento de varias formas de pérdida grave de la visión. Ciertas condiciones, tales como retinitis pigmentosa (RP), resultado de la degeneración generalizada de los fotorreceptores en el ojo, que son las células responsables de la transducción de la luz en señales nerviosas. Sin embargo, algunas células en otras capas de la retina se mantienen y son objetivos potenciales para la estimulación eléctrica con una prótesis retiniana ^1. Los primeros resultados de los ensayos clínicos en humanos han sido prometedores para las matrices de electrodos implantados en el epiretinal ^{2,3, 4,5} subretiniano y intraesclerales ⁶ lugares. Estos dispositivos están hechos de diferentes materiales con diferentes formas, pero todos ellos utilizan impulsos eléctricos para activar las neuronas viables restantes de la retina con el fin de crear percepciones visuales.

Nuestro grupo más amplio (Bionic Vision Australia) ha desarrollado un implante de retina que tiene progressed de un estudio clínico piloto con pacientes con RP 3 implantados con conjuntos de electrodos supracoroidea (Clinical Trial Número: NCT01603576). Figura 1A muestra este prototipo supracoroidea prótesis retinal.

La seguridad del paciente es de suma importancia en los estudios clínicos y por lo tanto, antes de comenzar los ensayos en humanos, se realizó extensas pruebas aguda y crónica en modelos preclínicos (Figura 1B). Evaluaciones histopatológicas fueron esenciales para refinar los procedimientos quirúrgicos, iterar a través de diseño de los electrodos, y en última instancia, establecer la seguridad del implante. Para mantener un flujo de trabajo eficiente encajaba con las prácticas de patología clínica estándar, se empleó una técnica de inclusión en parafina. También era deseable utilizar procedimientos de tinción comparables con las normas clínicas, tales como hematoxilina y eosina (H & E), que son interpretados fácilmente por los patólogos. También queríamos una técnica que podría ser adaptado para los análisis inmunohistoquímicos, ena fin de facilitar una evaluación adicional celular de los tejidos.

La biocompatibilidad de los materiales de implante, y la seguridad de la estimulación eléctrica crónica, es necesario evaluar con cuidado. Es importante ser capaz de examinar la histopatología del tejido ocular adyacente a los electrodos de estimulación individuales dentro de la matriz. Sin embargo, las matrices necesarias para ser eliminado antes de procesar las muestras de forma que pueden ser probados, y debido a que sus componentes metálicos no podían ser fácilmente seccionada. Por consiguiente, nuestra preparación del tejido establecida no permitió la localización y mapeo del tejido con respecto a los electrodos implantados ^7. Además de la falta de un método de localización de tejido, la fijación a base de formaldehído estándar y técnicas de procesamiento como resultado artefactos generalizadas y desprendimiento de la retina debido a la contracción diferencial de las diversas capas del ojo (Figura 2). Debido a la falta de homogeneidad de tque la retina, que era difícil hacer comparaciones válidas con tejido de control, en particular para mediciones cuantitativas. Estas limitaciones combinados complicadas evaluaciones precisas de los posibles daños causados ​​por nuestros arrays implantados.

Aquí presentamos nuevas técnicas para superar estas limitaciones. Hemos modificado las técnicas especializadas de fijación y procesamiento de los ojos ^8-10 para mantener la compatibilidad con la histología a base de parafina. Hemos modificado tinciones histológicas e inmunohistoquímicas estándar para dar resultados comparables, según los comentarios de los patólogos clínicos. Después de hacer que el tejido de la esclerótica translúcida, un código de color basadas en colorantes se emplean para marcar el tejido ocular adyacente a cada electrodo individual, antes de retirar el conjunto del espacio supracoroidea. Al marcar la matriz de electrodos y los sitios de los electrodos individuales, las muestras podrían ser recogidos con precisión a partir de las regiones adyacentes de electrodos. Muestras apareadas podían conseguirse en thojo de control electrónico con el fin de facilitar las comparaciones por pares.

Protocolo

1. Enucleación y posteriores a la fijación

Este protocolo asume que el sujeto ha sido implantado unilateralmente con una matriz de electrodos supracoroidal.

1. Preparar soluciones Postfix en vidrio Schott botellas.
   1. Solución fijadora de Davidson, 2x 100 ml
      • 2 ml de formol (formaldehído al 37%)
      • 10 ml de ácido acético glacial (99,7%)
      • 35 ml de etanol (98%)
      • 53 ml de agua destilada
   2. Etanol al 50%, 2x 100 ml
   3. Etanol al 70%, 2x 100 ml
2. Transcardially perfundir sujetos con agua caliente (37 ° C) solución salina heparinizada seguida por el frío (4 ° C) formalina tamponada neutra (10%).
3. Tie suturas en el limbo superior (o una ubicación que es remota desde la matriz supracoroidal) de ambos ojos - en línea con un músculo recto, para servir como un punto de referencia.
4. Ojos enuclear, el mantenimiento de los cables externos del ojo implantado.
5. Coloque each ojo en 100 ml de solución fijadora de Davidson y dejar de publicar-fix a temperatura ambiente.
6. Después de 18 - 36 horas en fijador de Davidson, traslado al 50% de etanol (temperatura ambiente) durante 6 - 8 horas, y finalmente a 70% de etanol (temperatura ambiente).
7. Refrigerar las muestras a 4 ° C y la tienda hasta la disección.

Globos oculares intactos y presurizada se han almacenado de esta manera durante hasta 3 meses sin afectar negativamente a la histología resultante.

2. Identificación y Mapeo de tejidos

El protocolo de fijación anterior (paso 1) ha hecho que la translúcida esclerótica y la matriz es ahora visible - incluyendo los sitios de los electrodos individuales (Figura 3).

1. Retire el mundo implantado a partir de etanol y recortar con cuidado el exceso de tejido, incluyendo la conjuntiva y la cápsula de Tenon. Recorte del nervio óptico a un 2 - 3 mm de longitud (Figura 3).
2. El uso de un colorante histológico markinesquema g, etiquete los electrodos con un código de color predefinido, teniendo cuidado de no ensuciar el medio de contraste.

• Elegimos una suite disponible en el mercado de tinte histológico especializado (véase el apéndice). Pequeñas cantidades del colorante se aplicaron cuidadosamente con un pincel fino de pintura punta (tamaño Roymac 00) para el tejido y se dejaron secar al aire durante un máximo de 5 min.
• Para nuestros propósitos, hemos elegido: verde para el electrodo activo (s) que fue (fueron) estimuló al máximo, a niveles suprathreshold, durante la duración del estudio, el rojo para otros electrodos activos, de color amarillo para los electrodos de retorno de mayor diámetro, y azul para guías adicionales y / o marcas de distancia anatómicas (Figuras 3B y 3C).
• Algunos de ensayo y error puede ser necesaria para encontrar un medio de contraste que es estable a lo largo de los pasos siguientes. Por ejemplo, en la Figura 4, se puede observar que el colorante verde era más resistente que el tinte rojo. La dilución del colorante en etanol al 70% ayuda a mejorar Penet lípidosración y recubrimiento de tejido.
• Es útil para esbozar o fotografiar el mundo teñido para referencia futura.

3. Volver a etanol al 70% para deshidratar el colorante.
4. Repita el paso 2.1 para el mundo de control no implantado.
5. Uso de las suturas de la etapa 1.3, alinee el ojo de control y el ojo implantado como un par duplicado.
6. Coloque una plantilla de silicona (con las mismas dimensiones que la matriz de electrodos) en la ubicación de espejo en el ojo de control como el implante se encuentra en el ojo implantado (NB la esclerótica translúcido y las marcas de tinte de paso 2.2 permitir la visualización fácil de la posición de matriz implantada ).
7. Realice los pasos 2,2 y 2,3 para el ojo de control, de manera que cada sitio electrodo implantado tiene un par de control en una localización anatómicamente comparables (es decir, espejo emparejado equivalente).

3. La disección y la incrustación

1. Retire la matriz de implante del ojo y retirar la parte frontal del ojo(Incluyendo la córnea, el iris y el cristalino). Quitar el humor vítreo del ojo taza restante (cámara posterior).
2. Diseccionar el ojo implantado en múltiples tiras representativas (~ 2 mm de espesor) conteniendo cada uno un subconjunto de las regiones marcadas de tinte (Figura 3D). Tenga en cuenta que la orientación de las tiras debería ser seleccionado para ayudar en la evaluación de varios aspectos de la respuesta del tejido al implante ^7.

Es útil, para futura referencia, para hacer un registro de qué regiones colorantes están presentes en cada banda y sus ubicaciones relativas (y colores).

3. Coloque la tira en su lado en una piscina de poca profundidad de agar licuado (4%, el 80 - 90 ° C) con el lado a cortar primera orientada hacia abajo (Figura 3E).
4. Una vez que el agar se ha fijado, corte alrededor de la muestra y colocar en un contenedor de tejido con el apoyo de piezas de espuma (Figura 3F).
5. Repita los pasos 3.1-3.3 para el ojo de control - taking cuidado para diseccionar espejos con ajuste tiras.
6. Procesar todos los cassettes de parafina mediante técnica de procesamiento estándar (automático durante la noche).
7. Insertar tejido procesado en parafina con el lado a cortar primera orientada hacia abajo.

4. Corte y tinción

1. Cortar los bloques de parafina en 5 secciones micras se refieren regularmente a las notas de los pasos 2 y 3.
2. Recoger las secciones de cada una de las regiones teñidas y montar en portaobjetos.

La región inmediatamente adyacente a cada mancha teñida de la esclerótica ahora se puede evaluar con la confianza de que era en la proximidad más cercana al electrodo correspondiente de la matriz (Figura 4).

3. Manchas o realizar inmunofluorescencia si lo deseas. Ejemplo manchas e inmunohistoquímica se muestra en la Figura 5 son: H & E, Luxol azul rápido (LFB); cresil violeta, azul tricrómico de Masson, ácido periódico de Schiff (PAS); Perls azul de Prusia staen; anti-glutamina sintetasa (GS); anti-proteína de neurofilamentos (NF), anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI).
4. Manchas estándar y especiales se llevaron a cabo como se detalla:
   1. Tinción H & E se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo proporcionado por Leica Multistainer baño de matriz ST5020 (Leica Biosystems).
   2. Violeta LFB y cresilo (modificado de ^11):
      1. Desparafinación en 3 cambios de xileno (3 x 2 min) y 2 cambios de etanol (100%, 100%) (2x 1 min) y enjuague en agua del grifo (45 seg).
      2. Secciones Hidratación a etanol al 95%.
      3. Colocar en solución LFB ¹¹ a 37 a 42 ° C (durante la noche).
      4. Enjuague el exceso de tinción con etanol al 70%.
      5. Enjuague con agua destilada.
      6. Colocar en carbonato de litio diluido (8%) (pocos segundos).
      7. Diferenciar en 70% de etanol (pocos segundos).
      8. Enjuague con agua destilada.
      9. Repita los pasos 4.4.2.6 a 4.4.2.8, si es necesario, hasta bntecedentes es incoloro.
      10. Colocar en cresil violeta acetato solución de trabajo a 37 ° C (10 min).
      11. No lave en agua.
      12. Deshidratar en 3 cambios de alcohol absoluto (1x 30 sec, 20 sec 2x) y 3 cambios de xileno (1x 1 min 30 s, 2 x 1 min).
      13. Montar y cubreobjetos con DPX.
   3. Azul tricrómico de Masson (modificado de ^11):
      1. Desparafinación como por 4.4.2.1.
      2. Junte las dos secciones al agua (2 min).
      3. Teñir los núcleos utilizando hierro hematoxilina de Weigert (2 min).
      4. Lavar en agua corriente, enjuague en agua destilada.
      5. Teñir en solución de fucsina ácida-escarlata de Biebrich (5 min).
      6. Enjuague con agua destilada.
      7. Diferenciar en ácido fosfo-fosfowolfrámico hasta que el colágeno es de color rosa pálido (6 min).
      8. Enjuague con agua destilada.
      9. Contratinción de azul de anilina (1 min).
      10. Lavar bien en ácido acético al 1% (1 min).
      11. Deshidratar, montaje y cubreobjetos como per 4.4.2.12 y 4.4.2.13.
   4. PAS (modificado de ^11):
      1. Desparafinación como por 4.4.2.1.
      2. Oxida en ácido periódico 1% (15 min).
      3. Lavar en agua corriente del agua y luego destilada.
      4. Teñir con el reactivo de Schiff (15 min).
      5. Lave en agua (5 min).
      6. Contratinción con hematoxilina de Harris (1 min).
      7. Lavar brevemente en agua del grifo.
      8. Diferenciar en alcohol ácido al 0,5% (1 dip).
      9. Lave bien con agua del grifo.
      10. Azul en el agua del grifo de Scott (1 min).
      11. Lave bien con agua.
      12. Deshidratar, montaje y cubreobjetos según 4.4.2.12 y 4.4.2.13.
   5. Perls azul de Prusia mancha como se describe en ^11.
5. La tinción de inmunofluorescencia se realizó como se detalla:
   1. Desparafinación como por 4.4.2.1.
   2. Enjuague con agua destilada (2 x 5 min).
   3. Realizar la recuperación de antígenos usando tampón de citrato 0,01%, pH de 6 a 75 - 80 ° C (20 min) unad dejar enfriar en una solución tampón de citrato 0,01% (20 min).
   4. Lavado de las secciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilizar la membrana celular en solución tampón de lavado (10 min).
   6. Incubar en solución de bloqueo de suero (2 hr).
   7. Incubar las secciones de un único anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos (10% de cabra normal serum/0.1% Triton X-100/PBS) (por la noche en la nevera). El título de cada anticuerpo primario usado se muestra en la Tabla 1.
   8. Después de la incubación durante la noche, lavar las secciones en solución de tampón de lavado (5x 3 min). A partir de ahora, mantener las secciones en la oscuridad.
   9. Incubar las secciones en el anticuerpo secundario correspondiente a un título de 1:500 para una duración específica (véase la Tabla 1 para más detalles).
   10. Lavar las secciones en solución de tampón de lavado (3 veces 5 min).
   11. Incubar las secciones en DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Lavar las secciones en solución de tampón de lavado (3 veces 5 min).
   13. Montar y cubreobjetos utilizando fluorescamedios de montaje NT.

Las muestras de ensayo y muestras de control están listos para la comparación por pares.

Resultados

La figura 4 muestra una sección representativa resultante de cortar la muestra representada en la Figura 3. La sección se corta a 5 m de espesor y se tiñeron con H & E de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente. La forma grave de la tira de muestra se conserva con artefactos tejidos diferenciales mínimos (Figura 4A). Ambas marcas de colorante eran visibles en la esclerótica, aunque el tinte verde era más resistente que el rojo (Figura 4B). Las capas de la retina no fueron artificialmente separadas y la morfología de la retina se conserva (Figura 4C). El tejido de la retina adyacente a las marcas de colorante, lo que corresponde a la ubicación de los electrodos en la matriz, puede ser fácilmente identificada.

La Figura 5 muestra la tinción inmunohistoquímica y representante especial de las secciones de tejido preparados de acuerdo con el protocolo actual. Consulte la Figura 5 Caption y materiales complementarios para obtener más detalles sobre las manchas específicas y las modificaciones que se hagan a su uso. Después de la modificación, las manchas y la inmunohistoquímica son equivalentes a las normas establecidas - como se verifica por los patólogos.

Tipo de anticuerpo primario y título (entre paréntesis)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Tipo de anticuerpo secundario y título (entre paréntesis)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Duración de la incubación de anticuerpo secundario	1 hr	2 hr	45 min

Tabla 1. Tipo de anticuerpos, Titre y duración de etiquetado.

Figura 1. Suprachoroidal de electrodos Prototype. A) Fotografía macro de una matriz de moldeado grado clínico. B) Microfotografía de un conjunto preclínico hecho a mano.

Figura 2. El ex Histología de retina. Métodos histológicos estándar se utilizaron para preparar estos, H & E manchadas, secciones de un ojo implantado con una matriz de electrodos supracoroidal. A) Una sección ortogonal a través de la cavidad de matriz de electrodos (representado por una estrella). La retina se separa del tejido ocular externa. Esto es particularmente evidente por debajo de la región implantada (flecha). Es imposible determinar qué porción de la retina era adyacente a cada electrodo individual de la matriz. Barra de escala = 1 mm. B) Un aumento mayor de la región en caja en el panel A. Hay varios, regularmente espaciadas, artefactos en la laye retinars (flechas), así como gran desprendimiento de la capa de tapetum (la capa reflectante en los ojos felino). Barra de escala = 100 micras. C) Un aumento mayor de la región en caja en el panel B. Flecha indica los segmentos externos de los fotorreceptores, así como el epitelio pigmentaria, que permanecen intactos, lo que sugiere que el desprendimiento era un artefacto efecto secundario del tratamiento, en lugar de ser causado por un traumatismo en vivo o patología. Barra de escala = 20 micras.

Figura 3. Localización y disección de electrodo-tejido adyacente. AD) High Dynamic macro fotografías alcance de un ojo enucleado, con una serie de electrodos supracoroidea in situ. A) Colocar fijadas con fijador de Davidson, y antes de la eliminación de matriz, la esclerótica translúcida permite la visualización delos electrodos individuales en la matriz (solo ejemplo se indica con la flecha). B) Los electrodos están marcados con un tinte de color predefinido. C) marcas Dye a espaciamiento regular de puntos de referencia anatómicos se utilizan para mantener la consistencia a través de experimentos. D) Tras la eliminación del matriz, el ojo se disecciona a mano en tiras de muestra. Flechas de colores indican dos de los sitios adyacentes de los electrodos en la esclerótica. Línea discontinua amarilla indica plano de corte. E) Macro-fotografía de tira de muestra incrustado en un bloque de agar. F) Macro fotografía de la tira de muestra agar-embed del Grupo E, cortado y colocado en un casete de incorporación con el apoyo de espuma almohadillas biopsia para minimizar el movimiento de la sección durante el procesamiento.

La Figura 4. Nueva Histología Retina. trong> La tira de muestra anterior (de la Figura 3D), que contiene el bolsillo electrodo, era embebidos en parafina, se seccionaron a 5 micras y se tiñeron con H & E. A) verde y las regiones teñidas de rojo (indicada por las flechas, lo mismo que la Figura 3D) son visibles en una sección tomada en el nivel de la línea de trazos de color amarillo en la Figura 3D. Barra de escala = 1,000 micras. La retina no se desprende, ni debajo del bolsillo array ni remotamente. B) La región en caja de Grupo A con tinte rojo y verde visible indicado por las flechas, y la retina intacta en todas partes. Barra de escala = 500 micras. C) de la región en caja del Grupo B, que muestra la intacta, que se adjunta, la retina adyacente al tinte verde. Barra de escala = 50 micras. Sabiendo que la ubicación del colorante indica la posición de un electrodo, podemos con toda confianza evaluar el tejido de la retina adyacente de los daños, si los hubiere, causada por la estimulación eléctrica.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figura 5. Ejemplos de cytohistochemistry retina modificado usando tinciones especiales e inmunofluorescencia. El uso de fijador de Davidson, en contraposición con las técnicas estándar de fijación de formalina, alteraciones necesarias a los protocolos de tinción habituales, como se indica en el texto principal protocolo. Los patólogos han confirmado que estas modificaciones resultaron en tinción equivalente. A) H &E; hematoxilina manchas púrpura núcleos de las células, mientras que eosina manchas citoplasma de la célula, de colágeno y de apoyo de tejido varios tonos de color rosa. B) LFB mielina manchas azules, mientras que la tinción de contraste violeta de cresilo se puede utilizar para . identificar las células ganglionares de la tinción cuerpos de Nissl en el azul pericarión y destacando las células satélites que rodean las células C) azul tricrómico de Masson, la Biebrich scarlet-fucsina ácida solución manchas muscular fibros rojo, mientras que las manchas de azul de anilina del colágeno, en este caso, la esclerótica, azul D) PAS;. componentes glicoproteína de la membrana basal y componentes del tejido conectivo se tiñen de color púrpura, mientras que la contratinción de hematoxilina celular núcleos púrpura E) Perls azul de Prusia.; en el lugar de la hemorragia, la formación de hemosiderina degradadas a partir de células rojas de la sangre y la liberación de complejos de hierro produce un color púrpura, mientras que la adición de colores neutros tiñen de rojo lisosomas rojo F) GS;. este neurotransmisor enzima degradante que se encuentra en las células de Müller ¹³ (verde ), se puede observar que se extiende en ambas direcciones con los cuerpos de las células de Müller en la capa nuclear interna y Müller endfeet células que forman la membrana limitante interna G) NF-200,. esta pesada cadena de proteínas del citoesqueleto (verde) se encuentra en el soma celular y los procesos de , enlaces cruzados con otros neurofilamentos para mantener la estructura de las neuronas ^14,15. Gangliolas células y sus axones se pueden ver en la capa de células ganglionares y de la capa de fibras nerviosas, mientras que los axones de las células horizontales situados en la frontera exterior de la capa nuclear interna en la retina felino, también se ponen de relieve. Contratinción con DAPI (azul) permite la visualización de capas de la retina H) GFAP;. Esta proteína del citoesqueleto (rojo) proliferaron en las células de Müller y astrocitos durante gliosis ^16, se puede ver que recubre la capa de fibras nerviosas con las células de Müller formando extensiones finas a través del interior de las capas externas de la retina. Contratinción con DAPI (azul) permite la visualización de las capas de la retina. Barra de escala = 50 micras en todos los paneles. La retina interna se muestra en la parte superior de cada imagen; la retina externa se muestra en la parte inferior de cada imagen, excluyendo Grupo E, que muestra la reacción subescleral.

Discusión

La evaluación de la seguridad del implante es una consideración primordial para los estudios preclínicos. Antes de una prótesis retiniana se puede implantar en los seres humanos es esencial para verificar que no causará ningún daño. Esto requiere una evaluación tanto de la biocompatibilidad del implante ^17-23, así como cualquier daño potencial que podría ser causado por la estimulación eléctrica crónica ^24-26. La experiencia con prótesis neurales similares, como el implante coclear, da una idea de la amplia gama de estimulación y los parámetros físicos, que no causan daño a los tejidos ^27. Sin embargo, la retina tiene características diferentes a otros lugares de implantación y los límites de seguridad por lo tanto, precisos (tales como la densidad de carga máxima) no se puede suponer a partir de estudios anteriores en otros sistemas. Densidades de carga son más altos en las zonas de los electrodos activos y esto se corresponde con el mayor potencial de daño. Por lo tanto un método para localizar el tejido directamente adyacentea los electrodos activos individuales aumentaría en gran medida la utilidad de estos estudios. El tejido adyacente a regiones específicas del implante también puede resaltarse para una inspección más cercana. Este enfoque dirigido permite un menor número de secciones que se deben analizar, mientras que la confianza de retención que se examinó el "peor escenario".

El método de localización tinte escleral descrito aquí ha sido ampliamente probado con forma de mano y moldeado de silicona / matrices de electrodos Pt ^28-30. Se ha utilizado con película delgada de poliamida arrays ^7,31 y también matrices de película delgada de silicona / Pt ^32. Algunos estudios prótesis retinales emplean electrodos en forma de "bala" con implantaciones intraesclerales ^33. La presente técnica debe ser eficaz para la evaluación de este tipo de conjuntos de electrodos. Ojos felinos con esclerótica delgada (espesor en polo posterior 90 a 200 micras) permite la visualización de los electrodos individuales en una matriz. Sin embargo, incluso si electro personades no eran visibles, sus posiciones se podrían inferirse fácilmente utilizando una plantilla de silicona cuando el contorno de la matriz puede ser visto (similar a la utilizada en el paso 2.6).

El mapeo de tinte limita la necesidad de obtener secciones de tejido no relevantes como se obtienen sólo las secciones con el colorante presente. La capacidad de inferir con precisión la posición del electrodo no sólo permite el análisis histopatológico correspondiente y un mayor poder estadístico, pero tiene un gran impacto en el tiempo y la gestión de costes mediante la reducción de la cantidad de diapositivas y hojas utilizadas, así como el costo de mano de obra. El uso de un colorante que es adherente y puede soportar el procesamiento de tejido, mientras que también es visible en secciones de tejido teñidas es una importante consideración inicial. El conocimiento de la ubicación del colorante y la orientación del tejido en la disección y durante la incrustación de ayuda en el proceso de corte. Esto incluye orientar correctamente el bloque para lograr una sección que no está cortado oblicuamente y da una representati completaen el tejido. Por lo tanto, es importante que la persona que realiza el corte está presente en el momento de la aplicación del colorante, la disección y la incrustación.

El protocolo general es robusto a menor alteración, particularmente con tiempos de fijación. Sin embargo, la disección de los ojos y los pasos de marcado tinte son procedimientos delicados que se benefician de una buena destreza manual para evitar daños en la muestra. Mientras que el fijador de Davidson ha demostrado ser eficaz para reducir los artefactos de desprendimiento de la retina cerca de un implante, que no impide el daño mecánico directo durante la disección. Fijador de Davidson no era fácilmente compatible con algunos procedimientos histológicos e inmunohistoquímicos especiales. Por lo tanto, había una necesidad de modificar / optimizar estos pasos como se detalló anteriormente. Cambios incrementales en los tiempos de tinción y las concentraciones se realizaron hasta que se logró un resultado óptimo - para más detalles, consulte el material complementario.

La cuantificación de la retinahistología sigue siendo problemática. La retina es no homogénea y tanto el espesor y el cambio de densidad celular al aumentar la distancia de la zona de ^34,35 centralis. Por lo tanto, los tejidos vecinos dentro del ojo implantado no se puede utilizar para las comparaciones y un ojo de control se emplea en su lugar. Pares a juego de cada sección con el ojo de control nos da una más potente comparación estadística de los cambios patológicos, eficacia y seguridad los resultados con prótesis de retina son mejor evaluadas al comparar los compañeros de los ojos en un objeto ^36. Especial cuidado se debe tomar para minimizar el corte oblicuo, lo cual afectaría la cuantificación.

En resumen, los métodos descritos anteriormente han mejorado significativamente nuestro análisis histopatológico, que a su vez ha conducido a un flujo de trabajo preclínico más eficiente. Los resultados de los estudios preclínicos utilizando estos métodos llevaron directamente a un ensayo clínico en el que 3 pacientes con RP se han implantado de manera segura con suprachoroiprótesis retinales dal. Estos métodos son relevantes tanto para estimuladores de retina y otros implantes oculares donde la respuesta patológica a la implantación a largo plazo debe ser evaluado. Este método ofrece ventajas valiosas para el mantenimiento de la citoarquitectura y registro de la patología de las regiones de interés en el implante. Aunque no se ha probado específicamente, una modificación de estos procedimientos puede ser utilizado en otras especies y otras localizaciones anatómicas, en particular cuando una matriz se implanta superficialmente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.