Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Resumen

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Resumen

El pez cebra son una poderosa herramienta para estudiar la biología del desarrollo y la patología en vivo. El pequeño tamaño y la transparencia relativa de embriones de pez cebra los hacen particularmente útiles para el examen visual de los procesos tales como el corazón y el desarrollo vascular. En varios estudios recientes pez cebra transgénico que expresan EGFP en las células endoteliales vasculares se utilizaron para la imagen y analizar las redes vasculares complejas en el cerebro y la retina, utilizando microscopía confocal. Las descripciones se proporcionan a preparar, tratar y la imagen embriones de pez cebra que expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP), y luego generar representaciones 3D integrales del sistema cerebrovascular. Los protocolos incluyen el tratamiento de embriones, la imagen confocal, y protocolos de fijación que preservan la fluorescencia de EGFP. Además, se proporcionan consejos útiles sobre la obtención de imágenes de alta calidad de las estructuras vasculares cerebrales, como la eliminación del ojo sin dañar el tejido neural cercano. Peligros potencialescon la imagen confocal se discuten, junto con los pasos necesarios para generar reconstrucciones en 3D de pilas de imágenes confocal utilizando software de código abierto disponible gratuitamente.

Introducción

El pez cebra proporciona un potente sistema para estudiar la biología del desarrollo, y la transparencia relativa de sus embriones es susceptible a los estudios basados ​​en la imagen ^1. El pez cebra ahora se ha utilizado como un modelo para el desarrollo de vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluyendo el pez cebra, tienen un sistema vascular vertebrados simplificado que no tiene homólogo razonable en los invertebrados. La sangre es bombeada desde la cámara anterior de un corazón de dos cámaras a través de las branquias, donde se oxigena. La sangre de las branquias converge en la aorta dorsal y pasa a través de las arterias que se ramifican en vasos más pequeños y más pequeños, eventualmente capilares alcance en tejidos de órganos. Dentro de oxígeno capilares se libera y el dióxido de carbono es absorbido. En el lado venoso de los capilares de la sangre fluye hacia las venas más grandes y más grandes y finalmente se introduce en la cámara posterior del corazón, donde el ciclo se repite.

Un pez cebra adulta puede poner 200 o más huevos a la vez, y once fertilizado, se desarrollan rápidamente ^2. Dentro de un día al eje del cuerpo está bien desarrollada, incluyendo los músculos que se contraen y se mueven al embrión por el interior de la membrana coriónica. De 2-7 días después de la fertilización (dpf) la mayoría de los sistemas del cuerpo a desarrollar, incluyendo los ojos y el sistema nervioso central que puede coordinar a nadar hacia la comida o lejos de la luz brillante. Hasta 7 embriones dpf son lo suficientemente pequeños para permitir la visualización con microscopia. Las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes con microscopía confocal o de fluorescencia. Confocal de imágenes se puede combinar con el software de código abierto ³ para crear representaciones en 3D de estructuras vasculares completos en embriones de pez cebra que ofrecen una perspectiva de la biología de sistemas del desarrollo vascular. Estudios relacionados con los cambios en la complejidad vascular y cerebrovascular se beneficiarán de este protocolo, ya que permite un análisis a nivel de sistemas de redes vasculares ^4,5. Una compilación de los métodos y recursos son proporcionard para permitir una fácil adopción y de estas técnicas para los estudios que requieren de formación de imágenes de estructuras vasculares en embriones de pez cebra. La eficiencia de costes del pez cebra como un modelo animal es la combinación con tecnologías de la imagen emergentes para proporcionar nuevas plataformas con las que evaluar los efectos angiogénicos de vías moleculares en el desarrollo de vertebrados y la homeostasis.

Protocolo

1. Pez cebra Cría, generación de embriones, y Tratamiento

1. Llevar a cabo los siguientes protocolos de pez cebra, bajo la guía de un cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) y dentro de las pautas de cuidado de animales de la NIH u otros organismos / directrices reguladoras.
2. Cepas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes en tejidos específicos, células u órganos están disponibles en el Centro Internacional de Recursos de pez cebra (ZIRC). Por ejemplo, la Tg (KDR: EGPF) s843 expresar EGFP en células endoteliales vasculares ^6, que se pueden usar para producir estructuras vasculares 3D completos como se muestra en este protocolo. Otras líneas de pez cebra transgénico están disponibles en ZIRC.
3. Casa pez cebra adulto en un sistema de acuicultura apropiada que monitoriza el pH, la salinidad, la temperatura, el oxígeno disuelto, la luz y otros factores ambientales ^7. El pez cebra muestra aquí fueron alojados en un sistema de Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C con un lig 14 horasoscuridad ciclo ht/10 horas. Alimente adultos de pez cebra con una dieta equilibrada de artemia y NRD 4.6 Alimentos para peces (Artemia directo, Ogden, Utah).
4. Varón adulto y el pez cebra hembra en edad reproductiva deben ser alojados por separado para aumentar el éxito de apareamiento.
5. Estimular la puesta de huevos y la fertilización mediante la colocación de las hembras (2-4) y los varones (4-6) juntos en un contenedor de acoplamiento que tiene un fondo de malla con agujeros lo suficientemente grandes como para que los huevos caen a través de, pero era demasiado pequeña para los adultos de pez cebra para pasar . Configure apareamientos la noche antes; huevos se ponen cerca de la madrugada, por lo general, mientras que el ciclo de luz diurna aumenta lentamente en intensidad (amanecer). Entrada para los huevos en la parte inferior del recipiente de apareamiento cada 15-30 minutos.
6. Recoger los huevos usando un colador de malla y limpia con tampón E3 (NaCl 5 mM, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM _MgSO4). La transferencia de los huevos a 100 mm placas de cultivo llenos de buffer de E3 y almacenar en una incubadora de 28 ° C.
7. Para estudiar los productos químicos que alteran CERebrovascular ramificación agregar concentraciones químicas deseadas. Por ejemplo ramificación neovasular puede ser inducida con inhibidor de la γ-secretasa (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] éster-S-phenylglycinet-butil) solubilizado en DMSO al ^4, comenzando 24 horas después de la fecundación (HPF). En aquel tiempo los embriones puntos siguen estando dentro del corion, y muchas sustancias químicas pueden pasar a través de él ^8. Si una condición de tratamiento tiene neuronales o motoras efectos que perjudiquen la capacidad de los embriones de liberarse del corion, a continuación, los embriones deben ser-chorionated des entre 24 y 48 HPF, que se pueden hacer con fórceps de pronasa ^2. Los embriones que se muestran en las imágenes proporcionadas fueron dechorionated agarrando suavemente el corion con dos pinzas afiladas y lagrimeo abierto.
8. Si es necesario / deseado, la formación de pigmento puede ser inhibida por la adición de 0,003% de N-feniltiourea (PTU) a la memoria intermedia de E3 a 24 HPF.

2. Confocal de Cerebrovascular Structdas en fijo embriones de pez cebra

1. Sacrificio embriones en 250 mg / L tricaína metanosulfonato, y luego arreglarlos por inmersión en 2-4% de paraformaldehído la noche a 4 ° C. Los contenedores con embriones fluorescentes deben ser envueltos en papel de aluminio. Una vez fijado, los embriones deben ser almacenados en PBS a 4 ° C hasta fotografiado - intensidad de la fluorescencia de EGFP se vuelve menos resuelto después de una semana, pero la morfología (como se ve en campo claro) se conserva mucho más tiempo.
2. Preparar para montar el embrión mediante la eliminación de primero un ojo usando una aguja de tungsteno afilado. Cortar alrededor del tejido que conecta el ojo primero y luego cortar los músculos, y finalmente cortar el nervio óptico para desplazar el ojo. (Nota: Si quita proyección de imagen los dos lados se desea ambos ojos.)
3. Una vez que se retira el ojo, montar el embrión en un cubreobjetos usando una gota de 3% de metilcelulosa. Orientar el embrión de manera que el lado con el ojo extraído se enfrenta el cubreobjetos y es lo más cercano al vidrio como sea posible. Cubrir todo el embrión con metillcellulose para evitar la desecación durante la exploración.
4. Imagen del embrión montado inmediatamente utilizando un microscopio confocal invertido equipado con una alta calidad de objetivo de 20x Plan de Apo (apertura numérica = 0.75 o superior). Esta configuración es preferible un microscopio no invertida que requeriría intercalando el embrión entre dos planos de vidrio, y presionando el embrión contra el cristal superior.
5. Recoger rebanadas ópticos en 1 m incrementos mediante un ajuste de la abertura mediana o grande. Pasos más grandes de 2,5 m también se pueden utilizar, pero puede ser más difícil para determinar el orden espacial de los objetos más pequeños. Las aberturas pequeñas producen detalle más agudo, pero las exploraciones más largos requeridos pueden blanquear EGFP y también limitar la profundidad de formación de imágenes en el embrión que se puede lograr. Un microscopio confocal permite la formación de imágenes a mitad de camino a través de un embrión.
6. Si se desea la formación de imágenes de todo el pescado, retire los dos ojos al principio (véase la nota en el paso 3.2), gire el embrión después imaging un lado y repita los pasos 2.3 a 2.5 para el lado opuesto.

3. Reconstrucción 3D de Embryonic pez cebra cerebrovasculatura

1. Utilice la distribución Fiji ³ de ImageJ código abierto (http://fiji.sc), que está optimizado para representaciones en 3D, de forma gratuita, y es compatible con PC, Mac y Linux.
2. Importar pilas confocal a Fiji por ir a Plugins> LOCI> BioFormats Importador ⁹ a continuación, seleccione el archivo confocal, por ejemplo name.ids para pilas de Nikon (Figura 2A). Seleccione Ver pila con el modo HyperStack, color: escala de grises, compruebe autoescala, compruebe canales divididos.
3. Estas selecciones se abrirán cuatro paneles de canales separados; para EGFP único se necesitarán, por lo general el tercero hacia abajo. Cierre los otros tres paneles (rojo, azul y alfa) dejando la imagen de 16 bits con un nombre largo, seguido de C = 1 (Figura 2A).
4. Ajuste de umbral en los escaneos aunque la imagen utilizando el desplazamiento tab en la parte inferior para encontrar un sector que tiene la región o estructura de interés, a continuación, ir a Imagen> Ajustar> Umbral (Figura 2 C).
5. En el panel que aparece, deslice la barra superior (nivel de negro) a la izquierda de modo que la estructura se puede ver bastante bien sobre el fondo, y dejar la corredera inferior (nivel de blanco) donde es (Figura 2D). Seleccione B & W, seleccione Fondo oscuro. No seleccione Umbral calcular para cada imagen a menos que se requieren diferentes ajustes para cada sector, seleccione fondo Negro. Este proceso crea una nueva imagen de 8 bits.
6. ADVERTENCIA: El umbral no se puede deshacer o guardado en ImageJ, por lo que la pila confocal tendrá que volver a cargar cada vez que se necesita un cambio. Anote los números y probar diferentes configuraciones hasta conseguir el resultado deseado.
7. Ir a Plugins> 3D Visor> Umbral 0, Remuestreo factor de 1 (mejor) o 2 (bueno), anule la selección de los cuadros de color rojo y azul para hacer una salida de 3D verde - de lo contrario, will producir una representación blanco - seleccione Aplicar (no automático) (Figura 2E).
8. Girar, girar y ampliar o reducir la imagen 3D con el ratón y los controles del teclado (Figura 2F).
9. Guardar imágenes fijas en cualquier momento mediante el uso de la opción de captura en el menú. El tamaño del cuadro de imagen en la pantalla dicta dimensiones en píxeles de la imagen producida por lo que si una imagen de alta resolución se desea hacer la caja más grande, arrastre la esquina inferior derecha.
10. Crear una película que hace girar 3D seleccionando Ver> Registro de la rotación de 360 grados (Figura 2G). Incumplimientos de rotación a 2 grados por paso, pero se puede cambiar a los 5 grados, por ejemplo, lo que creará tamaños de archivos mucho más pequeños, pero pueden agregar sacudidas a la animación.
11. Guarde el archivo en uno de los varios formatos disponibles para su posterior visualización con los reproductores multimedia, subir a Internet, o utilizar en presentaciones de PowerPoint. La fuente reproductor multimedia abierto, VLC ( http :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), es gratuita y se ocupa de estos videos muy bien.

Resultados

La reconstrucción 3D de estructuras vasculares proporciona una perspectiva global y visualmente interesante de desarrollo del pez cebra. Figuras métodos 1 y 2 muestran ya que normalmente realizan. Figura 3 muestra varios ángulos de estructuras vasculares en un 6 dpf embrión de pez cebra que expresa EGFP en células endoteliales. Con un color verde o blanco sólido que puede ser difícil de apreciar intensidad de la señal; seudo-coloración proporcionar intensidad de la imagen de una tabla de consulta y permite una mejor percepción de la profundidad cuando las estructuras se superponen. Un ejemplo de una imagen en 3D pseudo-color de la vasculatura en un 6 dpf pez cebra se proporciona en la Figura 4. Fluorescencia de formación de imágenes de embriones vivos se puede utilizar para estudiar las características fisiológicas que incluyen el ojo y el movimiento del cuerpo, y la actividad cardíaca. Figuras 3 y 4 mostrar resultados representativos obtenidos con estos métodos, utilizando la línea de pez cebra transgénico descrito. Imágenes de resolución depende de las características de microscopio, pero el brillo de la señal de EGFP es suficiente para una buena calidad de imagen con la mayoría de los sistemas comerciales. Reconstrucción y rendición de representaciones en 3D, es consistente y opciones dentro de este software de código abierto proporcionan consistentemente buenos resultados.

Figura 1. Eliminación de ojos. A) Un embrión 3 dpf fija con una necesidad de tungsteno situado al lado del ojo. El tejido se cortó alrededor del ojo a partir de esta posición. B) El ojo es cae y los músculos oculares subyacentes y el nervio óptico se cortan. La cuenca vacía está indicado con el círculo de trazos. C) El mismo embrión se dio la vuelta y montado con metil-celulosa, con el ojo intacto hacia arriba. hres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Paso a paso la reconstrucción 3D de una pila de imagen confocal. A) Abrir el archivo (4104.1.ids) cargado en Fiji usando Plugins> LOCI> BIOFORMAT seleccionar. B) Después de encontrar un sector con la región de interés, se selecciona el ajuste de umbral como se muestra. C) Threshold se ajusta al 214 utilizando la parte superior se selecciona slider y aplicar. espectador D) 3D se llama como se muestra. E) La reconstrucción 3D se muestra de un pez cebra con el ojo intacto, para la orientación. F) La imagen ha sido ampliada y se hace girar. G) Una película de la rotación de 360 grados se hace como se muestra. res.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Perspectivas de la reconstrucción 3D. A) perspectiva medial de 6 embriones dpf reflejado con objetivo de 10x, la boca está a la derecha, no branquias dentro de la boca. B) lateral del mismo embrión, nota aleta es un bucle en el medio. C) El mismo embrión reflejado con objetivo 20x, perspectiva medial, la resolución de enmalle nota. D) La perspectiva lateral de 20x de imagen objetivo. La aleta está en el borde derecho del panel. E) vista antero medial de 20x de imagen objetivo, branquias nota dentro de la boca. F) Abdomen del mismo embrión fotografiado con un objetivo de 20x, la cabeza hacia la derecha. Nota vasculatura en el saco de la yema en la parte inferior derecha.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Diferencias de intensidad en 6 dpf embrión. Imagen de una reconstrucción 6 dpf usando un look-up-tabla pseudocolor para la intensidad de la señal. Boca, el cerebro, branquias y saco vitelino están etiquetados para la orientación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Película del sistema vascular reconstruida en un pez cebra 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras. Las imágenes erande imagen una media del embrión. Comparar las estructuras vasculares con estructuras en un pez cebra tratados-GSI proporcionadas en la Figura 6. Tenga en cuenta la menor densidad de los vasos sanguíneos en la cabeza y branquias más grandes. (Consulte el archivo complementario "Zfish_spin.avi" zona de descargas)

Figura 6. 3D Movie del sistema vascular en el embrión tratado-GSI en 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras a través de lateral a la línea media. Comparar las estructuras vasculares con el control 4 dpf peces se muestra en la Figura 5. La espalda arqueada y el tamaño más pequeño son típicos en los embriones tratados con este producto químico. (Ver la "GSI-treated_4dpf_fish.avi" archivo suplementario en Descargas)

Discusión

Los métodos descritos aquí proporcionan una base para los estudios visuales del sistema vascular en el desarrollo de pez cebra. Los especímenes vivos se pueden utilizar para evaluar los parámetros fisiológicos, tales como la frecuencia cardíaca y el volumen sistólico del corazón, mientras que las muestras fijas se pueden utilizar para la formación de imágenes confocal de alta resolución. Drosophila y C. elegans permite la formación de imágenes de todo el cuerpo, pero el pez cebra son vertebrados y proporcionan un modelo útil para los tejidos de vertebrados, incluyendo un sistema vascular de células forrado endotelial. Estos estudios pueden incorporar líneas transgénicas importantes y recursos genómicos de la comunidad de investigación de pez cebra. Reconstrucción 3D y renderizado de imágenes de confocal de embriones de pez cebra, tal como se describe aquí, permitir un enfoque de la biología de sistemas para la ramificación vascular y la densidad de los vasos sanguíneos que no es posible con los modelos animales más grandes, como las ratas y los ratones. Además, como amniotas pez cebra se desarrollan en un entorno modificable (tampón E3), donde se puede agregar fácilmente chemicals que inhiben las enzimas específicas u otros procesos que afectan al desarrollo vascular. La concentración y el tiempo de entrega de productos químicos pueden ser alterados, lo que permite al investigador condiciones de tratamiento para afinar.

1. Modificaciones y solución de problemas

Las modificaciones de este sistema puede incorporar líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes EGFP o otros en una variedad de tejidos, de órganos o región patrones específicos ^10. Además, el análisis de los cambios neovasculares de la retina de pez cebra recientemente se ha publicado ^5. Problemas con la pigmentación en embriones de pez cebra adultos mayores y pueden ser compensadas por el cruce con líneas transgénicas que no producen pigmentos escala o pigmentario de la retina. Problemas con fluorescencia disminuida resultan típicamente de fijación de condiciones inapropiadas. El paraformaldehído (4%) durante 1 día es el óptimo, pero fijadores más fuertes, tales como glutaraldehído, tetróxido de osmio o alcohol, mayodestruir EGFP fluorescencia. Después de la fijación, los embriones deben mantenerse en PBS a 4 ° C y siempre protegidos de la luz directa del sol.

2. Limitaciones de esta técnica

La calidad y la resolución de representaciones en 3D producidas con este protocolo dependen de la calidad de las imágenes generadas. Penetración de la luz a través de estos embriones se limita al plano sagital medial utilizando un microscopio confocal estándar. Este aspecto de la imagen limita la profundidad de las imágenes en los embriones de más edad y los adultos, pero los sistemas de microscopía multifotónica más avanzados permiten la proyección de imagen a mayores profundidades.

3. Importancia con respecto a los métodos existentes

Este protocolo proporciona un enfoque para el análisis de redes de vasos sanguíneos en un nivel de sistemas que puede incorporar un animal entero. Representaciones anteriores de tales datos a menudo se basaban en serie de imágenes dispuestas juntos, pero 3D proporciona una mejor resolución de la relación espacialciones implicadas.

4. Las futuras aplicaciones

Nuevos avances en la formación de imágenes y procesamiento de tejidos ofrecerá muchas nuevas aplicaciones para estos métodos que pueden incluir hacer embriones de más edad o adultos transparente ^11-14. Mayor transparencia aumentará en gran medida la penetración del tejido por los láseres confocal y multi-fotón. Además, como la velocidad de las cámaras y los tubos fotomultiplicadores aumentar pronto podría ser posible producir representaciones en 3D de peces en tiempo real, proporcionando una 4 ^ª dimensión de análisis.

5. Los pasos críticos

Un paso crítico en este protocolo es la preparación para la formación de imágenes, que incluye la fijación adecuada. Imaging se debe hacer lo más pronto posible después de la fijación de los objetivos de alta calidad que tienen las mejores aperturas numéricas disponibles. Resolución depende del sistema de imagen utilizado, por lo que los sistemas de alta calidad son generalmente mejores. La generación de representaciones en 3D requiere mucha memoriaPorque de esta manera nuevos, computadoras de alta gama con una gran cantidad de memoria y buenos procesadores gráficos son recomendables.

El sistema de la biología visual descrito aquí ha sido optimizado para el pez cebra transgénico que expresan EGFP en células endoteliales vasculares, aunque estos métodos se pueden adaptar a los embriones transgénicos que expresan la GFP, o de otras proteínas fluorescentes, en las poblaciones de neuronas, músculos, glándulas o de cualquier número de otras células. La principal ventaja de trabajar con este sistema es la posibilidad de estudiar lo que está sucediendo en todo el embrión en cualquier momento durante este período de desarrollo, en los animales fijos y / o en vivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
N – Phenylthiourea	Alfa Aesar, catalog #41972		0.2 M in E3 buffer, kept at 4 °C
E3 buffer	Sigma		5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Confocal microscope	Nikon		D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U
Glass bottom dishes	Mat-Tek
GSI IX/DAPT			N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences
24 well plates	Becton-Dickinson, cat# 351147		BD Falcon
Transfer pipettes	VWR, cat #414004-001		VWR disposable transfer pipettes
Methyl-cellulose	Alfa Aesar, cat#43146		3% in E3 buffer
NRD 4/6 Fish food	Brine Shrimp Direct		Dried
Brine shrimp	Brine Shrimp Direct		Live
Tungsten wire	Small Parts # TW-016-60		0.016” OD
Tricaine	VWR # 101107-950		Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer