4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

Resumen

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente Citrobacter rodentium Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D C. rodentium Infección.

Resumen

Este protocolo describe los pasos necesarios para el seguimiento longitudinal de una infección bacteriana bioluminiscente mediante tomografía 3D compuesta de imágenes con luz difusa integrada μCT (DLIT-μCT) y el uso posterior de estos datos para generar una película del ciclo de infección de cuatro dimensiones (4D). Para desarrollar las películas de infección 4D y para validar la formación de imágenes DLIT-μCT para estudios de infección bacteriana usando un espectro CT IVIS, hemos utilizado la infección con C. bioluminiscente rodentium, que causa colitis espontánea en ratones. En este protocolo, se esboza la infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y la monitorización no invasiva de la colonización por el diario de imágenes DLIT-μCT y enumeración de bacterias de las heces durante 8 días.

El uso de la IVIS Spectrum CT facilita la co-registro sin fisuras de las exploraciones ópticas y μCT utilizando una única plataforma de imágenes. La modalidad μCT dosis bajas permite la generación de imágenes de los ratonesen múltiples puntos de tiempo durante la infección, proporcionando localización anatómica detallada de focos de bacterias bioluminiscentes en 3D sin causar artefactos de la radiación acumulativa. Es importante destacar que el cine 4D de ratones infectados proporcionan una poderosa herramienta de análisis para monitorear la dinámica de colonización bacteriana in vivo.

Introducción

Modelos animales pequeños, en particular, aquellos ratones que utilizan, se utilizan habitualmente para investigar la patogénesis bacteriana o para poner a prueba las estrategias de intervención para las infecciones, tales como antibióticos, probióticos, prebióticos y vacunas ^1-7. Los principales lecturas experimentales de infecciones animales pequeños son la carga de patógenos, la localización espacial y temporal de la infección, y los cambios en la respuesta inmune del organismo infectado. En imagen óptica in vivo es una herramienta valiosa para la investigación de enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para supervisar múltiples lecturas experimentales mediante el uso de genes informadores (luciferasa, proteínas fluorescentes, beta-lactamasa, etc), colorantes fluorescentes, nanopartículas o sondas quimioluminiscentes dirigidos a una proteína, proceso biológico, o microorganismo ^6.

Imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imagen óptico utilizado para controlar la colonización de los animales pequeños, tales como ratones y ratas, por bac patógenaria ^3,6,8,9. Los ratones se infectan con bacterias recombinantes que expresan una luciferasa, tales como el operón lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bacterias pueden entonces ser detectados a través de su producción de luz usando un CCD basado en formación de imágenes in vivo del sistema ^3,6,9. Es importante destacar que sólo los microorganismos metabólicamente activas son bioluminiscentes (BL), es decir, sólo las células bacterianas viables se detectan mediante esta metodología ^10,11. Uso de 2D BLI, la ubicación de la fuente de BL se infiere de la superficie del animal en el que se emitió la señal ^8. La localización anatómica exacta de los focos BL in vivo tiene que ser determinada mediante el análisis ex vivo de órganos ^3,6,9 En contraste, tomografía compuesto 3D difusa la luz de imagen (DLIT) puede ser utilizado para compilar una reconstrucción 3D cuantitativa de la BL fuente ^12. DLIT se lleva a cabo mediante la recopilación de BL imágenes tomadas con filtros ópticos de paso de banda estrecha definidos yposteriormente insertando en ellos una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 3D ^1,7,12,13.

Actualmente, modalidad de imágenes múltiples es la única metodología disponible para obtener verdadera localización anatómica no invasiva de bioluminiscente focos in vivo sin la necesidad de un análisis ex vivo. Recientemente, se utilizó una combinación de DLIT co-registrado con μCT formación de imágenes para evaluar Citrobacter rodentium (C rodentium) dinámica de colonización después del tratamiento profiláctico con una bacteria probiótica ^7. C. rodentium es un patógeno entérico murino específico utilizado para modelar la infección humana por enteropatógenos y enterhemorrhagic Escherichia coli ^14. C. infección rodentium causas de la colitis, típicamente asociado con la pérdida leve de peso, diarrea, polarizado respuesta inmune Th1 y cambios patológicos distintos, incluyendo hiperplasia de las criptas del colon y adhesión y borrado lesión formati^{el 14.} Además de esto, C. patogénesis rodentium se ha estudiado a fondo el uso de BLI y su dinámica de colonización en ratones C57BL/6J están bien documentadas, por lo que esta bacteria un microorganismo modelo ideal para su uso con múltiples modalidades de imagen ^3,4,7.

Este protocolo es el primero en describir una metodología para la formación de imágenes DLIT-μCT integrado de una infección bacteriana utilizando una única plataforma de formación de imágenes multimodalidad, el IVIS Spectrum CT, y la generación de una película de 4D que muestra la verdadera dinámica de esta infección no invasiva.

Protocolo

1. Ratones Preparación

1. Comprar o criar suficientes 18-20 g C57BL/6J ratones necesarios para el estudio.
2. Si los ratones se compran a un proveedor externo, a raíz de transporte hasta la instalación, habituar a ratones durante 1 semana con la comida y el agua tratada en autoclave para estabilizar la flora intestinal.
3. Pesar, muesca de oreja, y separar el número requerido de ratones por jaula.
4. El día antes de la infección, antes de realizar ningún tipo de anestesia, compruebe que no es adecuado de oxígeno e isoflurano para la duración del procedimiento. Si es necesario, agregue más isofluorano o sustituir la botella de oxígeno. A continuación, comprobar el peso de los carroñeros anestésicos, si han ganado más de 50 g, ya que su primer uso, desechar y reemplazarlos con los carroñeros frescas.
5. Ratones anestesiar utilizando 3% isofluorano en el XGI-8 Sistema de Anestesia y depilate usando VEET durante 7 minutos.
6. Notas:
   • Depilación a fondo es esencial, sobre todo enratones negros como la melanina en la piel atenúa significativamente la señal bioluminiscente ^3,15.
   • Depilación de ratones que suele durar 8-10 días antes de la piel comienza a crecer de nuevo. Para realizar imágenes 4D multimodalidad durante períodos más largos, depilarse ratones cuando se requiere para que el área de interés es desnuda para las sesiones de formación de imágenes.
   • Los ratones se encuentran en un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) instalación de contención.

2. Preparación célula bacteriana

1. Prepare suficiente Luria Burtani caldo y agar suplementado con kanamicina [50 mg ml ^-1] necesario para el estudio y se almacenan a 4 ° C hasta que sea necesario.
2. El día antes de la infección descongele un criovial de C. cepa rodentium ICC180 e inmediatamente agregue cryobead a 15 ml de caldo LB suplementado con kanamicina [50 mg ml ^-1] y la cultura durante la noche a 220 rpm, 37 ° C. Como control para la contaminación medio, preparar un adicionalsin inocular 15 ml de caldo LB suplementado con kanamicina [50 mg ml ^-1] y la cultura a 220 rpm, 37 ° C.
3. A la mañana siguiente (aproximadamente 16 horas), compruebe el control del medio de turbidez como un signo de crecimiento bacteriano. Si el control es claro, transferir la cultura ICC180 a un tubo Falcon y se centrifuga a 4000 rpm. A continuación, lavar el pellet bacteriano en PBS. A continuación, volver a suspender en 1,5 ml de PBS ^(1/10 del volumen original de LB suplementado con kanamicina) y mezclar a fondo para crear el inóculo bacteriano.
4. Para verificar que ICC180 se ha cultivado bien y es bioluminiscente antes de la infección de los ratones, la imagen del inóculo en el IVIS Spectrum CT utilizando BLI y la configuración automática en el asistente 4.3.1 Imagen Vivir como se ha descrito anteriormente ^1.
   Nota:
   • Strain ICC180 es un derivado bioluminiscente de tipo salvaje C. rodentium ICC169 ^2. Esta cepa bacteriana tiene el operón lux CDABE incluyendo una Kgen de resistencia a anamycin inserta en un pseudogen de xylE en el cromosoma ^2.
   • Llevar a cabo todas cultivo bacteriano utilizando técnicas asépticas estándar y, si es necesario o bien adquirir consumibles / reactivos estériles o esterilizar en autoclave antes de su uso.
   • En la etapa 2.4, la lectura bioluminiscencia (p / s / cm ² / SR) se puede utilizar para estimar el número de bacterias antes de la infección de los ratones.

3. La infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y Evaluación de la colonización bacteriana

1. Antes de la infección, compruebe que no es adecuado de oxígeno e isoflurano para la duración del procedimiento. Si es necesario, agregue más isofluorano o sustituir la botella de oxígeno. A continuación, comprobar el peso de los carroñeros anestésicos, si han ganado más de 50 g, ya que su primer uso, desechar y reemplazarlos con los carroñeros frescas.
2. Ratones anestesiar con 3% isofluorano con an-8 XGI AnaestheSistema sia para proporcionar seguridad humana.
3. Mezclar el inóculo bacteriano a fondo y extraer 0,2 ml (aproximadamente 5 x 10 ⁹ ufc ICC180) en la jeringa.
4. Retire los ratones del sistema de anestesia de una en una y pescuezo ellos sujetando firmemente la piel detrás del cuello con el pulgar y el índice.
5. Empuje la aguja de sonda hacia el techo de la boca, sobre la lengua, y baja por el esófago e inyectar el inóculo bacteriano en el estómago.
6. Después de una sonda nasogástrica de los ratones, vigilar su andar y respirar en busca de signos de angustia que puede ser una señal de que el inóculo bacteriano se ha entregado a los pulmones. La eutanasia a los ratones que han sido inoculados en los pulmones.
7. Ratones no infectados por sonda con 200 l de PBS como un control del vehículo, tal como se describe en los pasos 3.1 a 3.6.
8. Para confirmar que la sonda nasogástrica se ha realizado correctamente, imagen infectados y simulacro de ratones infectados en el IVIS Spectrum CT utilizando BLI y la configuración automática de la Vida4.3.1 asistente de imagen como se ha descrito anteriormente ^1.
9. Determinar el número de bacterias viables en el inóculo mediante dilución en serie en PBS y manchado por triplicado en placas de agar LB suplementado con kanamicina [50 mg ml ^-1].
10. Calcular el número de ICC180 ufc / ml mediante la búsqueda de una dilución donde hay aproximadamente 5-50 colonias y cuentan el número de colonias de cada punto en el que la dilución y registrar la dilución que las colonias se contaron en. Posteriormente, el cálculo de la media del número de ufc (a partir de los tres puntos) y multiplicar este valor por el factor de dilución 50 (cada punto es de 20 l de la muestra original 1 ml) y la dilución de las colonias se contaron en, dando ufc / ml.
11. Monitorear la colonización de los ratones diariamente mediante la recopilación de las heces de cada ratón en un tubo Eppendorf previamente pesado (pesado en un delicado equilibrio) y se diluye 1/10 en PBS basado en el peso de la muestra (0,1 g ml ^-1).
12. Determinar el número de bacterias viables enlas heces por dilución en serie en PBS y manchado por triplicado en placas de agar LB suplementado con kanamicina [50 mg ml ^-1].
13. Calcular el número de bacterias viables por gramo de heces siguiendo el paso 3.9, y luego multiplicar el número de ufc / ml por el factor de dilución fecal en PBS (paso 3.10), de 0,1 g ml ^-1 para dar ufc / g.
14. Para determinar que los ratones se inocularon con un cultivo puro ICC180 y que todas las colonias son bioluminiscentes. Tome las placas de agar del Paso 3.8, evaluar la morfología de la colonia bacteriana ya sea a simple vista o recoger una colonia representativa de la placa y análisis por microscopía de luz. Si es necesario, la identificación bacteriana se puede realizar por la cepa colonia PCR específica para evaluar la pureza del cultivo. Posteriormente, la imagen de las placas en el IVIS Spectrum CT utilizando BLI como se describe en el paso 3.7 y comprobar que el 100% de las colonias en la placa son bioluminiscentes.
    Notas:
    • En el paso 3.4, al insertar la aguja de sonda, Si usted siente la resistencia no fuerce la aguja de sonda, ya que esto hace que el inóculo para entrar en los pulmones. En su lugar, vuelva a insertar la aguja y suavemente vuelva a intentarlo.
    • Paso 3.1 es opcional y los ratones puede ser oral gavaged sin anestesia en función de la política de bienestar animal institutos.
    • Bancos deben sembraron el día en que se recogen. C. rodentium crecerá incluso si se deja a 4 ° C durante la noche en PBS y hará que la cuantificación de la cfu / g heces a ser incorrecta.

4. Diario Composite 3D difusa luz tomografía con μCT Imaging (DLIT-μCT) de los ratones infectados

Consideraciones de bienestar animal: DLIT-μCT implica imágenes ópticas DLIT integrado con una dosis de radiación μCT exploración bajo rápido (~ 23 mGy para un análisis de dos ratón, ~ 53 mGy para un solo escaneo ratón) de un animal inmovilizado. Esta dosis se acumula con cada sesión de imágenes, por lo que el objetivo es mantener la dosis como low como sea posible (y siempre muy por debajo del LD _50/30) mientras que todavía llevar a cabo el estudio. En algunos casos, si no hay ninguna señal de infección en una exploración BLI convencional de los ratones, la exploración μCT puede evitarse para minimizar aún más la dosis. A pesar de que la dosis se mantiene tan baja como sea posible, en los estudios prolongados si hay alguna preocupación sobre la exposición a la radiación, los ratones se sacrificaron a la primera señal de síntomas perjudiciales o al final del período de formación de imágenes μCT.

1. Antes de la proyección de imagen, inicializar el IVIS Spectrum CT y comprobar que los cierres de seguridad de rayos X están funcionando y que la etapa climatizada está a la temperatura adecuada (37 ° C) para la imagen. Posteriormente, comprobar el nivel de isoflourane en el sistema de anestesia y el peso de los eliminadores de anestésicos. Si es necesario, agregue más isofluorano y si los carroñeros han ganado más de 50 g, ya que su primer uso, desechar y reemplazarlos con los carroñeros frescas.
2. Configurar el espectro CT de modo que los parámetros de imagen queejecutar la función de exposición automática en Living 4.3.1 imagen se optimizan para obtener imágenes de luciferasa bacteriana. Seleccione Editar> Preferencias> Adquisición y ventanas de exposición automática. A continuación, seleccione> Valores de cocina> Exp. Tiempo (segundos) y ajuste la> Max. a 300. Por último, seleccione> Target Count (mínimo)> luminiscentes y se puso a 10.000 casos.
3. Inserte una plataforma de imagen del ratón en el Spectrum CT y la plomada en la anestesia.
4. Encienda la radiografía de bloqueo de seguridad e inicializar las IVIS.
5. Una vez que el IVIS Spectrum CT se ha inicializado, anestesiar a los ratones con 3% de isofluorano con an-8 XGI Anestesia Sistema para proporcionar seguridad humana.
6. Para determinar si es necesario realizar un análisis DLIT-μCT, pre-imagen de los ratones utilizando BLI como se ha descrito anteriormente ^1, en ​​la plataforma de imagen del ratón. Si se obtiene una señal robusta con el ratón es adecuado para la formación de imágenes DLIT. Deje el ratón anestesiado en un ratón de imagen platform después de la exploración BLI listo para DLIT-μCT.
7. Utilice el Asistente de imagen en el Salón de imagen de software 4.3.1 para configurar la exploración DLIT-μCT. El Asistente de imagen determina automáticamente el FOV, tiempo de exposición, F-stop y hurgar en la basura para el DLIT y el campo de visión, tiempo de exposición, juegos de filtros y hurgar en la basura para la proyección de imagen μCT para dar la mejor relación señal-ruido. Cuando lo indique el asistente de imagen, incluir sólo el 560, 580, 600 y 620 nm de emisión filtros y seleccionar la exploración μCT ratón. A continuación, haga clic en> Adquirir para iniciar la creación de imágenes.
8. Devuelva el ratón anestesiado a su jaula después de la impresión, retire la plataforma de imagen del ratón del Spectrum CT y desinfectar usando 1% Tri-gen. Si es necesario, reemplazar la almohadilla de espuma que el ratón se coloca en reducir al mínimo el riesgo de contaminación cruzada entre los ratones.
9. Ratones Imagen diarias hasta 8 días después de la infección (PI) con DLIT-μCT, tal como se describe en los pasos 4.1 hasta 4.8, para generar los datos de imágenes longitudinales necesarios para hacer un 4D movie de infección.
   Nota:
   • En el paso 4.7, se recomienda el uso de los 560-620 nm filtros de emisión a la imagen de bioluminiscencia bacteriana. Aunque el pico de la bioluminiscencia bacteriana es de alrededor de 485 nm, debido a la óptica de tejidos (la atenuación significativa de fotones azul / verde de tejido murino), es importante la utilización de los fotones de color naranja / rojo para reconstrucciones en 3D, ya que facilitan el cálculo de la profundidad de señal .
   • 'AUTO' ajustes de exposición en Living 4.3.1 Imagen de DLIT necesitan ser ajustados para optimizar la cantidad de fotones capturados y el tiempo máximo de imagen utilizado para cada conjunto de filtros.
   • Sólo es necesario para llevar a cabo el BLI pre-formación de imágenes se describe en el paso 4.6 cuando el investigador no está seguro de si hay una señal bioluminiscente detectable, por ejemplo cuando se utiliza un nuevo modelo de infección.

5. Reconstrucción 3D de DLIT-μCT datos de imágenes

1. Abrir Living Image software 4.3.1 y seleccione>; Examinar y abra la carpeta que contiene los archivos DLIT-μCT.
2. Abra el archivo DLIT-μCT en el Salón Image Browser, por ejemplo C. rodentium Día 1 PI haciendo clic en Load.
3. En la paleta de herramientas seleccione> Topografía superficial> ratón desnudo, ajustar el umbral, y luego haga clic en> Generar Superficie. Si la reconstrucción de la superficie se realiza correctamente un esquema superficial se mostrará en la ventana de vista 3D.
4. Para ver el scan μCT dictada en la ventana de vista 3D, oculte el contorno de superficie (Haga clic en Herramientas> ópticos 3D y unselect> Display Object superficie), o reducir la opacidad de la superficie (Haga clic en Herramientas> ópticos 3D y ajustar la> barra deslizante de opacidad).
5. Para proporcionar la localización anatómica detallada de la reconstrucción 3D DLIT es necesario para alterar los datos volumétricos 3D (μCT exploración) de modo que sólo el esqueleto del ratón es visible y que tiene el contraste óptimo. Haga clic en Herramientas> multimodalidad 3D e histograma seleccione> logarítmica, Gradient Iluminación, Calidad y Denoise. Por último, ajuste el control deslizante de histograma a la derecha y ver el 3D volumétrico de datos de cambio de contraste. Siga ajustando los datos hasta que sólo los huesos son claramente visibles. Si lo desea, cambie el color de los puntos de la función de transferencia en el histograma.
6. A continuación, seleccione> DLIT Reconstrucción 3D en la paleta de herramientas y asegúrese de que sólo el 560, 580, 600 y 620 nm conjuntos de filtros, que son necesarios para obtener imágenes de luciferasa bacteriana in vivo, han sido seleccionados. Haga clic en> Iniciar. El menú de la ventana Vista previa de datos ahora aparecerá mostrando las señales BL espectralmente filtrada desde el ratón que fue fotografiada en 2D. Estas señales se thresholded automáticamente por el software, pero se pueden ajustar manualmente, si es necesario el uso de pestañas en la parte inferior del menú. El umbral determina la intensidad de datos mínima (representado como un porcentaje de la señal máxima en la imagen), que se incluye como datos en la reconstrucción.
7. A continuación, seleccione> DLIT Reconstrucción 3D en la paleta de herramientas y compruebe que las propiedades ópticas utilizadas para la reconstrucción DLIT son correctas. Seleccione> ficha Propiedades y asegúrese de que la configuración de las propiedades del tejido se establece en tejidos de ratón, Spectrum Origen está configurado como bacterias.
8. Haga clic en> Reconstruir para llevar a cabo la reconstrucción DLIT.
9. Para generar la película en 3D DLIT-μCT click> Herramientas> 3D animación y seleccione Opciones> Preajuste Animaciones> CCW del eje Y y> Duración total> 10 segundos (25 fotogramas por segundo). Una vez que la configuración de la animación 3D son correctas, pulse> Grabar y guardar las reconstrucciones 3D DLIT-μCT como. Avi marcados con el punto experimento, el grupo y el tiempo en una carpeta separada.
   Nota:
   • Es importante cuando se realizan reconstrucciones en 3D de los datos DLIT-μCT utilizar un PC con Living 4.3.1 Imagen y paquete de servicios 1 instalado y que el PC tiene una tarjeta gráfica adecuada para ejecutar el software Multi-modalidad de imagen. Thes software puede ser descargado, y las especificaciones de GPU están contenidas en las notas de la versión ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
   • Si las reconstrucciones 3D DLIT-μCT aparezcan al revés después de ser salvado, el equipo está ejecutando una versión antigua de su controlador de gráficos y esto se puede solucionar mediante la descarga de una actualización desde el sitio web de los fabricantes.
   • En el paso 5, se presentan las opciones preferidas para generar reconstrucciones DLIT-μCT 3D. Sin embargo, hay varios puntos durante las reconstrucciones en 3D donde los parámetros que no se discuten en este protocolo se pueden modificar. Para una guía completa de las reconstrucciones 3D usando 4.3.1 viva imagen, consulte el manual de instrucciones de los fabricantes.
   • Es importante crear las reconstrucciones en 3D utilizando la misma configuración de la herramienta de imágenes multimodalidad para que sean comparables. Además deesto, al crear las reconstrucciones en 3D DLIT-μCT, es importante para hacer que los vídeos con el mismo número de cuadros por segundo y la duración total (longitud), de lo contrario el tiempo del vídeo 4D no es homogéneo.

6. Generación de una película 4D de C. Infección rodentium

1. Etiquetar claramente todas las reconstrucciones 3D DLIT-μCT con la experiencia correcta, punto en el tiempo y en grupo en una carpeta de fácil acceso.
2. Crear un nuevo archivo en Windows Live Movie Maker e inserte las reconstrucciones DLIT-μCT en orden cronológico desde el día 1 PI mediante la ficha Herramientas de la carpeta preparada en el paso 6.1.
3. Añadir títulos al inicio de cada video que describe el punto en el tiempo, por ejemplo el día 1 PI seleccionando el video DLIT-μCT apropiada y seleccionando Inicio> Añadir subtítulos. Aparecerá un cuadro de texto en la pantalla, donde se agrega la leyenda correspondiente. Ajuste el tamaño de fuente, el estilo, el color y la justificación como desired mediante fichas idénticas a Microsoft palabra en la barra de herramientas de software. Por último, mover el título a la esquina superior izquierda del video.
4. Repita el paso 7.3 para todos los videos DLIT-μCT.
5. Agregar una página de título, por ejemplo C. rodentium día infección 1-8 haciendo clic en Inicio> Título. Aparecerá un cuadro de texto en la pantalla donde se agrega el título adecuado a una diapositiva en blanco. Ajuste el tamaño de fuente, estilo, color, y justificación, según se desee utilizando fichas idénticas a Microsoft palabra en la barra de herramientas de software.
6. Guarde el proyecto como un proyecto de Movie Maker * mmp en una carpeta adecuada con el título de la película. Este paso es esencial si se quiere modificar la película.
7. Guardar la película como un archivo wmv.. Haga clic en el menú Movie Maker> Guardar película> para el ordenador.
8. Convertir el archivo creador de películas usando un conversor de archivos de. Avi u otro tipo de archivo adecuado compatible con el ordenador.
   Notas:
   • Se recomienda que el cine 4Dse generan en una PC con Windows Live Movie Maker instalado ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) y un buen programa multimedia capaz de reproducir. wmv o. avi tipos de archivos.

Resultados

La infección de ratones C57BL/6J con 5 x 10 ⁹ ufc C. rodentium es un modelo de infección bacteriana bien descrita y resulta en una infección gastrointestinal auto-limitante que los picos entre 6-8 días después de la infección y dura entre 3 a 4 semanas ^2,14. La infección se limita a la luz intestinal por el sistema inmune murino y, como consecuencia, las bacterias se desprenden continuamente en las heces. La colonización de ratones por C. rodentium se puede controlar de forma no invasiva por enumeración bacteriana directa de las heces, o de formación de imágenes de bioluminiscencia ^2,3.

Este manuscrito describe un protocolo optimizado para la realización de 3D ​​y 4D de imágenes multimodalidad de C. rodentium dentro de ratones para monitorizar la carga bacteriana y la localización durante la infección. Los resultados presentados en la Figura 1 demuestran los controles que se requieren para el éxito de formación de imágenes 4D. Antes de la infección de los ratones, es esencial para disuadirmina que el inóculo bacteriano utilizado es bioluminiscente (Figura 1A) y que, tras la alimentación forzada oral de un ratón con bioluminiscente C. rodentium, que la señal se puede observar en el estómago del animal y no en los pulmones (Figura 1B) ^16.

Además de controlar la colonización bacteriana utilizando imágenes de bioluminiscencia, es una buena práctica para cuantificar el número de bacterias en las heces; que se utiliza como una medida indirecta de la colonización bacteriana de la mucosa gastrointestinal Figura 2 demuestra la carga bacteriana típica en las heces tomada de 8 ratones C57BL6 / J. ratones que han sido infectadas con el ~ 5 x 10 ⁹ ufc ICC180 y monitoreados durante 8 días PI aumenta Colonización del día 2 PI hasta el día 6-7, donde los picos de infección en ~ 5 x 10 ¹⁰ ufc / g, que está en consonancia con los informes anteriores ^2,3,17.

Para enfatizar la importancia de la evaluaciónting de la propagación de la infección en un solo ratón, Figuras 1b y 3, así como Video 1 se han generado a partir del mismo ratón después de C. rodentium infección, como se describió anteriormente. Diario DLIT-μCT se utilizó para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón, utilizando el esqueleto como referencia anatómica. Figura 3 demuestra la reconstrucción DLIT-μCT de un ratón C57BL/6J infectado con ICC180 en 3 puntos de tiempo clave PI En día 3 PI pequeña bioluminiscente focos se puede observar en el colon, que exhiben un aumento moderado de la intensidad de bioluminiscencia por 5 días PI con poco cambio en la distribución espacial. En el día 7 PI se observó un aumento significativo en bioluminiscencia y los focos propagación bioluminiscente a través de todo el colon.

Video 1 es una recopilación de las reconstrucciones 3D DLIT-μCT de 1-8 días PI con ICC180 e ilustra C.rodentium dentro del tracto gastrointestinal proximal entre 1-2 días PI que se extiende a los dos puntos en el día 3 PI De 4-6 días PI los números de bacterias en el colon se expanden hasta alcanzar un máximo de 7 días PI donde los focos bacteriana cubre todo el colon. En el día 8 PI sólo dos focos distintas de bacterias están presentes en el colon proximal y distal. La posibilidad de ver la reconstrucción en 3D en cada momento en orden cronológico representa una poderosa herramienta para analizar las interacciones patógeno de acogida y es más fácil de interpretar que un 3D aún del mismo conjunto de datos.

Figura 1. Bioluminiscencia de imágenes 2D de A) bioluminiscente C. rodentium ICC180 inóculo y B) un ratón después de una sonda oral con 200 l del inóculo. Punta de flecha (>) ilustra bioluminiscente C. rodentium em> en el estómago.

Figura 2. C. dinámica de colonización. rodentium cuantificación de C. rodentium unidades formadoras de colonias de las heces durante 8 días PI

Figura 3. La luz difusa imagen de tomografía computarizada de μCT bioluminiscente C. infección rodentium de un ratón de un control en el día 3, 5 y 7 PI punta de flecha (>) ilustra la colonización del colon. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver el video. película 4D de la infección por C. rodentium de un ratón controlado de 1-8 días PI

Discusión

La película 4D de infección bacteriana es una herramienta útil para visualizar e interpretar grandes cantidades de datos de imágenes multimodalidad rápida y fácilmente. Esta técnica facilita el análisis detallado de cómo una infección se propaga a través de un ratón individual y se puede utilizar para investigar cómo la eliminación de host o genes bacterianos o particular, las estrategias de intervención efecto de la carga bacteriana, la distribución, y la localización durante un estudio longitudinal ^7. Estos videos también ofrecen materiales didácticos útiles y un medio de difusión de información al público.

Hay varios pasos críticos en este protocolo que podrían afectar a la calidad de los datos obtenidos a partir de imágenes DLIT-μCT y la capacidad para compilar un video 4D de la infección. La parte más importante de este protocolo es el éxito de la infección y homogénea de los ratones con C. rodentium. Es esencial que los ratones utilizados para el estudio son entre 18-20 g y que la bacrial inóculos se preparan y aproximadamente 5 x 10 ⁹ ufc, como se ha descrito previamente ^2,3. Antes de la infección de los ratones es importante comprobar que el inóculo es bioluminiscente usando el espectro CT y una vez que el inóculo se ha preparado, que debe ser homogeneizada continuamente delante de cada ratón se gavaged para asegurar que los ratones reciben dosis infecciosas similares. La imagen DLIT-μCT de los ratones se ha optimizado para que la función de exposición automática en el software 4.3.1 Imagen Living determina automáticamente los parámetros de imagen óptimos para la señal de estar bien por encima del ruido. Sin embargo, la función de exposición automática se basa en la configuración y los parámetros definidos por el usuario que necesitan ser modificados como se describe en el procedimiento. De no hacerlo, dará lugar a imágenes de baja calidad con un bajo número de fotones recogidos que no den lugar a una progresión evidente en la infección, como los ajustes de fábrica del Spectrum CT de exposición automática se programan para los tumores que expresan imágenesla luciferasa de luciérnaga. Reconstrucciones realizaron con 560 a 620 nm dan la mejor concordancia entre los datos simulados y medidos y, por lo tanto, son los datos más fiables para incluir en la reconstrucción.

Una limitación al uso de DLIT-μCT es que la radiación ionizante de la exploración μCT provoca daño de la radiación subletal que es acumulado en un estudio longitudinal ^18. Exposición a la radiación subletal puede debilitar la respuesta inmune, provocar daños en el ADN, y la apoptosis en los órganos internos ^19. En última instancia, daños por radiación subletal acumulada puede causar la muerte si la DL _50/30 para la radiación ionizante se excede, que está entre 5 y 7 Gy dependiendo de la cepa de ratón y la edad de los ratones utiliza ^18,20,21. Aunque algunos de los daños molecular de las radiaciones ionizantes puede curar, ya que el principio general es el de estimar la dosis de forma conservadora, esto no suele ser contabilizada en la planificación del estudio. En cambio, el objetivo es mantenerse lo más below estos límites como sea posible al tiempo que el cumplimiento de los objetivos del estudio. Esto es particularmente importante en este estudio debido a la respuesta inmune normal a la infección, la frecuencia de formación de imágenes, y el hecho de que transgénico, inmuno-compuesto, o muy infectado animales pueden ser más susceptibles a la radiación ionizante.

Al planificar el experimento para generar una película 4D de la infección, es importante tener en cuenta la longitud del experimento, el número de μCT escanea requerido durante este periodo y la DL _50/30 para la radiación ionizante para la cepa de ratón que está siendo utilizado. Otra limitación potencial de DLIT-μCT es la fuerza de la expresión del indicador dentro de la cepa bacteriana utilizada, ya que esto afectará límites de detección bacterianas y los tiempos de formación de imágenes. Es muy recomendable que los investigadores utilizan validados cepas bacterianas que son totalmente virulento, pero optimizado para máxima operón lux expresión, como se ha demostrado previamente para BLI2,3.

Una advertencia para el diseño actual de la formación de imágenes 4D es que cada película se compone de exploraciones DLIT-μCT individuales que tienen diferente escala de fotones. Esto puede hacer que las imágenes difíciles de interpretar si los cambios en la localización de la BL focos, o su intensidad son sutiles, o si hay un foco BL intensa rodeada por múltiples focos débil. Por lo tanto, para visualizaciones longitudinales, es importante para mantener las barras de color consistente a través de los puntos de tiempo.

El concepto de una película 4D de la infección se puede aplicar a cualquier patógeno bacteriano convenientemente etiquetado. El desarrollo futuro de esta técnica tendrá como objetivo utilizar la tomografía de imágenes de fluorescencia (FLIT), así como DLIT para facilitar la investigación de las respuestas del huésped a la infección usando una combinación de patógenos bacterianos y bioluminiscentes inyectables sondas fluorescentes cerca de infrarrojos para investigar las respuestas del huésped a la infección. Además de esto, en este protocolo sólodescriben el uso de bacterias bioluminiscentes para crear películas 4D de la infección. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario el uso de bacterias marcadas fluorescentes, por ejemplo, etiquetado con IRFP, de modo que el reportero bioluminiscencia se puede utilizar para la investigación genética del huésped durante la infección. Es importante destacar que el uso de imágenes multimodalidad que combina DLIT / FLIT-μCT nos permitirá investigar de manera no invasiva varios parámetros durante una infección bacteriana, lo que contribuirá de manera significativa a la reducción, refinamiento y reemplazo del uso de animales en la investigación científica como se indica en la iniciativa del NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44