La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Resumen

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

Resumen

Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo se ha convertido en una herramienta poderosa en el estudio de muchos procesos biológicos a nivel de una sola célula. En particular, las películas que representan la dependencia temporal de la expresión génica dar una idea de la dinámica de su regulación, sin embargo, hay muchos desafíos técnicos para la obtención y el análisis de las películas de fluorescencia de las células individuales. Se describe aquí un protocolo simple utilizando un dispositivo de cultivo de microfluidos disponibles comercialmente para generar dichos datos, y una interfaz basada en MATLAB gráfica de usuario (GUI) basada en paquete de software para cuantificar las imágenes de fluorescencia. Los segmentos de software y células pistas, permite al usuario vicario visualmente errores en los datos, y asigna automáticamente linaje y tiempos de división. La interfaz gráfica de usuario analiza aún más la serie de tiempo para producir trazas de células enteras, así como sus derivados primero y segundo tiempo. Mientras que el software fue diseñado para S. cerevisiae, su modularidad y versatilidad deben permitir que to Servir como plataforma para el estudio de otros tipos de células, con algunas modificaciones.

Introducción

Análisis individual de células de la expresión génica ha impulsado nuestra comprensión de muchos aspectos de la regulación de genes. Instantáneas estáticas de expresión reportero fluorescente utilizando citometría de flujo o microscopía proporcionan información útil sobre la distribución de la expresión de una sola célula, pero carecen de la historia y la evolución de los datos de series de tiempo requeridos para informar directamente dinámica de la expresión de genes. Fluorescencia microscopía de lapso de tiempo presenta un medio para obtener ambas medidas unicelulares y su historia. Diversas técnicas experimentales y analíticos se han desarrollado para obtener y cuantificar las películas de la expresión del indicador fluorescente, impartiendo así conocimientos sobre las características de regulación génica (véase ¹ para una revisión), como la variación de célula a célula de ^2,3, la formación persister bacteriana ^4, la transcripción iniciación y elongación de ^5, transcripción estallido ^6,7, la dependencia del ciclo celular ^8,9, y la heredabilidad ^10. Sin embargo, obtaining series de tiempo de fluorescencia de una sola célula de calidad implica retos técnicos significativos en el cultivo de una monocapa de células en un entorno controlable y en la cuantificación de alto rendimiento de las películas de fluorescencia adquiridos. Aquí se describe un procedimiento para obtener y analizar películas de fluorescencia de S. cerevisiae sin experiencia requerida en la cultura fabricación dispositivo celular o en el desarrollo de software (Figura 1).

En primer lugar, vamos a detallar un protocolo de ejemplo para generar fluorescencia películas de series de tiempo para la levadura en ciernes que expresa una o más reporteros fluorescentes. Aunque cámaras de cultivo de microfluidos personalizadas se han construido y empleado con éxito previamente ^11-13, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente de CellAsic (Hayward, CA). El sistema confina a las células de crecimiento monocapa y permite el control continuo de la perfusión del medio ambiente. El protocolo de microscopía que presentamos es un simple medio para obtener fluorescpelículas rencia de levadura en ciernes, pero cualquier modificación del protocolo experimental (un dispositivo de cultivo a medida, las condiciones de los medios de comunicación alternativos, etc.) que producen datos de la película de fluorescencia similares de células individuales de levadura pueden ser sustituidos.

A continuación, presentamos el análisis de las películas mediante una interfaz gráfica de usuario (GUI) basada en software de MATLAB (Mathworks, Natick, MA), conocido como el GUI para Rapid Analysis of Time Series fluorescencia (INJERTOS), para extraer los datos de series de tiempo para las células individuales. INJERTOS tiene características similares al versátil software de código abierto paquete identificador de celda ¹⁴ en la segmentación y seguimiento de las células y en la extracción de la intensidad de fluorescencia y la información geométrica. Sin embargo, los injertos ofrece importantes características adicionales. En primer lugar, ofrece una fácil edición interactiva de segmentación y seguimiento de los resultados para comprobar la precisión de datos, en lugar de gating estadística de valores atípicos huellas región tras el análisis. Por otra parte, se extiende el análisis a automatically designado linaje y puntos del ciclo celular de interés de la levadura en ciernes. La determinación de cuando la madre y la hija se dividen para formar dos regiones independientes de células es crucial para la determinación de células enteras (incluyendo cualquier madre brote conectado) mediciones en todo el ciclo celular ^8. La suite consta de tres módulos para realizar estas tareas. Las primeras regiones celulares segmentos basados ​​en el contraste entre las imágenes de campo claro enfocadas y desenfocadas, y permite al usuario definir y visualmente comprobar los parámetros de segmentación. El segundo pistas (. Utilizando Blair y ejecución MATLAB del Crocker et al IDL rutina de Dufresne, disponible en: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) y medidas de las regiones celulares a través del tiempo; asigna automáticamente linajes, y permite la inspección visual y corrección de errores. Una sencilla interfaz gráfica de usuario trazado se incluye a las propiedades de una sola célula de la consulta. El tercer módulo atribuye la yema aparición y división times, y da salida a datos de series temporales de células enteras, así como sus derivados primero y segundo de tiempo (como se discute en ^9). El módulo de análisis da salida a los datos como un archivo de texto delimitado por espacios para estudio posterior en el software estadístico de elección. Por lo tanto, el paquete permite al usuario extraer datos de series temporales de alta calidad a través de una interfaz gráfica. Hemos utilizado este método para estimar las tasas de transcripción en tiempo real en células de levadura en ciernes individuales como una función del ciclo celular ^9. Mientras que los módulos han sido optimizados para la levadura en ciernes, los parámetros o, si es necesario, el código libremente disponible se puede adaptar para otros organismos y tipos de imágenes. Segmentación, seguimiento, y el linaje algoritmos de asignación pueden ser específicos de los tipos de imagen afectados y el organismo en cuestión. Los algoritmos existentes podrían ser reemplazados, pero todavía conservan la interfaz gráfica de usuario que permite la inspección visual fácil de usar y corrección de errores de segmentación y de seguimiento que invariablemente ocupantesr con cualquier algoritmo.

Protocolo

1. Obtener fluorescentes Microscopía Películas de células individuales de levadura que crece en una Cámara Microfluidic

1. Inocular 1 ml de medio SC (medios definidos sintéticos con 2% de glucosa y el complemento completo de aminoácidos) con células de una placa recién creciente, y se incuba el cultivo durante la noche ~ 16 horas sobre un tambor de rodillo a 30 ° C. Preparar la cultura de modo que la final OD _{600 nm} es de ~ 0,1 para el crecimiento en fase logarítmica temprana.
2. Diluir el cultivo iniciador según sea necesario y volver a crecer 1 ml en un tubo de ensayo fresco un adicional de 6-8 horas a OD _{600 nm} = 0,1. Esto proporciona a las células que crecen en un nutriente rico en estado estacionario a una densidad adecuada para la carga en el dispositivo de microfluidos. (Por otra parte, reemplace los pasos 1.1 a 1.2 con el procedimiento necesario para preparar las células según sea necesario para el experimento.)
3. Prepare una placa de cultivo de microfluidos Y04C de CellAsic: quitar la solución de envío, enjuague los pozos con agua estéril, y con el flujo del sistema de perfusión ONIXagua a través de pozos de 1-6 a 6 psi durante 5 min para eliminar los canales. Entonces, el flujo de la carga así 8 en 6 psi durante 10 seg (el canal de carga tiene tasas de flujo mucho más altos y debe lavarse por separado).
4. Eliminar el agua de todos los pozos y reemplazar con 250 l SC en la entrada de los pozos de 1-6 y 50 l de la cultura desde el paso 1.2 en la celda de carga y 8. (Como alternativa, coloque el soporte deseado en los pozos de entrada 1-6 para los experimentos que requieren conmutación entre diferentes condiciones.)
5. Sellar el colector de ONIX a la placa, y comenzar los canales de cebado y la cámara de cultivo por que fluye desde la entrada de pozos 1-6 a 6 psi durante 2 min seguido de al menos 5 min a 6 psi de sólo la entrada así que sostienen los medios de comunicación de partida para la experimento. Flujo esto continuamente hasta el paso 1.7.
6. Preparar el microscopio para el experimento. Utilizamos un microscopio Axio Observer.Z1 campo amplio Zeiss con una cámara II EMCCD retroiluminado Cascade (Fotometría, Tucson, AZ) y un lumen 200 del arco de halogenuros metálicoslámpara (Prior Scientific, Rockland, MA) para la excitación de fluorescencia atenuada a 10% para evitar photobleaching. Para minimizar el tiempo de conexión necesario para adquirir en múltiples canales fluorescentes, juntamos un solo cubo de filtro de triple banda de paso dicroica de filtros de excitación / emisión adecuados para CFP, YFP y RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; set 89006) en conjunto, de respuesta rápida ruedas de filtros externos (productos electrónicos Ludl, Novato, CA).
7. Ponga unas gotas de líquido de inmersión en el objetivo (si es necesario, utilizamos un Plan-Apochromat 63X/1.40 DIC Oil Zeiss), y monte el dispositivo de microfluidos con seguridad en la platina del microscopio invertido. Asegurar la placa no se desplaza en absoluto en la etapa durante todo el experimento mejora el seguimiento celular durante el análisis de datos. Nosotros simplemente grabamos la placa a la fase de montaje para evitar su desplazamiento.
8. Centrarse en el tercero de la izquierda de la primera cámara de cultivo (donde la altura de la cámara es más pequeña) con una de las páginas integradas de posiciónmarcadores ción. Apagar el flujo desde la entrada de los medios de comunicación así, y el flujo de la celda de carga así 8 a 6 psi en 5 seg ráfagas. Mueva el escenario para mirar alrededor de la cámara de cultivo de células. Aumentar el tiempo de carga de flujo y presión hasta conseguir la densidad celular deseada, pero evitar la sobrecarga y la obstrucción de la barrera más a la izquierda en medio fresco entra en la cámara.
9. Comience que fluye desde la entrada de los medios de comunicación así que contiene los medios de comunicación a partir de 6 psi.
10. En MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) o de otro tipo de automatización de microscopia y software de control, la configuración de una adquisición multidimensional para tomar varias imágenes a múltiples posiciones de fase a través del tiempo. Establecer el número de e intervalo entre los puntos de tiempo. Seleccione varias posiciones etapas con ~ 10 células cada uno (más será saturar rápidamente). Por lo general utilizan intervalos de 5 minutos y la imagen de hasta 16 posiciones, que requieren cada ~ 11 segundos para que la adquisición en cada momento.
11. Configuración de la adquisición de manera que en cada posición de fase en cada punto ª vezPrograma e: centrarse en el campo claro de luz transmitida (BF) imagen utilizando la MetaMorph método integrado autofocus (la aplicación del enfoque automático como un diario personalizado escrito al comienzo de cada puesto de fase proporciona un mayor control sobre la precisión del enfoque); adquirir el BF imagen a 1 m hasta el plano focal (fp); adquirir una imagen BF fuera de foco (BFOOF) a -4 m al fp (use revistas custom-written para cambiar el enfoque según sea necesario entre las imágenes), y adquieren una escala de grises imagen para cada indicador fluorescente en la fp con los ajustes optimizados para la adquisición rápida de photobleaching mínimo.
12. Si es necesario, obtener imágenes de corrección de fondo y el sombreado para cada indicador fluorescente en una zona de la cámara de cultivo sin células.
13. Preparar el programa de flujo para el experimento en el software de control de ONIX. Al mismo tiempo iniciar el programa de adquisición de MetaMorph y el programa de flujo en el software de control de ONIX.
14. Al final del experimento, sin corregirincluso fondo y el sombreado en las imágenes fluorescentes (si es necesario), y combinar opcionalmente los archivos tif. para cada canal de la imagen en cada posición en una etapa. archivo de película pcs (por ejemplo, crear BF, BFOOF, PPC, YFP y RFP películas para la posición 1 ).

2. Formato y segmento de datos para el seguimiento mediante la FormatData GUI en MATLAB (Figura 2)

1. Ejecute el archivo FormatData.m en MATLAB para abrir la interfaz gráfica de usuario de entrada de datos. En la parte superior, especifique o busque la carpeta que contiene los archivos de imagen para establecer el directorio de datos, y luego usar la interfaz gráfica de usuario para especificar los tipos de datos y archivos de imagen grabados en el experimento.
2. A la derecha, seleccione el botón de radio junto a "Time-lapse" para indicar qué tipo de análisis a realizar. "Time-lapse" tratará la serie de imágenes como una serie de tiempo (por ejemplo, una película de células que crecen en una cámara de microfluidos). "Static" tratará cada serie de imágenes como un conjunto de instantáneas tomadas de una población (por ejemplo, varias imágenes tomadas en diferentesrentes posiciones en una sola muestra de diapositivas). En esta versión injertos, los datos de lapso de tiempo de múltiples posiciones pueden ser procesados, sino como un archivo separado para cada posición (ver paso 2,14).
3. Marque la casilla para el registro de imagen para corregir movimientos escénicos imprecisos desplazando cada imagen en las películas para minimizar el movimiento aparente de células dentro del marco. Recomendamos encarecidamente este, ya que mejora en gran medida el seguimiento (reduciendo curación manual de pistas más adelante), pero a añadir, "ruido blanco" valores de los píxeles aleatorios para rellenar que las imágenes han sido desplazados en la frontera. También podría ser seleccionado después de ver imágenes BF segmentados en el paso 2.7 o en cualquier punto hasta el paso 2.13.
4. Marque la casilla "Campo Claro" en "Canales de Datos" del panel. Haga clic en "Seleccionar" para el derecho de cargar las imágenes BF. Para archivos *. TIF, seleccionar todas las imágenes BF correspondientes a una sola película manteniendo pulsada la tecla Shift mientras selecciona, a continuación, haga clic en "Open". Para los archivos de STK *., Sólo tienes que seleccionar la pila BF de interés. Si las imágenes son éxitoplenamente reconocido, los nombres de los archivos se mostrarán en el menú que aparece a la derecha en el panel de "Datos reconocidos". . * Para archivos TIF, asegúrese de que los nombres de los archivos aparecen en el orden correcto (guardar archivos con nombres secuenciales durante la adquisición - BF_t001, etc.)
5. Marque la casilla "Campo Claro (fuera de foco)" caja y utilice el botón "Select" como en el paso 2.4 para cargar los archivos BFOOF, que se enumeran en la ventana emergente a la derecha. (BFOOF obtiene como BF micras -4 relativa a la fp en 63X segmentos también.)
6. Marque la casilla "Mask celular". En la "Fuente Mask" del panel, seleccione el botón de radio junto a "Segmento BF". Pulse el botón "Parámetros" para abrir la GUI de segmentación. (También puede seleccionar una película máscara pre-segmentados, seleccione el botón de opción situado junto al botón "Select Mask Archivo", al pulsar la última, y ​​la selección de la película como en el paso 2.4. En este caso, no se necesita una película BFOOF y puede ir al paso 2.8.)
7. Ajuste los distintos parámetros de segmentación (las descripciones de cada uno puede vered pulsando "Descripción de parámetros"), y poner a prueba la calidad de la segmentación, haga clic en "Test" (Figura 3). Éxito regiones segmentadas serán verdes con bordes magenta. Asegúrese de utilizar el control deslizante para comprobar múltiples momentos de la película. Cuando la segmentación es satisfactorio, seleccione "Hecho" para devolver los parámetros de segmentación para la FormatData GUI.
8. Marque la casilla "Imágenes de color". Introduzca el nombre del color para el primer canal de imagen fluorescente en el área de edición, y luego pulse "Agregar y seleccione" para cargar los archivos de color como en el paso 2.4. El nombre del color se agrega al cuadro de lista de la izquierda, y los nombres de archivo se agrega a la tabla de la derecha. Si se comete un error en la carga de los archivos de colores, seleccione el nombre del color en el cuadro de lista de la izquierda y haga clic en "Eliminar Color" para eliminar los archivos. Repita el procedimiento para cada canal de color.
9. Si máscaras subregión adicionales basados ​​en uno de los colores fluorescentes (por ejemplo, la etiqueta fluorescente núcleo → nuclse desean oído máscara región), marque la casilla "Mask Color". Si no es así, vaya al paso 2.12. En el "color de la máscara de origen" del panel, escriba el nombre de la máscara de sub-región en el área de edición. Elija un color en el menú emergente en el "Color Mask Fuente" del panel (requiere el color que ha sido añadido en el paso 6) y empuje "Parámetros" para abrir un umbral de prueba GUI.
10. Pulse el botón "Auto-umbral" para determinar automáticamente el umbral por el método de Otsu ^15, y la imagen se destacan las áreas conservadas por encima del umbral (Figura 4). El umbral se puede ajustar manualmente mediante el cuadro de edición. Utilice la barra de desplazamiento para confirmar el umbral es adecuado para todos los puntos temporales. Una vez satisfecho, empuje "Done" para volver al umbral de la FormatData GUI.
11. Haga click en "Agregar y segmentos" para generar la máscara de sub-región utilizando el módulo umbral aplicado a las imágenes en color seleccionados. El nombre de la máscara de color y de origen se muestran en la tabla a la izquierda, con la r relevanteecognized nombres de archivo que aparecen en la tabla de la derecha. (Como alternativa, presione "Agregar y seleccione" para cargar los archivos de máscara de sub-región pre-hechos.)
12. En la parte inferior, especifique o busque la carpeta que desee que se utilizará como directorio de guardado.
13. Pulse el botón "Formato de datos" para leer los archivos de imagen (utilizando el código tiffread2.m desarrollado por Francois Nedelec, disponible en: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), el proceso de los datos, y crear un * archivo. esterilla en la carpeta especificada. Este archivo servirá como entrada a la ProcessTimeSeries GUI.
14. Repita el paso 2.4 hasta 2.13 para el conjunto de películas para cada posición de fase.

3. Las células de pista y linajes a través del tiempo con ProcessTimeSeries GUI y Curate Identificación y Asignación de linaje (Figura 5)

1. Ejecute el archivo ProcessTimeSeries.m en MATLAB para abrir la GUI de seguimiento. Ajuste los siguientes parámetros después de abrir elGUI:
   • "Altura de la cámara" ("File I / O" del panel, arriba a la izquierda) - esto indica la altura de la cámara en la que las células se encuentran atrapados. Se utiliza como una restricción en la aproximación de volumen de la célula como un elipsoide en 3D basado en el eje mayor y menor de la región celular como en ^8.
   • "M / píxel" (panel de "E / S de archivo") - el factor de conversión para calibrar píxeles a distancia micras en las imágenes para el área de la sección transversal y el volumen se pueden calcular de ² micras y ³ micras, respectivamente.
   • "Panel de Filtros" (por debajo de "File I / O" panel) - conjunto mínimo y máximo de los parámetros para filtrar regiones basura de la máscara: "Area" - área de la región en píxeles; "Eclesiastés" - factor de excentricidad, más circular como → 0 , "San Francisco" - factor de forma, más circular como → 1.
2. Haga clic en "Cargar imágenes" en el panel "E / S de archivo" y seleccione el archivo de datos *. Mat de salida interés por el FormatData GUI. La máscara de la región (y cualquier máscara sub-región) se aplica a cada canal de color, Y se hacen una serie de diferentes medidas (Tabla 1). El archivo de datos se guarda. (Si va a cargar un archivo en ProcessTimeSeries de una sesión anterior, se le preguntará si el análisis debe reiniciarse desde el principio PRECAUCIÓN:.. Esto borrará cualquier curación pista ya terminado y el tratamiento de los datos como si fuera recién salido del FormatData GUI Si accidentalmente reiniciado, rápidamente pulse Ctrl + C en la ventana de comandos de MATLAB para evitar que el previamente curada * archivo. esterilla que se sobrescriba.)
3. A continuación, un seguimiento de las células. En las "células de pista" panel (al lado de la "filtros" panel), ajuste los siguientes parámetros:
   • "Max Desplazamiento" - la distancia máxima en píxeles de una célula puede viajar entre las imágenes adyacentes antes de ser etiquetado como una célula diferente. Desplazamiento más alta significa que el algoritmo puede dar cuenta de células que se mueven más, sino que también aumenta la complejidad de hacer coincidir las regiones celulares en multitudes. Empezamos a las 12 y disminuir si se produce un error en el seguimiento (véase el paso 30.4).
   • "Longitud mínima" - número mínimo de apariciones de una célula de seguimiento a considerar una serie de datos válido. Utilizamos 1 para evitar la eliminación de cualquier rastro reales, pero esto se puede aumentar si la segmentación como resultado efímeros, rastros región espurios.
   • "Memory Frame" - número máximo de fotogramas consecutivos de una región de células puede desaparecer y se le dará el mismo ID cuando se devuelve. Si desaparece por más de "Memory Frame", se le dará un nuevo ID a su regreso. Utilizamos 2 para permitir que las regiones se puede perder por la segmentación de 2 cuadros antes de regresar.
4. Haga clic en "células de las vías" para rastrear las regiones de un cuadro a otro utilizando la región centroides (Blair y Dufresne aplicación MATLAB de Crocker, Grier, y en las semanas rutina IDL, disponible en: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , para asignar los linajes de los brotes nuevos que aparecen, y para guardar los datos. Linajes se asignan automáticamente por minimizing distancias entre brotes putativos y madres potenciales en cada fotograma. (Si aparece un error en la ventana de comandos de MATLAB debido a las "difíciles" combinatoria, disminuyen "Max Desplazamiento" y repita el seguimiento.) Modificar parámetros en las ventanas emergentes que sea necesario para sus datos.
5. Curate regiones mal segmentados y errores en las tareas de identificación o linaje que utilizan las distintas herramientas de la GUI o teclas de acceso directo (que se muestra en una ventana emergente, pulse el botón de arriba "Selección de información celular" panel).
   • Deslizante, "Prev imagen", "Next Image" (Ctrl + izquierda / derecha) - usar para mostrar y desplazarse entre los marcos de la serie de imágenes.
   • "# Imagen" - muestra el número de fotograma de la imagen actual en los ejes izquierdo y derecho. Mueva a un marco especificado por escribir su número en la derecha "Imagen #" cuadro de edición.
   • "Delta frame" - muestra la diferencia en el número de bastidor entre los ejes derecho e izquierdo (Δ = derecha - izquierda).
   • "Ocultar texto" (Ctrl + T) - alterna entre mostrar las identificaciones de células enlos ejes correctos o no.
   • "Ocultar etiquetas" (Ctrl + L) - Cambia entre mostrar las identificaciones de células en los ejes de la izquierda o no.
   • "Mask" menú emergente - elegir entre mostrar ninguna máscara, la máscara de celular, o cualquier sub-máscaras definidas por el usuario para su visualización en el panel izquierdo.
   • Menú emergente "Overlay" (Ctrl +1-9) - elegir mostrar BF y capas de color en el cuadro izquierdo. Mostrar BF es el único que cambia la capa BF o desactivarse en ambos ejes. Alternar entre la pantalla o no, seleccionando el nombre de superposición en el menú de nuevo ("*" denota aparece superpuesta). Ctrl +1 alterna BF superposición, con 2-9 alternar las superposiciones de colores en orden.
   • "Definir colores" - utilizan para determinar el color de superposición de pantalla. Una ventana emergente le consulta qué canal de fluorescencia para ajustar y, a continuación, la paleta de colores aparecerá para la definición de usuario.
   • "Modificar las Regiones y las pistas" del panel - estos controles efectuar cambios en la máscara región celular y la información de seguimiento:
     • "Actualización pistas" (Ctrl + U) - Se usa para volverasignar identificadores de celda. Si hay células se seleccionan en ejes de la derecha, la interfaz gráfica de usuario le pedirá un documento de identidad celular a cambio. Cuando se cambia el ID X a Y, todas las futuras instancias de X serán cambiados a Y, y todas las instancias futuras de la Y actual, se cambiará a X. (De vez en cuando una célula se alternar entre 2 identificaciones, repetidamente. Este se debe al seguimiento tratando de acomodar múltiples IDs en una región oversegmented en lugar de un error en la función de identificación de actualización.) células múltiples se pueden seleccionar y modificar sus documentos de identidad a la vez, pero asegúrese de dar a cada uno un identificador único. Para asignar una región a un ID que no existe en el archivo actual, escriba "0" y se le generará una. Utilice Ctrl + W para cambiar los identificadores de dos celdas resaltadas.
     • "Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - se usa para eliminar la celda o celdas múltiples regiones en el actual marco de ejes derecha. (Si no se seleccionan las células, pedirá el nombre.) Para eliminar permanentemente todas las instancias de una traza ID, marque la casilla al lado del Delete botón de pistas seleccionadas (texto cambiará a "Delete All"). Esto es útil para deshacerse de las regiones basura persistentes, pero primero compruebe marcos futuros para asegurarse de que el ID no cambia a una célula válida o región del brote.
     • "Regiones Merge" (Ctrl + A o M) - suaviza y combina regiones celulares. Haga clic en una celda o celdas de los ejes de la derecha para seleccionar (región se vuelve rojo si se ha seleccionado). La fusión en una región morfológicamente cerrar para rellenar grietas o pequeños trozos que faltan utilizando un elemento en forma de disco. La fusión de dos o más regiones cercanas combinará en una sola región y dar el ID más bajo para la nueva región. Esto es útil para las regiones más de-segmentados (a menudo cuando las células tienen grandes vacuolas).
     • "Dibujar región" - utilizar el ratón para dibujar una región en los ejes de la derecha donde se desee y haga doble clic para terminar. Proporcionar un ID único no presente en el conjunto de datos (entre 1 y 65535). Cancelar pulsando delete en el teclado.
   • "Seguimiento de Lineage" Panel - después de seguimiento,asignaciones linaje se generan automáticamente. Cuando aparecen nuevas regiones ID, el nuevo identificador de celda aparece en color rosa y una línea roja que se señala a la región de la madre. Nuevas regiones demasiado grande para ser brotes o demasiado lejos de madres potenciales aparecen en verde y se les asigna un ID madre de "NaN" ("no es un número", véase el cuadro 2). Regiones existentes en el primer punto de tiempo tienen un ID de madre de "0". Para fijar las asignaciones individuales, introduzca la madre y el ID de brote en los campos de edición de texto y haga clic en "Fix". Para borrar la madre de una celda, escriba "0" como su madre. Un método más rápido es seleccionar dos regiones de la imagen de la derecha y pulse Ctrl + F. Esto asignará automáticamente la región más como la madre y la región más reciente como la hija, mientras que borra todas las asignaciones madre ya existentes para la célula hija. PRECAUCIÓN: Al hacer clic en "Calcular Linajes" en cualquier momento para volver a calcular todas las asignaciones linaje, incluidos los que el usuario ha comisariado previamente.
   • "Información de la celda seleccionada" Panel - "Get Menfo "mostrará algunas de las mediciones de las regiones seleccionadas en los ejes de la derecha." Medidas ... "le permite al usuario determinar qué medidas se muestran (al igual que definir la lista por defecto para otras operaciones, tales como" Exportar datos "). Puede ser utilizado para determinar los ID y linajes (por ejemplo, si la celda X tiene un brote en el tiempo t, es muy probable que no tenga otro brote en el tiempo t + 5 min) correctas.
   • "Save Changes" (Ctrl + S) - actualiza el archivo * colchoneta para reflejar los cambios del usuario.. Utiliza con frecuencia (no hay función deshacer)!
   • "Generar Parcelas" - abre el GeneratePlots GUI. Se utiliza para trazar rápidamente la información variable seleccionada y cálculos simples para las regiones de una sola célula resaltados en los ejes de la derecha de la ProcessTimeSeries interfaz gráfica de usuario, su media, o la media de todas las regiones en cada trama. Esta GUI se puede calcular primero derivados ásperas, pero asegúrese de especificar el intervalo de tiempo correcto en la parte superior izquierda. Parcelas puede ser la salida a una cifra de ahorro pulsando "Generar Figura".
6. Para curar correctamente los datos: fusionar las regiones oversegmented; eliminar cualquier región no captura toda la celda, asegúrese relaciones madre-brote estén correctamente asignados (una línea roja aparece entre ellos en el momento del brote de emergencia, cuando el ID raíz es de color rosa, ver Tabla 2), y eliminar los IDs verdes mediante la fijación de la ID, la asignación de la región de una madre, la asignación de ninguna madre ("0"), o borrando la región. Bud datos se añadirán a la de la madre durante el análisis final, así que no fusionar una región del brote a su madre (que dará lugar a la estimación del volumen inexacta).
7. Inspeccione visualmente los datos de cada cuadro hasta el último momento de su interés, pero no se requiere de toda la serie temporal si no utiliza los marcos posteriores.
8. Asegúrese de guardar los cambios.
9. Repita los pasos 3.1 a 3.7 para el archivo *. Esterilla para cada posición de la etapa.

4. Exportación de datos para el análisis

1. Para exportar simplemente mediciones región primas para cada célula a través de time, impulsar "Exportar datos". Las medidas de interés se pueden seleccionar en la interfaz gráfica de usuario que se abre, y se emitirán en un espacio delimitado por *. Txt con los nombres de variables como encabezados de columna.
2. Para el análisis de las series temporales de células enteras a través del tiempo, calcular la información del ciclo celular, y tomar derivados, presione "Análisis de Series de Tiempo". Se abrirá una ventana que permite la selección de las medidas de interés y las aportaciones de los parámetros de análisis (Figura 6).
3. Introduzca el último punto temporal comisariada en el GUI (todos los fotogramas siguientes serán ignoradas). Los parámetros de asignación de suavizado y del ciclo celular por defecto funcionan bien para nuestra haploide y diploide cepas toman imágenes en intervalos de 5 min, pero éstos pueden necesitar modificarse para obtener los mejores resultados. (Compruebe que los valores de los parámetros son apropiados mediante la determinación manual del tiempo de florecimiento y división para un conjunto de datos de prueba y comparando con el rendimiento del algoritmo automatizado.)
4. Cuando se establecen todos los parámetros, empuje "Analizar" para:
   1. Contrastruct matrices para cada medición en bruto y restar el fondo (medida como la intensidad media de la zona de no-celular de la primera trama en cada película fluorescente, o puede ser especificado para tener en cuenta la autofluorescencia celular promedio por píxel).
   2. Montar una spline suavizado para las mediciones seleccionadas para eliminar el ruido de medición de alta frecuencia (como se discute en ^9).
   3. Determinar automáticamente aparición del brote y los tiempos de división celular para cada celda en función de los cambios en la pendiente de la serie de tiempo de volumen como se comentó en la ^9. Las mediciones brote se sumarán a las mediciones de la madre entre la emergencia y la división de cada ciclo para una serie temporal de célula completa contigua. Una progresión del ciclo celular normalizada se calculará también que van de 0 a 2 de la división a la división.
   4. Coloque una suavización spline tomar estables 1 ^ª y 2 derivados ^nd de las medidas seleccionadas. (Para el propósito de derivados bien definidos, series de tiempose hacen continua a través de la división por desplazamiento de datos para el ciclo celular siguiente para cumplir el criterio de valoración para el ciclo anterior.)
   5. Salida de series temporales diferenciadas series temporales suavizadas prima y para todas las regiones, y suavizada célula completa, continua y como una matriz para cada medición. El primer elemento es un índice de color para la sustracción del fondo, el resto de la primera fila contiene los ID de celda, el resto de la primera columna es el número de trama, y ​​los elementos restantes mantenga la serie de tiempo para cada célula en una columna con cada fila correspondiente a la trama en la primera columna. Una matriz similar de series de tiempo de progresión del ciclo celular y la información de Lineage también saldrá. El array "LineageArray" contiene una tabla donde cada fila representa una relación madre-brote y la primera a quinta columnas son ID madre, bud ID, marco de la primera región del brote, marco en ciernes estimado, y el marco de la división estimado. Los datos se exportan a un archivo *. Esterilla (archivo de datos MATLAB).

Resultados

Un experimento llevado a cabo con éxito y analizado producirá series de tiempo sobre todo continua de células enteras individuales con realismo asignado aparición del brote y los tiempos de división. Como un ejemplo, se realizó el protocolo anterior con una cepa de levadura haploide que expresa una copia integrada de la proteína fluorescente Cerulean (PPC) impulsado por el promotor ADH1 constitutivo de observar cómo el crecimiento y la expresión global pueden variar con el tiempo en las célul...

Discusión

El protocolo anterior se describe un método simple para obtener y analizar datos de series temporales de fluorescencia con experiencia limitada en la microfluídica o en el desarrollo de software. Esto permite obtener películas a intervalos de fluorescencia de las células individuales de levadura, extracto de tamaño de la celda correspondiente y las mediciones de expresión; asignaciones linaje cura y seguimiento, y analizar el comportamiento de las células en su conjunto a través del tiempo mediante un dispositiv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit