Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

Resumen

Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

Resumen

La formación de conexiones funcionales en una red neuronal en desarrollo está influido por las señales extrínsecas. El crecimiento de axones de las neuronas en desarrollo está sujeto a las señales químicas y mecánicas, y los mecanismos por los que se detecta y responde a señales mecánicas, son poco conocidos. La elucidación del papel de las fuerzas en la maduración de las células permitirá el diseño de los andamios que puede promover la adhesión celular y del citoesqueleto de acoplamiento al sustrato, y por lo tanto mejorar la capacidad de los diferentes tipos neuronales para regenerarse después de una lesión.

Aquí se describe un método para aplicar medidas de espectroscopia de fuerza simultáneas durante la lesión celular inducida por láser. Medimos liberación de la tensión en el axón parcialmente lesionada por el seguimiento interferométrico simultánea de una sonda atrapada ópticamente adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental detecta la liberación de la tensión con la sensibilidad picoNewton, y la dinámica de la liberación de la tensión enresolución de tiempo de milisegundos. Por lo tanto, ofrece un método de alta resolución para estudiar cómo el acoplamiento mecánico entre las células y los sustratos puede ser modulada por el tratamiento farmacológico y / o por las propiedades mecánicas distintas del sustrato.

Introducción

Microscopía óptica es uno de los sistema de imagen menos invasivo disponible para observar las células vivas. Con la explotación de efectos tales como la presión de la radiación (como en pinzas ópticas ^1), o flujo de fotones de alta energía (como en láser disector ^2), esta tecnología se extendió a nano-manipulación. El sistema de imagen óptica proporciona un control preciso de visualizar y manipular dianas celulares sub ^3. Al mismo tiempo, gracias a la calibración precisa de la potencia del láser emitido, herramientas ópticas lograr ya sea suave o manipulación de la muestra invasiva con una reproducibilidad sin precedentes.

Varios laboratorios integrados, en la misma configuración experimental, pinzas ópticas y disector de láser con el fin de realizar la ablación orgánulos ^4, se fusionen entre sí diferentes células ^5, o para estimular las células por impulsado ópticamente cargas ^6,7. Si bien las pinzas ópticas, después de la calibración de la rigidez óptica, permitenel control de la fuerza aplicada a la celda en una escala picoNewton, sistemas de disección láser puede modular la manipulación óptica, que se extiende desde la membrana foto-poración a la ablación de orgánulos individuales o disección de las estructuras subcelulares. Sin embargo, la calibración de la disección con láser se basa en la evaluación cualitativa de la entidad de manipulación óptica con respecto a la energía entregada a la muestra, basado principalmente en el análisis de imagen que ilustra los cambios morfológicos causados ​​a la muestra ^8. En el método presentado, nos demuestran cómo realizar mediciones de espectroscopia de fuerza durante la disección láser axonal de las neuronas en desarrollo, para cuantificar, en la escala picoNewton, la fuerza producida por una alteración del equilibrio en la estructura del citoesqueleto de un compartimiento subcelular ^9. Neuronas cultivadas se adhieren al sustrato, y polarizan durante el desarrollo. La fase de polarización se produce durante los primeros cinco días in vitro. En la etapa dos de polarización, una de las extruidoción neuritas se hace más largo, y se diferencian para convertirse en el axón ^10. Elongación axonal en respuesta a la fuerza de tracción en el cono de crecimiento se ha modelado previamente por el modelo de Dennerl ^11. Recientemente, este modelo se ha ampliado para incluir ¹² el papel de la adhesión de neuritas a los sustratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, propuesto después de observaciones experimentales ^13, mostró que fuerzas de tracción en el cono de crecimiento, la propagación a lo largo de la neurita, son moduladas por las adhesiones focales al sustrato. Del mismo modo, lesión axonal produce una liberación local de la propagación de la tensión hacia el cuerpo de la célula. Por lo tanto, se propuso que la medición de tal tensión liberada en un lugar a lo largo del axón entre la lesión y el soma celular ofrece la posibilidad de evaluar el resultado de amortiguación de las adhesiones focales no afectadas.

Calibramos la energía necesaria fotón de flujo del disector de láser para controlar la extensión de la damag axonal infligidae, de transección completa a lesión parcial. Después de la calibración, se repitió lesión parcial a los axones de varias diferenciación de las neuronas y el protocolo desarrollado para cuantificar la liberación de la tensión, y por lo tanto obtuvimos un parámetro cuantitativo para estimar la adherencia del axón al sustrato ^14.

En el presente trabajo se describe en detalle el protocolo desarrollado, lo que representa un procedimiento experimental precisa para evaluar y comparar con la sensibilidad picoNewton la adhesión axonal al sustrato en diferentes condiciones experimentales, tales como el tratamiento químico ^14, o diferentes tipos de soporte de cultivo celular.

Protocolo

1. Configuración óptica

El sistema óptico entero fue descrito anteriormente ^15. En pocas palabras, el sistema de pinzas ópticas se basa en una onda continua de iterbio (CW) de fibra láser que opera a 1.064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulador espacial de luz (SLM) (LCOS-SLM, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varía la fase de la entrada del haz láser IR para controlar la posición del punto de enfoque de captura en la placa de cultivo por ordenador hologramas generados. Los Blue-pinzas de software (enlace web en la mesa de los equipos) hologramas generados libremente disponibles proyectados en el modulador espacial de luz. El interferómetro de medidas de espectroscopia de fuerza se basaba en un fotodiodo de cuatro cuadrantes (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) y un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La fuente de la disección láser fue un pulso sub-nanosegundo UV Nd: YAG a 355 nm (PNV-001525-040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acústico-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílice fusionados-AA-opto-electrónica) controla la potencia del láser UV entregado a la muestra.

El holográfica pinzas ópticas y láser micro-disector se integraron en un microscopio vertical modificado (BX51 - Olympus) equipado con un 60X, 0,9 NA etapa de la inmersión en agua objective.The del microscopio se compone de un eje lineal 3-motor de corriente continua de micro-posicionamiento sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) que lleva una etapa de nano-posicionamiento piezoeléctrico 3-eje por separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar el movimiento grueso de la muestra con una resolución sub-nanométrica del piezo- etapa. El sistema de platina del microscopio estaba equipado con dos lazos de control que actúa sinérgicamente para mantener el punto de enfoque de captura en la posición correcta, en función del modo de trabajo seleccionado (posición o fuerza de sujeción, estática o dinámica) ^16. En particular, un circuito de retroalimentación interna actúa en una etapa piezoeléctrico, para mantener el talón en un selectoed distancia desde el centro de la trampa. El otro bucle externo controla la posición de la platina motorizada para explotar la región abarcada por el piezo-actuador en un área más grande que su carrera disponible ^17. Cuando la etapa de piezo-alcanza el límite de la carrera disponible en una dirección, el bucle externo se mueve la etapa de micro en la dirección opuesta, por lo tanto el piezoeléctrico se recupera hacia su posición central porque es el seguimiento de la perla atrapado adherido a la muestra. Cuando la etapa de piezo-llega a la posición central de su gama supuesto, la etapa de micro detuvo. Otros detalles del sistema se presentan en la Guiggiani et al ^16,17.

Un dispositivo Peltier (QE1 calentamiento resistivo calentador con controlador de doble canal TC-344B - Warner Instruments) controla la temperatura del cultivo celular bajo el microscopio (37 ° C). En el cultivo, el pH y la humedad se mantuvieron en condiciones fisiológicas aireando un polidimetil de diseño personalizadosiloxano (PDMS) manga (integrando el objetivo del microscopio) con carbógeno humidificado (95% O _2, 5% de CO _2).

2. Cultivo de células Preparación

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano. Los cultivos primarios se obtuvieron de hipocampo de los ratones (C57BL6J, Charles River) en el día embrionario 18 (E18).

1. Las neuronas se sembraron en placas a una concentración de 25.000 células / ml en el fondo de cristal placas de Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). Se necesita la baja concentración de células en cultivo para evitar la formación de una densa red ya en los primeros días in vitro. A la concentración celular se ha mencionado, la probabilidad de encontrar células aisladas con una neuritas ya no está conectado a otras células es mucho más alto.

3. Revestimiento de bolas

1. Microesferas de polímero (Ø 4 m, COOH-terminal-Bangs Laboratories, código de producto PC05N/6700) fueron recubiertas con poli-D-lisina siguiendo el procedimiento descrito en el Kit de acoplamiento de proteínas polyLink (Polysciences, código de producto 19539). Las perlas se recubren con la misma molécula utilizada para cubrir el soporte de cultivo y las células favor adherencia.

4. Elija neurona aislada. Separe un cordón del sustrato Cultura, Trampa y Muévete Junto a la neurona

1. Ponga la cultura placa de Petri en la platina del microscopio. Después de fijar la atención en la muestra por el movimiento etapa, corregir la posición del condensador objetivo esclarecedor establecer Kohler-iluminación. La alineación de la óptica de iluminación para establecer la condición Kolher-iluminación es necesaria para mejorar la calidad de la imagen de campo claro. El uso de tales condiciones de alineación, sino que también es necesaria para maximizar la eficiencia de recolección láser IR (a través del condensador objetivo), de la sonda atrapado dispersión, para llevar a cabo su seguimiento interferométrico por el QPD y PD.
2. Pipetear unos pocos l de la solución madre de microesferas recubierto ena la placa de cultivo. Las microesferas se depositará y se adhieren al sustrato de cultivo. El número de l inyectada en la placa de cultivo depende de la concentración de microesferas de la solución madre. La condición ideal es tener entre uno y dos microesferas por campo de la imagen de vista. Cuando demasiados microesferas se añaden a la placa de cultivo, que ya pueden adjuntar al azar a las neuronas cultivadas.
3. Desplazamiento en la placa de cultivo, en busca de una neurona aislada con neuritas más larga (el axón) y guardar la posición de la platina del microscopio.
4. Moverse y buscar un cordón adherido al soporte de cultivo.
5. Encienda el láser captura IR. En esta etapa, no hay hologramas se proyectan en el MST, y la posición del punto de láser IR coincide con la posición de la mancha láser UV. Ajuste la posición axial de la mancha IR 2-3 m por encima de la superficie de soporte de cultivo, por el movimiento de platina del microscopio.
6. Establecer la potencia del láser UV entregado a la muestra a menos de 1 mW. LaUV láser disector ha sido calibrado previamente ^14:
   5-6 mW el soporte de vidrio es destruida
   4 mW una conexión neuronal se diseca completamente
   2,5 mW de neuritas se lesionó parcialmente
   <1 mW una onda de choque se produce en la placa de cultivo. La onda de choque óptica es lo suficientemente fuerte como para separar el talón desde el soporte de vidrio.
7. Encienda el láser UV, mientras que deja el láser IR, y mover el punto de UV por encima del cordón adherido al movimiento de platina del microscopio. Los separa del grano de la superficie, y es atrapada por el láser IR. A continuación, apague el láser UV.
8. Mueva las cuentas atrapados varios micrómetros por encima del soporte de vidrio (20-30 micras). El levantamiento del talón a esta posición evitará que entre en contacto con otras células, mientras que se está moviendo hacia la neurona previamente elegido. Lleve la cuenta de la posición de fase guardado anteriormente. Ajuste la velocidad de fase a un valor bajo (10 m / seg) por lo que la fuerza del fluido de arrastre no exceda de la trampa ópticafuerza de ping.

5. Mueva la Trampa posición con respecto al punto Dissector Laser y Axon Posición por ordenador holograma generado y calibrar la rigidez Pinzas Ópticas

1. Mueva el talón hacia el soporte de vidrio para visualizar el axón. El talón se mantiene por encima de la celda para evitar el contacto con él (cerca de 5 m por encima del soporte de vidrio).
2. Mover la platina del microscopio para mover el punto de enfoque UV en el centro de la anchura del axón. Guardar la posición actual etapa.
3. Mover el enfoque posición al contado IR por holograma generado por computadora. En este paso, la etapa se detiene en la posición elegida en el paso anterior. Cuando se proyecta el holograma generado por ordenador en el SLM, el cordón atrapado se mueve con respecto al axón. Nos mover el punto del láser IR tener el talón atrapado alineada en el centro de la neurita, con el punto de láser UV centrado en la misma neuritas demasiado. El punto de IR y por lo tanto el talón atrapados están colocados a lo largo de los axones5-10 m de distancia de la mancha UV. Movemos la posición del IR con respecto a la tinta UV en función de la geometría de las neuritas. En el caso de las pinzas ópticas no están equipados con un sistema de SLM, la posición puede ser variada por los espejos basculantes, o deflectores acústicos, ópticos en la trayectoria óptica IR. El punto de láser IR puede estar situado 5-10 micras de distancia desde el punto de UV para evitar la interacción óptica del haz de disección con la sonda atrapada, lo que podría influir en su movimiento browniano y alterar los rastros de espectroscopia de fuerza.
4. Después de definir la nueva posición al contado IR con respecto al punto de UV y la posición del axón, mover el escenario para colocar la bola atrapado lejos del axón y evitar la colisión con él. Mover la posición axial de la perla atrapado a aproximadamente 2 micras por encima de la cubierta de vidrio.
5. Alinear el QPD al centro de las franjas de interferencia en él: las señales de diferencial y QPD x y son ceros cuando se centra la QPD. Adquirir 5 segundos del movimiento browniano de la perla atrapado por el interferometro, a 50 KHz de frecuencia de muestreo. Obtener la rigidez (pN / nm) y sensibilidad (V / nm) de la trampa óptica por el método de espectro de potencia ^18.

6. Conecte el grano a la Axon. Realizar Medición Fuerza Axotomía y simultánea

1. Elevar la posición del grano atrapado a unos 4 m por encima de la cubierta de vidrio, y moverlo a la posición de fase guardado previamente (véase el paso 3.2).
2. Mueva el talón hacia abajo atrapado hacia el axón hasta que haga contacto con la neuritas. La colisión entre el talón atrapado y el axón se controla por la señal de QPD z detección de desplazamiento de la bola atrapado en la dirección axial.
3. Espere 10 segundos con el talón atrapado empujado contra el axón para favorecer su adherencia a la membrana de neuritas.
4. Mover la etapa de micro para desplazar el talón atrapado desde el axón, y por lo tanto verificar su adhesión a la membrana celular. Si el cordón adherido, se escapa de la trampa óptica.
5. Retrocede la trampa láser en el cordón adheridoy active el circuito de fuerza con abrazadera condiciones fuerza igual a cero. De tal manera, los piezo-reposiciona la etapa de talón, que se adjunta a la célula, en el centro de la trampa óptica. Si el sistema no tiene un control de retroalimentación, la posición de la trampa láser puede ser movido por la platina del microscopio para centrarla en la sonda adherida. El centro de la trampa se alcanza cuando las señales QPD son los mismos que cuando la perla está atrapado y no se adhirió a la célula (x y las señales de QPD y igual a cero, y la señal de QPD z da el mismo voltaje suma de los cuatro cuadrantes como cuando la perla está atrapado lejos de cualquier superficie).
6. Establecer una condición de fuerza-abrazadera en el eje z, el posicionamiento del láser captura ligeramente sobre el centro de la perla (aproximadamente 100 nm), para generar una pretensión en la sonda atrapado adherido. En caso de que el sistema no está equipado con un control de la fuerza-abrazadera, la posición de trampa óptica puede ser levantado en pasos de 25 nm por la platina del microscopio. La señal z QPD permite monitorizar. Por lo tanto, utilizar this señal para establecer la posición de la trampa láser con respecto a la sonda adherida. Este tipo es necesario pre-tensión para detectar la tensión en la membrana después de la lesión axonal, y la consiguiente disminución del movimiento browniano de la sonda adherido. Un enfoque similar se ha propuesto para la medición de la liberación de la tensión en una correa de sujeción de membrana por imágenes de vídeo ^19.
7. De desconexión de la regeneración de la fuerza de pinza para medir la fuerza en la sonda adherido en la condición de posición-abrazadera (la-etapa piezoeléctrico está bloqueado).
8. Inicio de la grabación simultánea de las posiciones de la sonda atrapados a través del interferómetro (20 kHz frecuencia de muestreo), y la célula durante láser axotomía de lapso de tiempo de imágenes de campo brillante (velocidad de cuadro 20 Hz).
9. Encienda el láser UV para entregar pulsos láser hasta que la lesión se hace visible en la imagen del axón (Por lo general se necesitan 200 a 400 pulsos ópticos de energía por pulso:. 25 NJ), a continuación, apague el láser UV.
10. Continuar el registro por el interferómetro de aproximadamente 3 millasn, hasta que la x, y y z QPD trazas alcanzar una meseta.

7. Cuantificar la tensión de liberación total

1. Convertir las huellas QPD grabados (en voltios) por la sensibilidad calibrada de la trampa óptica, para obtener las respectivas huellas en nanómetros.
2. Se filtra la x, y, z y trazas de desplazamiento por un filtro de paso alto con corte a 10 Hz.
3. Calcular la varianza total de las huellas filtrados que representan el movimiento browniano de la perla atrapado. Calcular la varianza en 25 mseg para ventanas de tiempo de 500 milisegundos (10000 puntos de datos) ²⁰ superpuestas. El filtrado de trazas de paso alto excluye los cambios de movimiento browniano debido a la fluctuación de la membrana o el movimiento cortical de actina. El movimiento browniano de la perla se reduce por las fuerzas ópticas y las fuerzas de adhesión en la membrana celular. Cuando la membrana se tensa debido a la liberación de la tensión su viscosidad se incrementa, y por lo tanto el movimiento browniano de la perla, detecta inmediatamentemente después de axotomía, comienza a disminuir.
4. Definir t0: el comienzo de la disminución de la varianza movimiento browniano, después de la entrega de la energía láser UV. En el instante t0 de tiempo indica el comienzo de la cepa de la membrana.
5. Definir t1: el final de la disminución de la varianza movimiento browniano (cuando se alcanza una meseta). En el instante en el tiempo t1 indica el final de la cepa de la membrana.
6. Realizar el seguimiento de vídeo de escombros o un rasguño en la cubierta de soporte de vidrio, para medir cualquier deriva de la muestra durante la medición de la fuerza. Para el seguimiento de la partícula en el soporte de vidrio, que primero aplicamos umbrales para las imágenes de campo brillante, para obtener una pila de imágenes binarias con la partícula en blanco sobre un fondo negro. A continuación, hacemos un seguimiento del centro de partícula de masa con una precisión sub-pixel (utilizando el software ImageJ freeware).
7. Restar la deriva medida a partir de las huellas QPD de desplazamiento. Multiplicar las huellas QPD deriva corregidos por el respectivo rigidez óptica calibrada (k _x, k _{y, z k) para obtener los Fx, Fy, Fz huellas en piconewtons.}
8. Calcular la huella total de la fuerza como F _tot = √ (Fx ^​​2 + ² + Fy Fz ^2).
9. Calcular la liberación total de la fuerza entre t0 y t1 como F = F _{lanzado tot} (t1) - F _tot (t0). La fuerza medida en t0 tiene que ser restado porque es debido al desplazamiento de la sonda desde el centro de la trampa, cuando las cuentas se adhiere a la neuritas.
10. Calcular el área de contacto entre el talón neuritas atrapado y la posición del punto láser UV: en la medida de campo claro la imagen de los ejes longitudinales (L) y cortas (D) de los axones entre el talón atrapados y la posición del punto láser UV. El área de contacto axón es un _axón = L x D.
11. Normalizar la fuerza F lanzado _total liberada por el área de contacto axón Un _axón.

Resultados

La célula genera fuerzas de tracción sobre el sustrato mediante sus adhesiones focales. Fuerza generada por los elementos del citoesqueleto están en equilibrio con la fuerza que contrarresta del sustrato de cultivo. Después de la lesión inducida por láser de la neurita, algunos de los cables tensados ​​citoesqueleto se interrumpen y su tensión equilibrada se libera porque se elimina la fuerza de oposición de la adhesión sustrato. La tensión liberada se distribuye parcialmente en las adhesiones focales no a...

Discusión

Se presenta en este trabajo un método cuantitativo para comparar la adhesión de neuritas al sustrato de la cultura, mediante la realización de mediciones de espectroscopia de fuerza simultánea durante la lesión celular inducida por láser. La liberación de la tensión medida está relacionada con el grado de adhesión de la célula al sustrato: células con un mayor número de adhesiones focales deben liberar menos tensión. La medición de la liberación de la tensión en términos de piconewtons proporciona una ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop